蛹蟲草活性物質(zhì)提取技術(shù)研究進(jìn)展

陳方圓+焦子偉++努爾買買提++郭巖彬+馬正海

摘要：蛹蟲草別稱北蟲草、北冬蟲夏草、蛹草菌等，分類學(xué)上與冬蟲夏草同屬，現(xiàn)已形成大規(guī)模人工栽培，因藥理作用廣泛，已被批準(zhǔn)為冬蟲夏草的替代品及新資源食品。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對蛹蟲草活性物質(zhì)提取技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究與報(bào)道，本文結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究技術(shù)與成果，對蛹蟲草活性成分的提取技術(shù)進(jìn)行歸納與總結(jié)：提取蟲草素主要有水浴浸提法、超聲法、超臨界流體萃取法、微波法等；提取蟲草酸有水提法、醇提法、超聲-浸提協(xié)同提取法等；提取多糖有熱水浸提法、超聲提取法、微波輔助提取法等；提取超氧化物歧化酶有基酒提取法、超聲波提取法、煎煮法等；提取甾醇和糖醇有超聲波提取法等；提取色素有酸熱法、丙酮提取法等。建議進(jìn)一步優(yōu)化蛹蟲草活性物質(zhì)的提取工藝，為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草；冬蟲夏草；活性物質(zhì)；提取技術(shù)；研究進(jìn)展

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0007-07

收稿日期：2016-01-19

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（編號：201491153）。

作者簡介：陳方圓（1990—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事藥食兩用真菌活性成分提取分析研究。

通信作者：焦子偉，博士，教授，主要從事植物促生菌促生機(jī)理、綠色有機(jī)農(nóng)業(yè)病蟲害綜合調(diào)控研究。E-mail：7412855332@qq.com。蛹蟲草是寄生在鱗翅目昆蟲體內(nèi)的真菌，別稱北蟲草、北冬蟲夏草、蛹草菌等，顏色通常為黃色、黃褐色，分類學(xué)上與冬蟲夏草同屬子囊菌門盤菌亞門糞殼菌綱蟲草菌科蟲草屬[1]。蛹蟲草是世界性廣布種，1978年Kobayasi等報(bào)道世界各地分布蟲草達(dá)298種[2]，隨著新種與變種不斷地被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已共有380多種[3]。蛹蟲草藥理作用廣泛，已被國家科技部批準(zhǔn)為冬蟲夏草的替代品及新資源食品[4]。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草的藥理作用豐富，具有抑制DNA與RNA合成的作用，以及抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、抗氧化、抗血管生成、鎮(zhèn)痛、壯陽、催眠等功效，常用于強(qiáng)腎，治療肺病和肝病，緩解性亢奮，降血糖、降血脂，對人體的呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)均有一定的影響[1，5-6]。蛹蟲草成分內(nèi)含有大量的核苷類、蟲草酸、多糖、酶、甾醇、糖醇和色素等多種活性物質(zhì)[5]。近年來，蛹蟲草活性物質(zhì)提取技術(shù)日趨成熟，不同物質(zhì)的提取方法不盡相同，核苷類中的蟲草素（cordycepin）提取方法主要有浸提法、超聲法、索氏提取法、回流法、滲漉提取法等提取蟲草素[7-8]。王雅玲等采用超臨界流體萃取法、醇沉法、反相高效制備液相色譜法和分步結(jié)晶、連續(xù)逆流提取法等提取蟲草素[9-10]，其他核苷的提取方法相似，但最適提取條件不同；提取蟲草酸有水提法、醇提法和超聲-微波協(xié)同提取法等[11-13]；提取多糖有熱水浸提法、超聲提取法、微波輔助提取法、閃式提取法、堿提取法、煎煮法、索氏提取法、酶解法和超臨界流體法等[14-21]；提取超氧化物歧化酶（SOD）有基酒提取法、超聲波提取法、煎煮法等[22-25]；提取甾醇和糖醇有超聲波提取法等[26-27]；提取色素有酸熱法、丙酮提取法等[28-29]。本文對國內(nèi)外蛹蟲草中活性物質(zhì)的提取技術(shù)進(jìn)行分析與歸納總結(jié)，以期為開展蛹蟲草活性物質(zhì)分離、提取與純化等相關(guān)研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1蛹蟲草活性物質(zhì)及提取技術(shù)

