鄧迎春 柳青 黃強

(復旦大學生命科學學院，上海200438)

禽流感病毒HA蛋白與人受體的分子對接

鄧迎春 柳青 黃強*

(復旦大學生命科學學院，上海200438)

血凝素(hemagg lutinin，HA)是位于禽流感病毒表面的糖蛋白。在病毒感染過程中，HA與禽類宿主細胞表面受體結合，介導病毒膜與宿主核內(nèi)體膜的融合，在傳染過程中發(fā)揮關鍵作用。自然界中的禽流感病毒處于不斷演化之中，其HA的禽受體結合位點常常發(fā)生氨基酸變異。因此，當HA變異體與人受體結合能力較強時，禽流感病毒往往會發(fā)生跨種傳播而感染人。為預防禽流感的跨種傳播，人們迫切需要發(fā)展大規(guī)模快速檢測或預測HA變異體與人受體結合親和力的方法，以評估各種新發(fā)禽流感病毒的跨種傳播能力，提前篩選出有潛在危險的病毒株。針對此問題，本研究以H7N9亞型的HA蛋白H7為研究對象，發(fā)展了一種運用分子對接的計算方法，預測HA變異體與人受體的結合親和力。該方法的計算結果表明，H7與人受體的結合親和力普遍弱于有較強傳染人能力的H1，說明H7N9亞型病毒的跨種傳播能力普遍較弱；但是，計算分析也揭示，部分新發(fā)的H7N9毒株的HA有強的人受體結合親和力，提示在自然演化過程中，H7N9病毒有可能演化出具有較強的感染人能力的新毒株，這與2013年禽流感疫情的實際發(fā)生情況相一致。因此，本文所發(fā)展的計算方法可用于快速預測新發(fā)禽流感病毒HA與人受體的結合親和力，為新發(fā)禽流感病毒的跨種傳播風險評估提供理論依據(jù)。

禽流感病毒；跨種傳播；受體結合特異性；分子對接；結合自由能

1 引言

禽流感是一種由禽流感病毒引起的鳥禽類傳染病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，禽流感主要在禽類中流行。但是，當禽流感病毒的基因組發(fā)生一定變異后，病毒會發(fā)生跨種傳播而感染人，甚至引發(fā)人類流感大流行。例如，1918年H1N1西班牙流感、1957年H2N2亞洲流感、1968年H3N2香港流感、1977年H1N1墨西哥流感和2009年H1N1豬流感1－5。其中最嚴重的1918年流感造成的死亡人數(shù)達五千萬6。因此，對禽流感病毒跨種傳播機制的研究，有助于更好地對禽流感進行防控。

血凝素(HA)蛋白是禽流感病毒表面的一種糖蛋白。其在病毒感染宿主細胞過程中發(fā)揮關鍵作用：與宿主細胞表面糖蛋白末端的特異性糖鏈結合，介導病毒膜與宿主核內(nèi)體膜的融合7。HA蛋白是由HA 1鏈和HA 2鏈組成的三聚體。HA蛋白可被分為兩個結構域(圖1)：遠離病毒外膜的球狀結構域和靠近外膜的莖狀結構域。受體結合域位于球狀結構域的頂端。它狀如淺口袋，邊緣是3個二級結構單元：130環(huán)(130-loop)、190螺旋(190-helix)、220環(huán)(220-loop)(H3亞型氨基酸序號)；底部是4個保守氨基酸(Y98，W 153，H183，Y195，H3亞型氨基酸序號)7。

HA蛋白結合域一般與禽受體a2,3唾液酸(a2,3 term inal SIA，SAa2,3Gal)結合。但是，當HA蛋白基因組發(fā)生變異后，HA可能與人受體a2,6唾液酸(a2,6 term inal SIA，SAa2,6Gal)結合。病毒因此發(fā)生跨種傳播而感染人。HA蛋白受體結合特異性的轉換是病毒產(chǎn)生人適應性的關鍵特性之一7。HA蛋白受體結合特異性極大地影響禽流感病毒的宿主范圍8。HA受體結合特異性從禽受體轉為人受體，是出現(xiàn)致疫情病毒的先決條件9。HA蛋白一兩個氨基酸置換突變就足以導致這種轉換9,10。H1的E190D/G225D突變，H2/H3的Q226L/G228S突變，H7N9的Q226L/I、G186V突變都導致了其受體結合特異性的轉換9,11－14。突變可能使HA蛋白與人受體之間相互作用發(fā)生改變。突變后人受體糖環(huán)能與H1第190位D和225位D之間形成氫鍵15,16。突變后H2/H3第226位L創(chuàng)造一個疏水的環(huán)境使HA與帶C6疏水原子的人受體結合；第228位S與人受體末端SA1形成氫鍵17,18。

