2株番木瓜根際促生菌的解磷解鉀作用

葉維雁++吳海波++劉惠民++熊智++王櫻潼

摘要：用平板涂布、劃線與固體平板-透明圈法從番木瓜根際土壤中篩選出2株解磷解鉀細(xì)菌（PK-1、PK-2）。通過搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定PK-1、PK-2發(fā)酵液中水溶性磷、水溶性鉀含量和磷、鉀總量；分析PK-1、PK-2解磷解鉀能力；對(duì)PK-1、PK-2進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明，PK-1溶解無(wú)機(jī)磷能力的溶量為1.63 μg/mL，PK-2溶量為 17.26 μg/mL，溶解無(wú)機(jī)磷能力表現(xiàn)為PK-1﹤PK-2，即PK-2具有更強(qiáng)的解無(wú)機(jī)磷能力；PK-1溶解有機(jī)磷能力的溶量為 8.49 μg/mL，PK-2溶量為2.38 μg/mL，溶解有機(jī)磷能力表現(xiàn)為PK-1>PK-2，即PK-1的解有機(jī)磷能力更好；PK-1溶解鉀能力的溶量為8.15 μg/mL，PK-2溶量為8.49 μg/mL，溶解鉀能力表現(xiàn)為PK-1﹤PK-2，PK-1 和PK-2的解鉀能力接近。經(jīng)16S rDNA序列分析，初步鑒定PK-1為腸桿菌屬（Enterobacter），PK-2為芽孢桿菌屬（Bacillus）。供試菌株P(guān)K-1和PK-2具有良好的解磷解鉀功能，可為進(jìn)一步研制專用的番木瓜微生物肥料提供菌種資源和依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番木瓜；根際促生菌；解磷；解鉀；鑒定；腸桿菌層；芽孢桿菌屬

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0247-04

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR）指生存于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的一類微生物，通常具有固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)生植物激素、分泌抗生素等生理活性[1-4]。目前，研究比較多的是PGPR的解磷、解鉀、固氮功能。磷和鉀是植物生長(zhǎng)必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，而我國(guó)土壤中可供植物直接吸收利用的磷、鉀資源有限，在生產(chǎn)實(shí)踐中，為了提高作物產(chǎn)量，每年都要向土壤中施入大量的可溶性磷肥和鉀肥，造成土壤板結(jié)、地力下降、環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等問題[5]。PGPR在其生命活動(dòng)過程中通常能將土壤礦物質(zhì)中難以被植物吸收的磷、鉀釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)化成易溶性的養(yǎng)分，提升有效磷、有效鉀的供應(yīng)水平，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。隨著人們環(huán)保意識(shí)的日益提高，應(yīng)用PGPR的解磷解鉀能力促進(jìn)植物生長(zhǎng)及提高其產(chǎn)量越來(lái)越受到關(guān)注，PGPR作為一種寶貴的資源逐漸成為研究熱點(diǎn)[6]。番木瓜（Carica papaya L.）是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的多年生常綠大型草本植物，別稱萬(wàn)壽果、木瓜，果實(shí)含有豐富的糖類、胡蘿卜素、木瓜酶，富含鈣、磷、鉀等礦物質(zhì)，還具有清除自由基、增強(qiáng)人體免疫力、抗病原體等保健作用[7-8]。目前，PGPR解磷解鉀作用在許多作物上的應(yīng)用已得到諸多報(bào)道，但在番木瓜上的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。因此，開展番木瓜PGPR菌株解磷解鉀能力的研究，對(duì)研制新型微生物肥料以提高番木瓜的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究從番木瓜根際土壤中篩選出2株P(guān)GPR，并對(duì)其解磷解鉀作用進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究番木瓜PGPR的生態(tài)適應(yīng)性，研制番木瓜的微生物肥料提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

所用儀器主要有超凈工作臺(tái)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)振蕩器、原子吸收分光光度計(jì)、紫外-可見分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、電子分析天平、純水機(jī)、恒溫水浴鍋、多功能梯度PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、微波爐、乙醇燈、1 L移液器；所用試劑主要有瓊脂、瓊脂糖、蛋白胨、酵母浸出汁、牛肉膏、氯化鈉、葡萄糖、2×Taq PCR MasterMix。