1.1核苷類

1.1.1蟲草素藥理性蟲草素能增加脾臟質(zhì)量，加快肝臟核酸、蛋白質(zhì)更新速度等，具有抗缺氧、加速心肌營養(yǎng)血流量及降低血清膽固醇和酯蛋白含量的作用，對激素失調(diào)引起的性功能損傷也有修復(fù)作用[30-31]。蟲草素的藥理性主要包括3個方面。（1）在免疫方面，Zhou等研究表明，蟲草素對體液免疫有調(diào)節(jié)作用，還可抑制癌細(xì)胞，但對正常細(xì)胞分裂也有抑制作用[32]；Glazer采用蟲草素同時(shí)處理癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，結(jié)果與Zhou等研究的結(jié)果相同，不過認(rèn)為這種副作用較小[33]。（2）在抗腫瘤作用方面，吳洪臻等研究表明，蟲草素增強(qiáng)抗癌藥環(huán)磷酰胺的作用，作為臨床抗腫瘤藥物的輔助藥具有應(yīng)用價(jià)值[34]；李剛等研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素對小鼠艾氏腹水癌、人鼻咽癌KB細(xì)胞、人表皮樣疣、人宮頸癌Hela細(xì)胞和肺癌Lewis細(xì)胞均有明顯的抑制作用[35-36]，這與蟲草素抑制DNA和RNA的合成有關(guān)；Koc等研究表明，蟲草素對TdT-positive白血病細(xì)胞有特異的細(xì)胞毒作用，并用于治療白血病已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[37-39]。（3）在抗真菌作用方面，蟲草素對多種病毒、細(xì)菌具有選擇性抑制作用[40]。Sugar等試驗(yàn)表明，蟲草素具有非常強(qiáng)的抗真菌活性，用腺苷脫氨基酶抑制因子和蟲草素處理小鼠的腎臟時(shí)可明顯延長小鼠存活時(shí)間[41]。

1.1.2蟲草素的提取方法蟲草素，全稱3′-脫氧腺苷，熔點(diǎn)230～231 ℃，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和三氯甲烷，紫外光最大吸收波長為259 nm[42]。根據(jù)以上性質(zhì)確定目前蟲草素的提取方法主要有以下幾種。

1.1.2.1水浴法鐘艷梅等以人工蛹蟲草固定培養(yǎng)殘基為原料，采用索式提取法，即稱取處理的樣品共4份，各10 g，分別加入水、75%乙醇、95%乙醇和無水乙醇作為提取劑，在沸水浴中抽提8 h，收集提取液，蟲草素提取率分別為 0.012 2%、0.007 8%、0.005 3%、0.005 2%。結(jié)果表明，水比乙醇更利于提取蟲草素[43]。王英娟等也采用超聲波水提法、超聲波醇提法、水熱回流法和醇熱回流法4種提取方法提取蟲草素，結(jié)果表明，水熱回流法是最優(yōu)方法，最佳工藝條件為采用10倍量的水于80 ℃熱回流提取3次，每次90 min[44]。譚琪明等繼續(xù)采用傳統(tǒng)的高溫溶劑水浴提取技術(shù)提取蛹蟲草小麥培養(yǎng)基中的蟲草素，提取率為94.87%[45]，進(jìn)一步說明了水作為提取劑是可行的。

1.1.2.2超聲波提取法郭澄等比較了水提法和超聲法對提取蟲草素的影響，總趨勢是采用20%乙醇作溶劑的效果優(yōu)于水，常溫下的提取又優(yōu)于加熱條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲法不僅縮短了提取時(shí)間，有助于蟲草素的釋放與溶出，且提高了原料的利用率和蟲草素的提出率[46]。張嘉等通過比較不同提取方法也得出，超聲波提取法的提取效果最好[47]。鄧?yán)璧葍?yōu)化了超聲提取人工蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素的工藝，通過響應(yīng)曲面法考察超聲提取時(shí)間、提取溫度以及液料比對蟲草素提取率的影響，并對超聲波提取工藝進(jìn)行最佳優(yōu)化，即超聲溫度50 ℃，超聲提取時(shí)間47 min，液料比30 mL ∶1 g，提取3次時(shí)最佳，在此工藝條件下，蟲草素提取率的理論值為 1.057%[48]。許曉煒也進(jìn)行了超聲波提取優(yōu)化試驗(yàn)，確定采用75%乙醇超聲波提取3次，40 min/次，料液比 1 g ∶20 mL 為最佳工藝條件[49]。