圖1 HA蛋白和人受體類似物結構圖Fig.1 Structuresof HA and LSTc(a)HA(PDB code:4JTV);(b)human-like receptoranalogue(LSTc)

目前人們主要通過實驗方法和理論計算方法來檢測禽流感病毒HA與人受體的相互作用。實驗方法能較為準確地分析病毒株與人受體的結合能力19,20。但是，自然界中的禽流感病毒多樣性豐富，變異頻率高，不斷有新的毒株產(chǎn)生，使用實驗方法分析每一毒株的結合能力有一定難度。所以，能進行大規(guī)?？焖兕A測的理論計算方法是實驗手段的有力補充。通過預測方法的前期計算篩選，可以有效地縮小需進一步實驗分析的病毒株數(shù)目。而且，隨著二代測序的應用，人們可以快速地獲得HA蛋白的氨基酸序列。所以，是否可以發(fā)展一種從氨基酸序列出發(fā)構建HA三維結構模型，快速預測HA蛋白與人受體結合能力的理論計算方法，以便人們可以有效地發(fā)現(xiàn)危險毒株？針對此問題，本文發(fā)展了一種計算預測方法，通過分子對接來計算H7亞型病毒的HA與LSTc的相互作用，預測病毒HA與人受體的結合能力，分析其與人受體的結合特異性，以快速地預測新發(fā)禽流感病毒感染人的潛力。

2 計算方法

2.1 分子對接系統(tǒng)的構建

本文選擇了H1和H7禽流感病毒亞型的HA蛋白作為研究對象。我們從蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)下載了H1和部分H7的HA蛋白晶體結構，對HA蛋白晶體結構進行去水去雜原子處理，對只有單亞基的晶體結構運用PyMOL對稱性命令構建三聚體，對亞基個數(shù)超過3的晶體結構刪除多余的亞基，獲得HA蛋白的標準三聚體模型；從GISAID數(shù)據(jù)庫(http://platform.gisaid.org/)和GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載了部分H7N9亞型HA蛋白的氨基酸序列，然后通過同源建模方法21構建HA蛋白的三維結構模型。共獲得12個H1晶體結構、37種H7N9毒株HA蛋白的三維結構模型、2種H7N9毒株HA蛋白晶體結構和1種H7野生毒株晶體結構(見Supporting Information表S1)。

為構建精細準確的對接系統(tǒng)，本研究的H1，以H1與LSTc的復合物晶體結構4JTV為參考；從4JTV中分離出C鏈的人受體類似物LSTc，作為后續(xù)構建對接系統(tǒng)的配體，其余H1蛋白通過PyMOL軟件被align到4JTV的坐標體系中，另存H1蛋白于4JTV坐標體系中，因此配體LSTc位于蛋白質(zhì)受體結合域。以此方法構建H1亞型的分子對接系統(tǒng)。H7以A/Anhui/01/2013(PDB code：4BSE)為參考構建分子對接系統(tǒng)。

2.2 分子對接

AutoDock程序在生物分子復合物的結構和功能分析及分子設計方面被廣泛地用以預測22－24。本研究使用了AutoDock4.224進行分子對接研究。以禽流感病毒的HA蛋白為受體，LSTc為配體構建分子對接系統(tǒng)。由于在建模配體－蛋白相互作用中，水的表現(xiàn)和角色非常重要25，加水對接能明顯地提高對接的能量估計精度和對接性能25，我們在對接中給配體加了水，模擬配體分子在水環(huán)境中與受體結合的過程。對接參數(shù)設置為，配體可旋轉鍵12個；將LSTc中唾液酸C8原子坐標設為格子中心；格子大小設置為X，Y，Z：80，80，80；對接次數(shù)為2000，每個蛋白對接模擬2000次，其它參數(shù)為系統(tǒng)默認。對接結束后對于每個蛋白我們將獲得配體的2000個不同構象與HA蛋白的結合自由能。結合構象和結合自由能將作為后續(xù)處理和分析的依據(jù)。分子對接流程見圖2。