1.2土樣

采自云南省西雙版納州普文鎮(zhèn)的番木瓜地，土壤系番木瓜的根際土壤。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1菌株分離純化培養(yǎng)基菌株的分離純化采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）。

1.3.2解無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基（1）解無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖1000 g，Ca3（PO4）2 5.00 g，MgCl2 5.00 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.20 g，（NH4）2SO4 0.10 g，瓊脂15.00 g，溶于去離子水中，加熱溶化，混勻，加去離子水定容至1 L，調(diào)pH值為7.4，分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，分裝。（2）解無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基：除缺少瓊脂外，其他物質(zhì)含量與解無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基相同。

1.3.3解有機(jī)磷培養(yǎng)基解有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：

（1）蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖10.00 g、（NH4）2SO4 050 g、MgSO4·7H2O 0.30 g、NaCl 0.30 g、KCl 0.30 g、FeSO4·7H2O 0.36 g、MnSO4·H2O 0.03 g、CaCO3 500 g、瓊脂15.00 g，溶于去離子水中，加熱溶化，混勻，加去離子水定容至1.00 L，調(diào)pH值至7.4，分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃ 滅菌20 min，分裝。

（2）卵黃稀釋液。用乙醇擦凈雞蛋外殼，用解剖刀切破雞蛋兩端，流去蛋清后將蛋黃流入已滅菌的錐形瓶中，約加入等量的無(wú)菌水，搖勻。

（3）將蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基熔化，冷卻至50 ℃后，立即加入卵黃液，每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加卵黃稀釋液3～4 mL作為有機(jī)磷源，混勻后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)凝成平板。

解有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：除缺少瓊脂外，其他物質(zhì)含量與解有機(jī)磷固體培養(yǎng)基相同。

1.3.4解鉀培養(yǎng)基（1）解鉀固體培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，酵母膏0.5 g，（NH4）2SO4 1.0 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 1.0 g，鉀長(zhǎng)石粉10.0 g，瓊脂15.0 g，溶于去離子水中，加熱溶化，混勻，加去離子水定容至1.0 L，調(diào)pH值至7.4，分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，分裝。（2）解鉀液體培養(yǎng)基：除缺少瓊脂外，其他物質(zhì)含量與解鉀固體培養(yǎng)基相同。

1.4分離及純化菌株

取番木瓜根，用無(wú)菌去離子水輕柔沖洗，以去除外圍土壤，用刷子刷取番木瓜根際土1 g，加入裝有100 mL無(wú)菌去離子水和若干玻璃珠的錐形瓶中，150 r/min混合30 min，使根際土壤中的微生物細(xì)胞充分分散，制作根際土混合液。將根際土混合液梯度稀釋后，分別從10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度中吸取100 μL稀釋液涂布于NA固體培養(yǎng)基上，設(shè)3個(gè)重復(fù)。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)菌落顏色、形狀、大小等特征，觀察并挑取不同的單菌落在NA培養(yǎng)基上劃線純化，連續(xù)3～5次劃線，獲取純化的菌株，4 ℃斜面保存，備用。

1.5解磷能力的測(cè)定

1.5.1解磷能力的平板測(cè)定（1）解無(wú)機(jī)磷：將活化好的菌株點(diǎn)接于解無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察透明圈的產(chǎn)生情況，并測(cè)量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），根據(jù)D/d值大小確定解無(wú)機(jī)磷能力的大小[9]。 （2）解有機(jī)磷：與解無(wú)機(jī)磷能力平板測(cè)定方法相同。