1.1.2.3微波提取法黃子琪等探討利用微波提取法和超聲波提取法，從蛹蟲草菌絲體中提取蟲草素的操作方法，結(jié)果表明，微波提取法優(yōu)于超聲波提取法，但應(yīng)注意采用微波法提取蟲草素時(shí)，提取時(shí)間不宜過長，所選微波功率應(yīng)小，不宜過高[7，44，50，54-55]。梁晨比較研究了水浴法、超聲波法、微波法和超臨界法提取培養(yǎng)基中蟲草素的提取率，結(jié)果表明，微波法的蟲草素提取率較高[31]。曹慶穗等以人工蛹蟲草為原料，通過微波輔助工藝提取蟲草素，結(jié)果表明，微波輔助提取人工蛹蟲草中蟲草素的提取率是傳統(tǒng)提取法的1.14倍[53]。夏敏等對蛹蟲草固體培養(yǎng)物中的蟲草素進(jìn)行微波提取并優(yōu)化了最佳提取條件，測定蟲草素含量達(dá)12.16 mg/g[50]。翁梁等在前人研究基礎(chǔ)上考慮了pH值對微波法提取率的影響，進(jìn)一步優(yōu)化了試驗(yàn)的工藝條件[56]。王陶等在研究蛹蟲草菌絲體中蟲草素的提取工藝及檢測方法中，確定微波-超聲波協(xié)同提取法為蟲草素提取的最佳方法[57]。殷東林等研究了蟲草素的提取工藝，確定用微波助提法并加以優(yōu)化[58]。李辰等利用微波輔助提取法從蛹蟲草子實(shí)體或大米培養(yǎng)殘基中提取蟲草素后，比較利用混合大孔樹脂和離子交換樹脂分離純化蟲草素的效果，最終確定了最佳工藝吸附條件[59-60]。

采用浸提法、索氏提取法、水熱回流法或醇熱回流法操作簡單，但耗時(shí)過長。超聲波法快速、操作簡單、提取效果好，且受試驗(yàn)環(huán)境、儀器人員條件等因素限制少。微波法與超聲波法提取蟲草素相比，具有提取時(shí)間較短、效果好、噪聲小、設(shè)備簡單易得等優(yōu)點(diǎn)。但以上方法都有不易大型化的缺陷，多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)提取蟲草素仍以溶劑提取為主。吳勇等采用6種不同的方法提取蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草素，提取物的得率由高到低為滲漉法>微波法>水熱回流法>醇熱回流法>超聲波水法>超聲波醇法，并認(rèn)為滲漉法和微波法均明顯高于其他工藝法[8]。

1.1.2.4超臨界流體萃取法近年來，隨著超臨界流體萃取技術(shù)（supercritical fluid extraction，簡稱SFE）的快速發(fā)展，人們稱之為“綠色分離”的新型分離技術(shù)[61]。CO2作為最常用的超臨界流體，具有無毒、無溶劑殘留、無二次污染、操作溫度低、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)提取法相比，此法克服了提取時(shí)間長、溫度高、系統(tǒng)開放等缺點(diǎn)，同時(shí)萃取出多種極性組分，有利于提取與分離生物資源的有效成分。陳順志以食用真菌蟲草或北蟲草人工培養(yǎng)后的發(fā)酵物為原料，采用超臨界技術(shù)萃取有效成分，同時(shí)結(jié)合一般方法除雜、濃縮、結(jié)晶，結(jié)果表明，蟲草素結(jié)晶純度大于98%[62]。Ling等利用超臨界流體技術(shù)萃取九州蟲草中的蟲草素和腺苷，并利用反相高效液相色譜法進(jìn)行分離純化，也取得了理想的效果[63]。