3 結果與討論

3.1 最低結合自由能分析

本文選擇的H1毒株與人受體的結合能力都很強15－17,26－28。以3UBE15為例，它是引發(fā)2009年H1N1流感的毒株A/California/04/2009的晶體結構。H1N1曾導致多次全球疫情大流行，死亡人數(shù)眾多。它在人與人之間傳播的效率證明2009H1N1完全適應了在人與人之間傳播29,30。糖微陣列研究和ELISA實驗表明人型H1N1只與SAa2,6Gal結合，幾乎不與SAa2,3Gal結合15，具有很強的人受體偏好性。本文選擇的39個H7N9毒株是從Lam等31的文章附錄文件中選擇的，我們盡量在附錄中選擇傳人的毒株來做分子對接。野生型H7毒株A/ turkey/Italy/214845/2002(H7N3)(PDB code:4BSI)13不感染人。

圖2 HA蛋白變異體組的分子對接流程圖Fig.2 M olecu lar dock ing flow chart of HA variants

我們將39種H7N9對接后的最低結合自由能列于表1。我們發(fā)現(xiàn)39種H7N9毒株的最低結合自由能在－53.3至－43.8 kJ·mol－1之間。較高結合自由能的毒株有A/Nanjing/5/2013，A/Jiangsu/09/2013等，較低結合自由能的毒株有A/Guangdong/05/ 2013，A/Hong Kong/734/2014等。最高能量毒株為A/Nanjing/5/2013，其最低結合自由能為－43.8 kJ· mol－1，最低能量毒株是A/Guangdong/05/2013，其最低結合自由能為－53.3 kJ·mol－1。H1N1亞型A/ California/04/2009(3UBE)毒株的最低結合自由能為－51.2 kJ·mol－1。而39種H7N9毒株中，有12/39約31%的毒株最低結合自由能大于－46.1 kJ· mol－1，大部分25/39約64%的毒株的最低結合自由能在－50.2至－46.1 kJ·mol－1之間，僅有2/39約5%小于－50.2 kJ·mol－1。H7N9病毒的HA與人受體的結合親和力普遍弱于有較強傳染人能力的H1N1，說明H7N9亞型病毒的跨種傳播能力普遍較弱。但是有些H7N9中毒株的最低結合自由能接近H1N1，表明H7N9在進化過程中可能會演化出感染人能力較強的毒株，值得注意。在文獻14中確認的8種致死毒株中，6/8約75%的最低結合自由能小于等于－46.1 kJ·mol－1(表2)。野生型H7的最低結合自由能較高，為－46.7 kJ·mol－1。

3.2 構象分類

由于人受體末端糖環(huán)SA1與HA結合域底部保守氨基酸153W之間有范德華力7。而糖環(huán)GlcNAc3一端連接著宿主糖蛋白，不太可能與153W靠得太近。所以合理構象中HA蛋白的153W殘基離SA1距離近，離GlcNAc3遠。我們計算了HA 153W殘基CH2原子與SA1糖環(huán)C5原子的距離D_SIA，以及HA 153W殘基CH2原子與GlcNAc3糖環(huán)C1原子的距離D_NAG。以前者為橫坐標，后者為縱坐標，遍歷AutoDock結果中所有可能構象，以能量最低的構象顏色為紅，能量最高的構象顏色為藍，能量介于兩者之間的構象按能量高低做漸變色圖，見圖3(a)。經(jīng)計算，A/California/ 04/2009 HA和LSTc復合物晶體結構3UBE中D_SIA約為0.481 nm，D_NAG約為1.088 nm。因此我們舍棄了D_NAG小于0.8 nm的構象，這部分構象結合方向為無效結合方向。我們將這部分構象稱為無效構象，將D_NAG大于等于0.8 nm的構象稱為有效構象。文中后續(xù)處理對象皆為有效構象。以有效構象中結合自由能最低的構象為參考，計算其余有效構象與最低能量構象的均方根偏差(RMSD)。然后以每個構象的結合自由能為縱坐標，以每個構象與最低能量構象的RMSD為橫坐標，以最低能量顏色為紅，最高能量顏色為藍，中間能量構象顏色在紅和藍之間漸變，作HA蛋白對接的能量分布散點圖(energy distribution scatter diagram)，見圖3(b)。靠近最低結合自由能構象的點出現(xiàn)得越多，表明對接中出現(xiàn)低結合自由能的概率越大，此HA蛋白與人受體越容易結合，親和力越強。我們看到H1與人受體的結合能力強，其有很多構象在結合自由能和RMSD方面有接近能量最低的構象的趨勢。圖3(c)列舉了部分趨勢上接近最低能量的構象。能量小于－41.9 kJ· mol－1，RMSD小于0.4 nm的構象被列出?？梢钥吹浇Y合的可能構象有很多。