1.5.2解磷能力的搖瓶測(cè)定解無(wú)機(jī)磷：（1）種子液制備。菌株經(jīng)平板劃線活化后，挑取1環(huán)接入40 mL NA液體培養(yǎng)基中，以不接菌的NA培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)2～4 d，制備菌液。用分光光度計(jì)測(cè)定各菌液的吸光度（600 nm），最后用無(wú)菌去離子水將各菌液稀釋成相同吸光度作為種子液。（2）發(fā)酵液制備。按40 mL解無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基接入1 mL種子液接入菌種，同時(shí)接入（1）中的NA培養(yǎng)基 1 mL 作為對(duì)照，發(fā)酵液及對(duì)照在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。（3）發(fā)酵液處理。發(fā)酵液在冷凍離心機(jī)下以 8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min后取上清液2 mL移至50 mL容量瓶中，用鉬銻抗比色法[10]測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷含量。細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷的量=發(fā)酵液可溶性磷含量-對(duì)照培養(yǎng)液可溶性磷含量。

發(fā)酵液靜置30 min，磷酸鈣沉底后，移取2 mL上清液至50 mL錐形瓶中，加H2O2溶液0.5 mL，微波爐加熱消解，沸騰后改用小火維持，濃縮至1～2 mL后關(guān)閉微波爐用余熱將溶液蒸干，以除掉過量的H2O2溶液，冷卻，用5 mL去離子水沖洗錐形瓶?jī)?nèi)壁，加濃硫酸2滴（約0.1 mL），搖勻后小心轉(zhuǎn)動(dòng)錐形瓶，使酸液同內(nèi)壁接觸，然后加熱1～2 min，使殘?jiān)芙?，溶液?～4 mL并冷卻后，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至50 mL作為待測(cè)液。按上述步驟處理對(duì)照。待測(cè)液8 000 r/min離心15 min，取上清液，用鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵液中全磷含量。

解有機(jī)磷：與解無(wú)機(jī)磷能力的搖瓶測(cè)定方法相同。

細(xì)菌溶解有機(jī)磷的量=發(fā)酵液可溶性磷含量-對(duì)照培養(yǎng)液可溶性磷含量。

1.6解鉀能力的測(cè)定

1.6.1解鉀能力的平板測(cè)定將活化好的菌株點(diǎn)接于解鉀固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察透明圈的產(chǎn)生情況，并測(cè)量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），根據(jù)D/d值大小確定菌株的解鉀能力。

1.6.2解鉀能力的搖瓶測(cè)定（1）種子液制備。菌種經(jīng)平板劃線活化后，挑取1環(huán)接入40 mL NA培養(yǎng)基中，以不接菌的NA培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)2～4 d，制備菌液。用分光光度計(jì)測(cè)定各菌液的吸光度（600 nm），最后用無(wú)菌去離子水將各菌液稀釋成相同吸光度為種子液。（2）發(fā)酵液制備。按35 mL解鉀液體培養(yǎng)基接入1 mL種子液接入菌種，同時(shí)接入（1）中的NA培養(yǎng)基1 mL作為對(duì)照，發(fā)酵液及對(duì)照在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。（3）發(fā)酵液處理。發(fā)酵液在冷凍離心機(jī)下以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心 8 min，取上清液5 mL用去離子水稀釋8倍，使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定有效鉀濃度。

細(xì)菌溶解鉀的量=發(fā)酵液可溶性鉀含量-對(duì)照培養(yǎng)液可溶性鉀含量。

發(fā)酵液靜置30 min，鉀長(zhǎng)石粉沉底后，移取5 mL上清液至50 mL錐形瓶中，加H2O2 溶液1.5 mL，微波爐加熱消解，沸騰后改用小火維持，濃縮至3 mL后關(guān)閉微波爐用余熱將溶液蒸干，以除掉過量的H2O2溶液，冷卻，用15 mL去離子水沖洗錐形瓶?jī)?nèi)壁，加濃硫酸5滴（約0.25 mL），搖勻后小心轉(zhuǎn)動(dòng)錐形瓶，使酸液同內(nèi)壁接觸，然后加熱1～2 min，使殘?jiān)芙猓芤菏?～8 mL并冷卻后，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至50 mL作為待測(cè)液。按上述步驟處理對(duì)照。待測(cè)液8 000 r/min離心8 min后，取上清液，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液中全鉀含量。