1.1.2.5生物酶輔助提取技術(shù)近年來，生物酶輔助提取技術(shù)應(yīng)用于天然藥物活性成分提取[64]，具有專一、高效、成本低等特點(diǎn)[65-66]。謝紅旗等選擇纖維素酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶及果膠酶輔助熱水提取蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素，得到中性蛋白酶輔助提取蟲草素的最佳條件為中性蛋白酶用量15%[64]，預(yù)處理料液比1 g ∶10 mL，pH值5.5，溫度 50 ℃，酶處理時(shí)間60 min；與普通熱水浸提相比，蟲草素提取得率提高6.2倍，相對乙醇回流提取的提取率也有輕微提高。

1.1.2.6連續(xù)逆流提取連續(xù)逆流提?。╟ontinuous countercurrent extraction，簡稱CCE）是從天然藥物中提取活性成分的重要方法[67]。韋會平等采用CCE法從大米培養(yǎng)基中提取蟲草素，通過5因素4水平的正交試驗(yàn)確定最佳的提取工藝參數(shù)，結(jié)果表明：以70%乙醇作為溶劑，溶劑、大米培養(yǎng)基體積質(zhì)量比為 5 mL ∶1 g，提取3次，每次浸泡12 h，振蕩提取2 h蟲草素提取效果最佳[68-69]。

1.1.3其他核苷類腺苷具有抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、改善心腦血液循環(huán)等作用[70-71]。此外，其他核苷類成分也具有抗驚厥、抗焦慮等作用[72-73]。目前有關(guān)核苷類提取方法的研究比關(guān)于蟲草素的研究相對較少，且提取方法與蟲草素基本相同。楚玉南等通過超聲波提取蟲草總苷，以甲醇為提取溶劑時(shí)提取率達(dá)到8.994%[3]。裴軼琨采用超聲波輔助提取高效液相色譜結(jié)合紫外（HPLC-UV）檢測法，對人工蛹蟲草中的尿嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、鳥苷、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、腺苷和蟲草素等8種化合物進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，超聲波提取法的最優(yōu)條件為以甲醇溶液作為提取劑，溫度為25 ℃，時(shí)間為 15 min，超聲功率為100 W，料液比 1 g ∶100 mL[74]。汪宇等試驗(yàn)中比較了加熱回流、超聲振蕩和水浴溫浸3種方法提取腺苷的效果，結(jié)果表明，加熱回流效果較差，其他2種方法效果相似[75]，這與郭澄等研究結(jié)果[46]一致，推測可能是因?yàn)橄佘盏臒岱€(wěn)定性較差，且加熱回流提取物中雜質(zhì)含量較多，對高效液相測定的結(jié)果有不少影響，因此選擇水浴溫浸法提取，但是此法耗時(shí)長，在大規(guī)模生產(chǎn)中會延長生產(chǎn)周期。

1.2蟲草酸

1.2.1蟲草酸藥理性1957年Chatterijee等從蟲草中分離到甘露醇（D-mannito1），分子式為C6H14O6，具有抗自由基、抗氧化作用，是醫(yī)藥工業(yè)的重要原料，也是藥品中常用的賦形劑，臨床上主要使用的滲透性利尿藥就含有此成分[76-77]。滲透性利尿藥常用于治療腦水腫及青光眼，是用于降低顱內(nèi)壓的首選安全有效藥物，在治療腦栓塞、腦血栓、腦溢血、血管痙攣等，以及利尿、排毒、腎功能衰竭、促進(jìn)新陳代謝等方面具有療效[78]。蟲草酸易溶于水，微溶于醇，不溶于酯、醚。提取方法常用水提法、醇提法和超聲-微波協(xié)同提取法等[79-80]。

1.2.2蟲草酸提取方法

1.2.2.1水提法蔡仲軍等精確稱取5份0.5 g蟲草粉，置于 80 ℃ 水浴鍋中浸提1.0 h，浸提液經(jīng)離心沉淀，最終得到的平均含量是13.27%。水提法成本低、安全、工藝設(shè)備簡單、適合工業(yè)大生產(chǎn)，但有提取雜質(zhì)多、收率較低、提取液過濾和濃縮操作困難、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)[81]。