表1 H 7與LSTc的最低結合自由能Tab le1 Lowestbinding freeenergy of HA and LSTc

表2 8種致死的H7N9毒株HA的最低結合自由能Table2 The lowestbinding freeenergy of HA from 8 fatalH7N9 isolates

依據(jù)對接后的結合自由能和構象，我們對H7亞型的每一個HA蛋白作了對接能量分布散點圖。我們發(fā)現(xiàn)39種H7N9毒株中，文獻14中確定致死的8種毒株，有7種的能量變化和H1N1類似，分子對接預測正確率約為87.5%(圖4)。A/Shanghai/1/ 2013和A/Anhui/1/2013是H7N9剛爆發(fā)時的毒株，已有結晶結構。其中對A/Anhui/1/2013毒株的研究發(fā)現(xiàn)其HA與人受體的結合力比野生型H7強，可能是通過Q226L和G186V突變獲得了兩個大的疏水殘基；前一個突變與1957年的H2和1968年的H3的疫情病毒一樣；H7獲得了典型大流行禽流感毒株的一些受體結合特征13。A/Anhui/1/2013毒株被WHO推薦為候選的疫苗病毒32。研究發(fā)現(xiàn)A/Anhui/ 1/13 HA與人受體有一定的結合能力，如果再發(fā)生G228S單基因突變，能極大地提高HA與人受體的結合能力33。毒株A/Shanghai/1/2013能量分布亦與H1N1類似，其雖保留了226Gln，與人受體亦有結合能力20。一種致死毒株A/Jiangsu/01/2013的對接結果能量分布與H1N1類似度相對小，可能是由于HA三維結構建模存在偏差。

圖3 構象分類Fig.3 Conform ational classification(a)all conformations,D_SIA is the distancebetween HA and SA 1, D_NAG is the distance between HA and GlcNAc3;(b)reasonable conformations;(c)binding posewhoseΔG<－41.9 kJ·mol－1and root-mean-square deviation(RMSD)<0.4 nm.color online

圖4 8種致死的H 7N9毒株HA的對接能量分布圖Fig.4 Energy distribution scatter diagram of HA from 8 fatalH 7N9 isolates*Thepattern of thepicturesis similar to H1 except(f).

剩余的31種H7N9毒株中，有些確定是從病人體內(nèi)提取的樣本，有些沒有查詢到相關文獻。31種毒株的對接能量分布有些與H1N1能量分布類似，有些不類似。其中A/Zhejiang/22/2013是病人毒株，其HA也發(fā)生了Q226L置換突變34(圖5(b))。把A/Anhui/02/2013與A/Anhui/01/2013和A/Anhui/ 03/2013比較發(fā)現(xiàn)(圖5(a))：其中A/Anhui/01/2013和A/Anhui/03/201314是致死的，對接能量分布與H1N1類似并且能量偏低；而A/Anhui/02/2013不致死，其對接能量分布與H1N1類似，但結合自由能較高。說明有些H7N9毒株與人受體的對接能量分布與H1N1類似和接近，H7N9在演化過程中有可能產(chǎn)生與人受體具有較高親和力的毒株。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報告，自2013年以后，H7N9禽流感病毒導致571人感染，212人死亡32。H7N9雖然獲得了典型大流行禽流感毒株的一些受體結合特征，但是受體結合特異性依然是禽受體偏好，限制了H7N9在人與人之間傳播13。A/ Shanghai/1/2013能與人受體結合，但依然偏好禽受體20。H7N9 HA與人受體的結合力與典型大流行H1毒株相比仍存在差距，與典型大流行毒株的高效氣溶膠傳播相比，該差距影響了H7N9通過氣溶膠有效傳播33。