1.716S rDNA基因序列分析

斜面保存的菌株經(jīng)NA液體培養(yǎng)基搖菌活化后使用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取細(xì)菌基因組DNA，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。以總DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物[11]進(jìn)行PCR，擴(kuò)增16S rDNA近乎全長(zhǎng)片段。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR采用50 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL，10 μmol/L引物各2.5 μL，DNA模板1.0 μL（20 ng左右），滅菌去離子水補(bǔ)足至50.0 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序所得16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列。通過MEGA 6軟件，以鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap 值為1 000[12]。

2結(jié)果與分析

2.1解磷解鉀的平板測(cè)定

從云南省西雙版納州普文鎮(zhèn)的番木瓜根際土壤里篩選得到2株解磷解鉀細(xì)菌，編號(hào)為PK-1和PK-2。通過固體平板法，根據(jù)透明圈直徑D與菌落直徑d的比值，即D/d值的大小初步測(cè)定菌株P(guān)K-1和PK-2的解磷解鉀能力。由表1可知，菌株P(guān)K-1和PK-2在解有機(jī)磷與解鉀能力方面都存在一定的差異。解有機(jī)磷方面，PK-1和PK-2的透明圈直徑都超過了12.00 mm，PK-1的D/d值達(dá)到3.48，大于 PK-2 的1.46，說明PK-1的解有機(jī)磷能力較強(qiáng)；解鉀方面，PK-1與PK-2的透明圈直徑都超過了21.00 mm，PK-2的D/d值達(dá)到1.65，大于PK-1的1.26，說明PK-2的解鉀能力強(qiáng)于PK-1；解無(wú)機(jī)磷方面，PK-1和PK-2均未出現(xiàn)透明圈。

2.2解磷解鉀的搖瓶測(cè)定

對(duì)菌株P(guān)K-1和PK-2進(jìn)行7 d的解磷解鉀搖瓶培養(yǎng)后測(cè)得發(fā)酵液中無(wú)機(jī)磷全磷與可溶性磷含量、有機(jī)磷全磷與可溶性磷含量及全鉀與可溶性鉀含量（表2）。由表2可知，菌株P(guān)K-1和PK-2對(duì)無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷和鉀都表現(xiàn)出不同的降解作用。解無(wú)機(jī)磷（磷酸鈣）方面，PK-1和PK-2發(fā)酵液中全磷的質(zhì)量濃度分別為4.30、43.65 μg/mL，同時(shí)PK-1和PK-2的解磷量分別為1.63、17.26 μg/mL，說明PK-2解無(wú)機(jī)磷的能力明顯強(qiáng)于PK-1；在解有機(jī)磷（卵磷脂）方面，PK-1 和PK-2發(fā)酵液中全磷的質(zhì)量濃度分別為32.41、10.86 μg/mL，同時(shí)PK-1和PK-2的解磷量分別為8.49、2.38 μg/mL，說明PK-1對(duì)有機(jī)磷的溶解能力明顯強(qiáng)于 PK-2，與固體平板法測(cè)定的解有機(jī)磷能力的結(jié)果一致；解鉀方面，PK-1和PK-2發(fā)酵液中全鉀的質(zhì)量濃度分別為954、9.01 μg/mL，同時(shí)PK-1和PK-2的解鉀量分別為815、849 μg/mL，說明PK-2的解鉀能力略強(qiáng)于PK-1，與固體平板法測(cè)定的解鉀能力的結(jié)果一致。

2.316S rDNA基因序列測(cè)定及分析

提取的菌株P(guān)K-1和PK-2基因組DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰，無(wú)非特異性條帶，可用作16S rDNA PCR擴(kuò)增的模板。菌株P(guān)K-1和PK-2的16S rDNA PCR 擴(kuò)增采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果在1 485 bp處有1條明亮的特征條帶，并且無(wú)其他非特異性條帶（圖1）。

將菌株P(guān)K-1和PK-2的16S rDNA基因測(cè)序所得序列，采用Blast進(jìn)行同源性比較，與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)對(duì)比分析，選取同源性較高的代表菌株，以16S rDNA基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2中可以看出菌株P(guān)K-1與腸桿菌屬（Enterobacter）的細(xì)菌自然聚為1支，它的16S rDNA序列與河生腸桿菌[Enterobacter amnigenus （JQ063000）]有較高的同源性，相似度達(dá)100%，因此可鑒定菌株P(guān)K-1為腸桿菌屬。菌株P(guān)K-2與芽孢桿菌屬（Bacillus）聚為1群（圖3），它的16S rDNA序列與同溫層芽孢桿菌[Bacillus stratosphericus （KX262677）]有較高的同源性，相似度為100%，因此可將菌株P(guān)K-2鑒定為芽孢桿菌屬。