1.2.2.2醇提法有機(jī)溶劑提取法是國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)從海帶中提取生產(chǎn)甘露醇使用最廣的方法，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇。閆文娟等采用不同預(yù)處理測定廣東蟲草3種樣品[82]。醇提取法提取的蟲草酸含量均高于水提取法，可能是乙醇提取時(shí)破壞了未破碎細(xì)胞的半透性細(xì)胞膜，增大了細(xì)胞中甘露醇的浸出能力。該法對設(shè)備要求簡單、產(chǎn)品得率高，但是成本較高、雜質(zhì)含量高、提取時(shí)間較長[83]。

1.2.2.3超聲波-浸提結(jié)合法鐘艷梅等采用超聲波-浸提結(jié)合法對蛹蟲草培養(yǎng)殘基蟲草酸提取工藝進(jìn)行研究，確定了超聲波-浸提結(jié)合法提取人工蛹蟲草蟲草酸最佳工藝條件，即料液比為1 g ∶35 mL、超聲功率99 W、超聲時(shí)間 20 min、浸提時(shí)間2.0 h、浸提溫度30 ℃，蟲草酸得率達(dá)到067%[83]。此方法較為簡單，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。超聲波-浸提結(jié)合法比純浸提法或純超聲波提取法的提取效果好，提取劑以蒸餾水為佳。

1.2.2.4微波提取法微波技術(shù)具有特殊的促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的特性，有利于加速提取植物中的有效成分，并提高提取率[84]。鄧?yán)璧冗M(jìn)行人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體中蟲草酸微波提取試驗(yàn)，結(jié)果表明，最佳優(yōu)化工藝條件為微波功率555 W，料液比 1 g ∶35 mL，提取時(shí)間4 min，提取2次，蟲草酸提取率的理論值可達(dá)到84.45%[85]。邵穎等通過微波提取法得到蛹擬青霉發(fā)酵菌絲體中蟲草酸，最佳提取條件乙醇濃度70%，料液比 1 g ∶100 mL，微波功率200 W，微波時(shí)間80 s[86]。

1.3多糖

1.3.1多糖藥理性蟲草多糖是蛹蟲草中生理活性物質(zhì)之一，具有抗疲勞、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖和降血脂等功效[87-92]；蟲草多糖還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提升機(jī)體的免疫功能，主要是通過激活T、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，活化補(bǔ)體，促進(jìn)細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素生成。此外，蟲草多糖還對補(bǔ)肺腎、益精氣有明顯功效，已應(yīng)用于醫(yī)藥與保健食品的生產(chǎn)與研究[93-95]。

1.3.2多糖提取方法

1.3.2.1水提法水提法是提取多糖的常用方法之一，研究人員對蛹蟲草多糖的水提法工藝進(jìn)行了研究[96-99]，并對水提法進(jìn)行了優(yōu)化[97-100]。祁波分別采用超聲波水提法、超聲波醇提法、水熱回流法和醇熱回流法選擇蟲草素和蟲草多糖的最佳提取工藝，結(jié)果表明，水熱回流提取法對蛹蟲草中蟲草素和蟲草多糖綜合提取的提取效率要更高，更省時(shí)、節(jié)能[101]。Yu等研究采用堿法確定蟲草多糖的最佳工藝條件[102]。陳小麗等對煎煮法、堿法和水熱回流提取法提取蛹蟲草子實(shí)體多糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用水熱回流法和煎煮法提取多糖的得率相近，煎煮法的提取條件易達(dá)到，在工業(yè)應(yīng)用上可節(jié)省成本，但在蛹蟲草煎煮中會加大成本，不太實(shí)用；水熱回流法操作簡便，溫度易控，且水分損失少，便于試驗(yàn)研究；采用堿法提取多糖得率較低，但水熱回流后會產(chǎn)生大量蛹蟲草子實(shí)體的殘?jiān)黐19]。周國海等對超聲波輔助提取法、水提法、酶解法和超臨界流體法提取多糖進(jìn)行比較，結(jié)果表明，水提法效果最佳，優(yōu)化工藝后多糖提取率為8.97%，純度高達(dá)68.9%，有望進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)中[103-104]。