3.3 親和力-特異性圖

由于對接后LSTc有很多可能構象，沒有唯一最優(yōu)構象，所以我們定義了一個特異性函數(shù)S來進行統(tǒng)計分析HA蛋白與人受體的親和力。根據(jù)范特霍夫等溫公式ΔG=ΔG0+RT ln J(其中ΔG為吉布斯自由能，ΔG0為同一溫度和標準壓強下的吉布斯自由能，R為氣體常數(shù)，T為熱力學溫度)，等溫等壓條件下，當反應達到平衡時，ΔG為0，J變?yōu)槠胶獬?shù)。于是有ΔG0=－RT ln K，平衡常數(shù)K=exp(－ΔG0/RT)。我們用有效構象中最低結合自由能構象的平衡常數(shù)，除以所有有效構象的平衡常數(shù)之和，表示此HA蛋白最低構象出現(xiàn)的概率，代表此HA蛋白與人受體的結合特異性：

依據(jù)對接后的結合自由能和構象，我們用上述方法計算出每一個HA蛋白與人受體的特異性，與最低結合自由能作圖，H1、H7N9和野生型H7分別被標記成綠色、紅色和藍色，得到圖6。由圖6可以看出，禽流感病毒HA變異體組與LSTc結合能力的整體趨勢是圖中箭頭所指方向。HA蛋白與人受體LSTc的結合自由能越低，同時特異性越高，說明HA蛋白與人受體結合時最低能量構象出現(xiàn)的概率就越高，由此推斷HA與人受體的親和力越強。從趨勢上看，H7N9與人受體的親和力普遍低于具有較高感染人能力的H1N1，說明H7N9傳染人的能力較弱；但有些H7N9毒株與人受體的結合力接近H1N1，說明H7N9在演化過程中可能會演化出具有較高感染人能力的毒株，這與2013年H7N9禽流感疫情的實際發(fā)生情況一致。Shi等20用H1N1 A/California/04/2009作為人受體特異性對照，野生型H5N1A/Anhui/1/2005作為禽受體特異性對照，研究H7N9 A/Anhui/1/2013、H7N9 A/ Shanghai/1/2013的受體結合特異性，發(fā)現(xiàn)H7N9A/ Anhui/1/2013和H7N9 A/Shanghai/1/2013既可以與禽受體也可以與人受體結合，但是二者與禽受體結合的特異性更強。野生型H7用藍色標出，特異性明顯較低。

圖6 親和力－特異性(S)圖Fig.6 A ffinity－specificity(S)figuregreen points:H1;red points:H7N9;bluepoint:w ild type H7. coloronline

本文預測的是H7N9亞型與人受體結合的整體趨勢，只有大規(guī)模計算所呈現(xiàn)的整體趨勢才具有統(tǒng)計意義。針對具體毒株，亦需要精確建模和多次運算以保證結果的可靠性。由于二代測序技術的成熟應用，發(fā)展一種從氨基酸序列建三維模型著手，通過分子對接計算HA蛋白與LSTc的結合力，預測新發(fā)流感感染人能力的方法十分有意義。本預測系統(tǒng)可以應用于新發(fā)禽流感病毒感染人能力的快速預測。不過，對建模精度加以改善，并在對接前逐一檢查每個建模模型，將可以增加預測的精確性和準確性。綜上，本文為快速評估預測禽流感病毒感染人的能力提供了新方法新思路。