3結(jié)論與討論

從云南省西雙版納州普文鎮(zhèn)番木瓜根際土壤中篩選得到2株解磷解鉀細(xì)菌PK-1和PK-2，通過平板測(cè)定D/d值和搖瓶測(cè)定發(fā)酵液中的全磷、全鉀含量和可溶性磷、可溶性鉀含量評(píng)價(jià)其解磷、解鉀能力。在解磷解鉀能力的平板測(cè)定試驗(yàn)中，PK-1解有機(jī)磷的D/d值為3.48，大于PK-2的1.46；PK-2解鉀的D/d值為1.65，大于PK-1的1.26；解無(wú)機(jī)磷平板里PK-1和PK-2均沒有出現(xiàn)透明圈。解磷、解鉀能力的搖瓶測(cè)定試驗(yàn)中PK-2溶解無(wú)機(jī)磷的量為17.26 μg/mL，明顯高于PK-1的 1.63 μg/mL；PK-1溶解有機(jī)磷的量為8.49 μg/mL，明顯高于PK-2的2.38 μg/mL；PK-2溶解鉀的量為8.49 μg/mL，略高于PK-1的8.15 μg/mL。解有機(jī)磷和解鉀方面，菌株P(guān)K-1和PK-2在搖瓶測(cè)定試驗(yàn)和平板測(cè)定試驗(yàn)中的解磷、解鉀效果基本一致，這進(jìn)一步驗(yàn)證了固體平板試驗(yàn)的結(jié)果，說明溶解有機(jī)磷的能力為PK-1>PK-2，PK-2溶解鉀的能力大于PK-1但不顯著；解無(wú)機(jī)磷方面，菌株 PK-1和PK-2在平板測(cè)定試驗(yàn)中均無(wú)透明圈出現(xiàn)，但在搖瓶測(cè)定試驗(yàn)中PK-1和PK-2表現(xiàn)出一定的解無(wú)機(jī)磷

能力（PK-2>PK-1），造成這種現(xiàn)象的原因可能是PK-1和PK-2的菌體在固體和液體環(huán)境中解無(wú)機(jī)磷能力不同，也可能是因?yàn)楣腆w平板中磷酸鈣的濃度過大，PK-1和PK-2的菌體溶解了部分磷酸鈣但還不足以形成明顯的透明圈。解磷解鉀細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中能分泌一些物質(zhì)，并向周圍擴(kuò)散，使菌落周圍的培養(yǎng)基中磷酸鈣、卵磷脂和鉀長(zhǎng)石礦粉溶解呈透明狀，因而固體平板-透明圈法是判定菌株是否具有解磷、解鉀能力的常用方法，適合進(jìn)行解磷解鉀菌的初篩，但存在一定的局限性，使用搖瓶培養(yǎng)測(cè)定能對(duì)菌株的解磷、解鉀能力進(jìn)行量化，更為準(zhǔn)確和科學(xué)[13-15]。

通過16S rDNA對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定，確定菌株P(guān)K-1屬于腸桿菌屬，菌株P(guān)K-2屬于芽孢桿菌屬，而腸桿菌屬和芽孢桿菌屬是較常見的解磷細(xì)菌和解鉀細(xì)菌[16-19]。菌株P(guān)K-1和PK-2同時(shí)具有較強(qiáng)的解磷、解鉀能力，這是一些其他的植物根際促生菌所不具備的特性，可進(jìn)一步研發(fā)成為番木瓜微生物肥料生產(chǎn)菌種，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。關(guān)于菌株P(guān)K-1和PK-2對(duì)番木瓜促生作用及對(duì)土壤微環(huán)境的影響等有待進(jìn)一步研究。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.065