1.3.2.2超聲波提取法梁晨等利用超聲波提取蛹蟲草多糖，結(jié)果表明，提取率較高，且工藝穩(wěn)定可靠，具有實(shí)際價(jià)值[31，105-106]。吳瓊英等通過掃描電子顯微鏡觀察提取多糖后的蛹蟲草子實(shí)體殘?jiān)w粒，證明采用超聲波輔助提取法更有利于蛹蟲草子實(shí)體多糖的溶出[107]。董媛等對超聲提取蛹蟲草菌絲體多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化[88，90，108]。張杰等分別采用堿提取法、熱水提取法、微波提取法和超聲提取法這4種方法提取蛹蟲草多糖，以多糖提取率為指標(biāo)進(jìn)行比較得出，超聲提取法不僅效率快、提取率高，而且可防止提取物在長時(shí)間、高溫條件下發(fā)生降解、褪色等不利變化，在此工藝條件下，多糖的提取率為8.15%，比傳統(tǒng)熱水浸提法的提取率上升了1.08百分點(diǎn)[18]。孫軍德等通過試驗(yàn)也曾取得了相似的結(jié)果[109]。趙豐麗比較了微波法、水浸提法、超聲波等方法對從蛹蟲草發(fā)酵液中提取蟲草多糖的影響，得出3種預(yù)處理方法均促進(jìn)蟲草多糖的提取，但超聲波法的效果更明顯[110]。

1.3.2.3微波提取法姚志偉等以微波輔助法提取蛹蟲草菌種中的蟲草多糖，不同功率、料液比、提取時(shí)間下的提取率分別是3.78%、3.93%、10.97%、5.78%、15.20%，表明此法利于提取多糖[111-115]。殷東林等探討了超聲波助提法、熱水浸提法、索氏提取法和微波助提法4種提取方法的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波助提法是蟲草多糖的最佳提取方法，并建立了提取蟲草多糖的最佳工藝，即微波功率420 W、料液比 1 g ∶40 mL、微波處理時(shí)間4 min、提取次數(shù)3次[20]。翁梁等曾用超聲波、沸水浴、微波提取法提取蛹蟲草多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過微波提取的蛹蟲草多糖的抗氧化性（由清除率計(jì)算得到）高達(dá)97.11%，提取率為2.23%，且提取時(shí)間少[116]。

1.3.2.4閃式提取法閃式提取法是應(yīng)用于提取天然產(chǎn)物有效成分的一種新技術(shù)，此法是在室溫和適當(dāng)溶劑的情況下，在高速剪切力和攪拌力下將植物原料粉碎成細(xì)微顆粒，使有效成分在局部負(fù)壓滲透作用下迅速分散達(dá)到溶解平衡[117]。與一般浸提方法相比，閃式提取法具有快速、完全、高效、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[118]。陳麗冰等采用閃式提取技術(shù)從蛹蟲草培養(yǎng)基中提取多糖，得到最佳提取工藝為液料比35 mL ∶1 g，提取時(shí)間 12 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，提取多糖得率為3.52%，相比傳統(tǒng)熱水回流提取的得率略高，且在室溫下進(jìn)行，提取時(shí)間較短[17]。

1.3.2.5超高壓輔助提取法陳忠杰等研究了超高壓輔助提取蛹蟲草多糖的工藝，比較了加壓時(shí)間、壓力、料液比和溫度等幾個方面對蛹蟲草多糖得率的影響，確定其最佳工藝條件為保壓時(shí)間2 min，壓力300 MPa，料液比1 g ∶40 mL，溫度 70 ℃，多糖得率達(dá)9.33%[119]。通過與其他蛹蟲草多糖提取方法比較，證明了超高壓提取法具有提取時(shí)間短、溫度條件溫和、提取率高的特點(diǎn)[120]。但超高壓技術(shù)在生物有效成分提取方面的應(yīng)用研究仍處于起步階段，還需要更多的研究才有可能被應(yīng)用推廣。