4 結論

禽流感病毒多樣性豐富，變異頻率高，不斷有新的毒株產(chǎn)生。理論計算方法可以高通量大規(guī)模計算，是實驗方法的有力補充。隨著二代測序的成熟應用，發(fā)展一種通過氨基酸序列建HA蛋白三維結構模型，然后通過高通量計算快速預測禽流感病毒HA蛋白與人受體結合能力的方法，提前篩選出危險毒株，有利于優(yōu)先針對危險毒株安排禽流感防控措施，防止禽流感病毒的跨種傳播。本文通過分子對接方法，對禽流感HA蛋白－人受體的相互作用進行計算預測。我們首先對氨基酸序列進行同源建模，獲取HA蛋白的三維結構模型；然后通過對接后的能量分布和特異性分析，對H7蛋白各變異體與LSTc的親和力進行定量計算和分析比較。結果顯示，H7N9與人受體的親和力普遍弱于具有較高感染人能力的H1N1；但有些H7N9毒株與人受體的親和力較強，說明H7N9演化過程中可能會產(chǎn)生感染人能力較強的毒株，與2013年H7N9禽流感疫情發(fā)生情況一致。所以本文的計算預測方法能夠預測HA蛋白變異體與人受體的相互作用，快速預測新發(fā)禽流感病毒感染人的風險，為非人宿主禽流感病毒的風險評估提供理論依據(jù)。

致謝：感謝復旦大學生命科學學院黃強教授實驗室的袁慧同學對全文進行了仔細修改，感謝湯洪海同學、王國棟同學、錢嘉強同學提出的寶貴意見。

Supporting In formation:The structuresof HA formolecular docking havebeen included.This information is available freeof charge via the internetatwww.whxb.pku.edu.cn.

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Molecular Docking of Human-Like Receptor to Hemagglutinins of Avian Influenza A Viruses

DENG Ying-Chun LIU Qing HUANG Qiang*
(School ofLife Sciences,Fudan University,Shanghai200438,P.R.China)

Hemagglutinin(HA)is a glycopro tein located on the surface of the avian influenza A viruses.HA plays a key ro le in the in fection process,binding to receptors on the hostcellsurface andmediating the fusion between vira land hostendosomalmembranes.In nature,in fluenza A virus undergoes continuous variation, particularly the am ino acid sequence at the receptorbinding site ofHA.When the binding ability ofHA variants towards human receptors becomes strong,influenza A virus can infecthumans.To prevent the influenza A virus from infecting humans,proper assessments of the infectious risk posed are urgently needed.Screening ofhigh risk virus strains by ana lyzing the binding ability ofHA variants forhuman receptors through a high-throughput method would be particularly usefu l.In this study,we used H7(a subtype ofHA)as a subjectand deve loped a molecu lar docking based theo retica l calculation m ethod to evaluate the a ffinity of HA variants for human receptors.The results showed that the binding affinity ofH7 forhuman receptors is lower than thatofH1,which shows a strong ability to infecthumans.This resultsuggests thatstrains of the H7 subtype are generally weakly in fectious in humans.Nevertheless,the ca lcu lation resu lts also showed that some new ly-found virus strainsof the H7N9 subtype have a high binding affinity forhuman receptors,suggesting that the H7N9 subtypem ight include strainsw ith a high risk for infecting humans.These results are consistentw ith the actua loccurrence of the 2013 H7N 9 epidem ic.Ourme thod may be used to rapidly pred ict the a ffinity of HA for human recep tors and provides a theoreticalbasis for the risk assessmentof the infectiousness of influenza Avirus toward humans.

In fluenza A virus;Interspecies transm ission;Recep tor-specificity;Molecular docking; Binding free energy

O 641

10.3866/PKU.WHXB201612052

www.whxb.pku.edu.cn

Received:October28,2016;Revised:December2,2016;Published online:December5,2016.

*Corresponding author.Email:huangqiang@fudan.edu.cn;Tel:+86-21-51630589.

The projectwassupported by the NationalNaturalScience Foundation of China(91430112,31671386)and SpecialProgram forApplied Research on Super Computation of the NSFC-Guangdong Joint Fund(the Second Phase),China.

國家自然科學基金(91430112,31671386)和NSFC-廣東聯(lián)合基金(第二期)超級計算科學應用研究專項和國家超級計算廣州中心支持資助項目?Editorialoffice of Acta Physico-Chim ica Sinica