方亞坤 周配++張磊++趙不思 +劉宇鵬

摘要：利用平板顯色法，從腐爛的水果中篩選出1株能夠轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)生甘油酸的菌株。根據(jù)生理生化、形態(tài)學(xué)鑒定以及16S rDNA基因序列結(jié)果的分析，確定該菌株的生物學(xué)分類地位。該菌株屬于醋酸桿菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus），將其命名為HD1025。初步發(fā)酵試驗(yàn)表明，該菌株能夠以 150 g/L 甘油為底物生產(chǎn)49.47 g/L的甘油酸。

關(guān)鍵詞：甘油酸；甘油；生理生化；醋酸桿菌；平板顯色法

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0224-03

甘油酸（2，3-二羥基丙酸）存在于自然界各種各樣的植物中，它作為一種中間代謝物同樣也存在于人體內(nèi)。甘油酸及甘油酸的衍生物具有很多生物學(xué)功能：在人體內(nèi)D-甘油酸能使胃部細(xì)胞在一定劑量乙醇刺激后增強(qiáng)活力從而促進(jìn)乙醇分解代謝，因此它可以作為解酒藥成分[1]；據(jù)報(bào)道，在狗體內(nèi)的甘油酸具有膽固醇活性和肝興奮劑的功能，甘油酸衍生的酯類低聚物能表現(xiàn)出抗胰蛋白酶活性[2]。同時(shí)，甘油酸由于自身生物可降解性優(yōu)于其他的一些高聚物，可用作藥物的運(yùn)輸載體。在食品方面，甘油酸同樣具有很多用途。

甘油酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物法2種，目前市場(chǎng)上銷售的甘油酸大部分是通過(guò)化學(xué)方法生產(chǎn)而來(lái)的，化學(xué)方法與生物法相比，具有成本高、耗能大、產(chǎn)量低并且不具有立體選擇性等缺點(diǎn)。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘油酸，環(huán)境溫和、產(chǎn)量高、方法簡(jiǎn)便而且產(chǎn)物具有立體選擇性，因此被廣泛關(guān)注。但是，目前國(guó)外關(guān)于生產(chǎn)甘油酸菌株的報(bào)道較少，1987年日本報(bào)道泰國(guó)葡萄糖酸桿菌Gluconobacter thailandicus NBRC 3172、氧化葡萄糖酸桿菌G. oxydans NBRC 3292、氧化葡萄糖酸桿菌G. oxydans NBRC 3294、弗拉托葡萄糖酸桿菌G. frateurii NBRC 3262生產(chǎn)甘油酸產(chǎn)量分別為27.2、36.0、32.6、57.2 g/L[3-5]。Sato等報(bào)道利用熱帶醋酸桿菌Acetobacter tropicalis NBRC 16470、弗拉托葡萄糖酸桿菌G. frateurii NBRC 103465等菌株生產(chǎn)甘油酸，其中部分菌株產(chǎn)量可達(dá)100 g/L以上[6]。然而，到目前為止國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有關(guān)甘油酸發(fā)酵方面的報(bào)道。

本研究在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道從腐爛的水果中篩選到1株能夠利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)甘油酸的菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及16S rDNA基因序列分析，確定它屬于醋酸桿菌科葡萄糖酸桿菌屬，將其命名為HD1025。

1材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

1.1.1菌株

日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus） HD1025由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從腐爛的水果中分離獲得。

1.1.2培養(yǎng)基

平板篩選培養(yǎng)基：甘油15%、蛋白胨 0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、溴甲酚紫0.05%、瓊脂2%，pH值6.5～7.0。

斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、瓊脂2%，pH值6.5～7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值6.5～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油15%、蛋白胨0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 2%，pH值6.5～7.0。

上述培養(yǎng)基中種子培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基是在115 ℃下滅菌30 min，篩選培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min。每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)，取平均值并計(jì)算誤差。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：400 r/min，裝液量為3 L，通氣量為 1 L/（L·min），30 ℃。

1.2菌株的分離與篩選

在河南省開(kāi)封市區(qū)內(nèi)取樣，樣品包括污水、淤泥、腐爛的水果和蔬菜、地表土樣、蜂蜜等。將取得的樣品粉碎，取10 g樣品加入到90 mL無(wú)菌水中，在搖床中振蕩1 h。取菌懸浮液，稀釋成一系列濃度梯度。取10-5、10-6、10-7等3個(gè)梯度0.2 mL懸浮液涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d。挑取菌落周圍培養(yǎng)基顏色由紫色變成黃色的菌株，分別接種于斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，220 r/min、[JP+1]30 ℃，好氧培養(yǎng)72 h。取72 h后的發(fā)酵液，測(cè)定甘油酸含量。選取初篩產(chǎn)量較高的菌株接種在發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)條件和初篩相同。取72 h發(fā)酵液測(cè)定甘油酸和殘留的甘油含量。選取甘油酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行斜面保存，進(jìn)行下步試驗(yàn)。[JP]

1.3分析測(cè)定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）測(cè)定發(fā)酵液中甘油酸、甘油含量[7-8]。

檢測(cè)條件：1515泵、2489紫外檢測(cè)器（檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm）、2414示差檢測(cè)器、1500柱溫箱、2707自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜柱型號(hào)：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）；柱溫60 ℃；流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4、20%乙腈；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.4菌種鑒定