1.4超氧化物歧化酶（SOD）

1.4.1SOD藥理性SOD是普遍存在于生物體內(nèi)的金屬酶，鐘艷梅等發(fā)現(xiàn)，SOD與生物體抗衰老、營養(yǎng)狀況、抗腫瘤、免疫性疾病及炎癥有關(guān)[24，121]。SOD不僅能清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基、降低機(jī)體內(nèi)過氧化脂質(zhì)的生成速度，且具有消炎及防輻射等功能，因而在醫(yī)藥、化妝品、食品和農(nóng)業(yè)等方面應(yīng)用廣泛[122-123]。

1.4.2SOD提取方法

1.4.2.1鹽析提取法目前關(guān)于SOD提取方法成為研究重點(diǎn)之一。鐘艷梅等根據(jù)酶活力大小的影響對蛹蟲草培養(yǎng)殘基中SOD的提取條件進(jìn)行考察，具體做法是先超聲后對粗提液進(jìn)行鹽析制取SOD粗酶液，SOD粗酶液的制取方法包括有機(jī)溶劑的分級沉淀法、鹽析法等[24]。分級沉淀法是利用待測物質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中溶解度不同進(jìn)行分離的方法，常用的有機(jī)溶劑有三氯甲烷-乙醇和丙酮，但三氯甲烷具有毒性，且經(jīng)過該處理后的酶液含有三氯甲烷和乙醇?xì)埩?；丙酮在使用時(shí)須在低溫下進(jìn)行才能最大程度保持酶活性[124]。相比而言，鹽析方法更有利于試驗(yàn)，優(yōu)點(diǎn)是一般的酶在高濃度鹽溶液中穩(wěn)定、重復(fù)性好[125]、簡便安全。鐘艷梅等對不同固體（NH4）2SO4飽和度下酶總活力的測定表明，最佳提取條件為40%飽和度，此時(shí)含有大部分SOD酶蛋白[126]。杜琳等先利用煎煮法再用（NH4）2SO4鹽析法，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其飽和度達(dá)到70%時(shí)SOD幾乎全部析出，硫酸銨最佳添加量為340 g/L[25]。

1.4.2.2基酒提取法周榮芬等用基酒法提取SOD，測定SOD活力是利用鄰苯三酚/二巰基蘇糖醇（DTT）終止法，鄰苯三酚/DTT終止法測定SOD活性的過程是自氧化反應(yīng)，并在（25±0.2）℃恒溫水浴中進(jìn)行[22]。具體步驟是按順序加入緩沖液、蛹蟲草提取液和鄰苯三酚，水浴預(yù)熱15 min，加入鄰苯三酚后計(jì)時(shí)3 min（精確至秒），迅速加入100 μL DTT溶液終止自氧化反應(yīng)，室溫下放置5 min。以緩沖液作空白對照，測定420 nm波長處的吸光度，即得到酶活性。通過以上方法測定發(fā)現(xiàn)最佳工藝：蛹蟲草粉碎，料液比1 g ∶100 mL，用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的基酒提取1 d，氮吹攪動20 min/d。

1.5麥角甾醇類

1.5.1麥角甾醇藥理性麥角甾醇（ergosterol）是真菌類的特征甾醇，是脂溶性維生素D2的前體[127]，在蛹蟲草中含量相對恒定，蛹蟲草中麥角甾醇以游離和結(jié)合2種形式存在，功能是抗癌、防衰老、排毒等[128]。

1.5.2麥角甾醇提取方法對麥角甾醇的提取目前一般是選擇超聲波提取法。段韶軍等報(bào)道，將樣品皂化后提取麥角甾醇，此方法雖可促使結(jié)合型的麥角甾醇游離，但是操作復(fù)雜繁瑣，測定結(jié)果也不理想，并且皂化引入很多雜質(zhì)使皂化液中成分復(fù)雜，還須凈化處理[129]。王瑞華等進(jìn)行麥角甾醇提取，其間對回流、超聲、索氏等3種提取方法進(jìn)行了比較，提取的麥角甾醇含量表明，這3種方法制備能力基本相同[26]。但鑒于超聲提取法較完全、方法簡便、提取時(shí)間短，故最終選用此法。李萬芳等在研究蛹蟲草提取工藝時(shí)，加甲醇并置于40 ℃下超聲提取1 h，對蛹蟲草中麥角甾醇提取率的影響試驗(yàn)表明，這2種提取方法無顯著差異[27]。

1.6類胡蘿卜素

1.6.1類胡蘿卜素藥理性類胡蘿卜素是一類多烯類化合物，呈黃色、橙紅色或紅色。類胡蘿卜素主要分布于多數(shù)真菌中，常見的有酸性類胡蘿卜素和β-胡蘿卜素[130]，在蛹蟲草菌絲和子實(shí)體階段，可以合成類胡蘿卜素，合成的類胡蘿卜素大部分是由稀有的水溶性類胡蘿卜素及北蟲草黃素組成[131]，產(chǎn)量最高可達(dá)472.3 μg/g以上[132]。因類胡蘿卜素色澤自然、安全性較好，并兼有營養(yǎng)和保健作用而受到人們的青睞[133]，現(xiàn)已應(yīng)用于化妝品、食品和飼料添加劑中。此外類胡蘿卜素還具有抗心血管疾病、抗腫瘤、抗白內(nèi)障等功能，市場供不應(yīng)求[134]。但應(yīng)注意該色素須避光保存且保存時(shí)間不宜過長，且抗還原能力很差，還原劑H2O2和NaHSO3對蛹蟲草色素溶液的穩(wěn)定性有顯著影響，F(xiàn)e3+會使其褪色，這些特點(diǎn)與酮類色素性質(zhì)類似[135-136]，檸檬酸對其有增色作用，而麥芽糖、蔗糖會降低其吸光度，從而在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)謹(jǐn)慎挑選食品添加劑。

1.6.2類胡蘿卜素提取方法關(guān)于蛹蟲草類胡蘿卜素提取工藝的相關(guān)研究報(bào)道很少，張志軍等對酸熱法、研磨法、超聲波法、微波法提取類胡蘿卜素方法進(jìn)行了比較[28]；酸熱法參照王歲樓等的方法，通過比較分析，蛹蟲草中提取類胡蘿卜素最有效的方法是酸熱法，丙酮是良好的浸提溶劑[137]。根據(jù)正交試驗(yàn)及方差分析，熱處理時(shí)間和鹽酸濃度對蛹蟲草中類胡蘿卜素提取具有顯著影響。在此浸提條件下，蛹蟲草中類胡蘿卜素含量可達(dá)2 158 μg/g，比優(yōu)化前提高了42.4%。張杰等發(fā)現(xiàn)，也可用80%乙醇提取，色素提取液最大吸收波長為452 nm，對溫度和pH值較穩(wěn)定[133]。

2展望

目前，蛹蟲草已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，大大推動了資源的開發(fā)與利用[138-139]。蛹蟲草提取物不僅用于醫(yī)藥和保健品中，而且在化妝品、食品、飼料添加劑中應(yīng)用，隨著蛹蟲草活性物質(zhì)醫(yī)學(xué)價(jià)值被挖掘，優(yōu)化蛹蟲草活性物質(zhì)的提取方法成為研究熱門，但國內(nèi)外相關(guān)研究與實(shí)踐生產(chǎn)相結(jié)合緊密度不足。通過對現(xiàn)有技術(shù)工藝中的提取率、技術(shù)復(fù)雜程度、原料浪費(fèi)程度和成本等方面進(jìn)行對比分析，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對已成熟的蛹蟲草活性物質(zhì)，尤其是在蟲草素和多糖的提取工藝向工業(yè)應(yīng)用方面的研究與示范。同時(shí)也有不少研究者對其他類核苷、SOD、麥角甾醇、類胡蘿卜素等活性物質(zhì)提取方法及優(yōu)化措施進(jìn)行試驗(yàn)，但在工業(yè)化大生產(chǎn)與應(yīng)用方面仍是空白，迫切需要對現(xiàn)有的提取技術(shù)工藝的凝練與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。此外，綜合提取方法的操作難易程度、成本、減少環(huán)境污染、安全、綠色等幾個方面考慮分析，逐步開展對蛹蟲草新的活性物質(zhì)分析、生理生化與功能研究，以及新提取技術(shù)工藝研究與開發(fā)探索，隨著研究的不斷深入，技術(shù)與工藝將會更加成熟與完善。

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