1.4.1細(xì)胞形態(tài)特征

菌落形態(tài)觀察：取試管斜面上的菌體平板劃線制備單菌落，挑取單菌落接在種子培養(yǎng)基上，30 ℃搖瓶好氧培養(yǎng)24 h，取種子培養(yǎng)液梯度稀釋至合適倍數(shù)后，將稀釋液涂布于平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d得到單菌落，觀察菌落外形及特征。

掃描電鏡觀察：取試管斜面上的菌體平板劃線制備單菌落，挑取單菌落樣品制成菌懸液然后制片，制作方法如下：（1）將菌液在6 000 r/min下離心6 min后，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次；（2）將菌體經(jīng)火焰固定于蓋玻片上；（3）將蓋玻片置于盛有2.5%戊二醛溶液的染盆中，固定1.5 h；（4）取出蓋玻片用乙醇（30%、50%、70%、90%、100%，依次脫水15 min；（5）噴金儀中噴金；（6）掃描電鏡觀察及拍照。

1.4.2生理生化特征鑒定

根據(jù)《伯杰氏手冊(cè)》《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，選取幾種特征性生理生化項(xiàng)目進(jìn)行鑒定[9-10]。

1.4.316S rDNA基因序列分析

委托寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序；在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索 GenBank 中相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列，下載同源性最高的序列，用BioEdit 7.0軟件編輯后再使用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌的分類地位。

1.5遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用群體傳代的方法，傳接10代后，檢測(cè)搖瓶發(fā)酵液中甘油酸的含量，與第1代相比，觀察菌株發(fā)酵性能的變化，確定遺傳穩(wěn)定性，是否適用于工業(yè)生產(chǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1甘油酸產(chǎn)生菌株的分離和篩選

按照“1.2”節(jié)的方法采集樣品分離純化菌株，根據(jù)“1.3”節(jié)的檢測(cè)方法，檢測(cè)發(fā)酵液中甘油酸的含量。初步分離共得到25株能夠氧化甘油產(chǎn)生甘油酸形態(tài)各異的菌株，不同菌株形成的變色圈大小不同，初步表明它們產(chǎn)酸能力的大小，再利用搖瓶發(fā)酵對(duì)25株菌株進(jìn)行復(fù)篩。檢測(cè)發(fā)酵液中產(chǎn)物甘油酸、副產(chǎn)物二羥基丙酮和剩余底物甘油的含量。在腐爛的水果中篩選出1株產(chǎn)量較高的菌株，其產(chǎn)量初步發(fā)酵達(dá)到2203 g/L，將其命名為HD1025。

2.2培養(yǎng)特征和形態(tài)觀察[HT]

按照“1.4.1”節(jié)的方法，將菌懸液涂布于篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4～5 d，菌落的培養(yǎng)特征：菌落較小，濕潤(rùn)，圓形，不透明，白色，直徑可達(dá)0.5～1.0 cm（圖1）。掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征：細(xì)胞呈短圓桿狀，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。

2.3生理生化鑒定

由表1中HD1025菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶、還原硝酸鹽、液化明膠、產(chǎn)吲哚、氧化乙醇到乙酸、氧化乙酸鹽生成長(zhǎng)CO2和H2O、多醇類生酮、水解淀粉、D-木糖產(chǎn)酸、D-葡萄糖產(chǎn)酸等屬間特征生理生化反應(yīng)結(jié)果鑒定該菌株屬于葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter），根據(jù)形成5-酮基葡萄糖酸、[JP+1]甘油產(chǎn)甘油酸、利用D-阿拉伯糖醇生長(zhǎng)、利用赤蘚糖醇生長(zhǎng)等種間生理生化特性鑒定該菌株與弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）存在一定的區(qū)別，與日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）類似[11-14]。[JP]

2.4基因序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過(guò)對(duì)HD1025的16S rDNA基因測(cè)序，獲得1 398 bp長(zhǎng)度的基因序列，將該序列提交GenBank（登記號(hào)為KT964237），對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析，然后采用BioEdit 7.0軟件編輯后再使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析。由圖3可知，HD1025與日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）（相似度100%）和弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）（相似度99.86%）的親緣關(guān)系較近，然而試驗(yàn)表明，HD1025與弗拉托葡萄糖酸桿菌菌株在部分生理生化試驗(yàn)上仍有不同，而與日本葡萄糖酸桿菌親緣關(guān)系最接近。因而，最終將該菌種確定為日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus），擬將該菌株命名為2.6菌株G. japonicus HD1025發(fā)酵罐發(fā)酵曲線

在“1.1.2”節(jié)給出的條件將菌株HD1025發(fā)酵72 h，甘油酸產(chǎn)量達(dá)到49.47 g/L，殘余底物含量為 92.22 g/L（圖4）。

3討論

目前，國(guó)外關(guān)于微生物法生產(chǎn)甘油酸報(bào)道較多的是弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）、弱氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter suboxydans）、氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）等菌株，其中弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）[CM（18]菌株產(chǎn)甘油酸的能力較強(qiáng)，但在生產(chǎn)甘油

酸的過(guò)程中會(huì)受到底物甘油的抑制。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有利用日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）菌株進(jìn)行甘油酸生產(chǎn)的報(bào)道。

本試驗(yàn)從腐爛水果中篩選出1株能夠氧化甘油生產(chǎn)甘油酸的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA基因序列分析，將該菌株命名為日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）。該菌株可以耐高濃度甘油，在150 g/L的初始甘油濃度下生長(zhǎng)良好。該菌株分批發(fā)酵72 h可產(chǎn)甘油酸 49.47 g/L，預(yù)計(jì)經(jīng)菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化后甘油酸的產(chǎn)量會(huì)有較大的提升，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

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