次黃嘌呤核苷酸脫氫酶對豬鏈球菌2型ZY05719基因轉(zhuǎn)錄譜的影響

周俊明++何孔旺++倪艷秀++祝昊丹+俞正玉+茅愛華++呂立新

摘要：次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（IMPDH）是豬鏈球菌2型的毒力相關(guān)因子，該基因的丟失降低了豬鏈球菌2型菌株ZY05719黏附HEp-2、PK15細(xì)胞的能力。為全面掌握IMPDH對ZY05719致病力的影響機(jī)制，采用定制的Agilent豬鏈球菌2型基因表達(dá)譜芯片，比較了親本菌株ZY05719（ZY）和impdh敲除菌株（ΔZY）的基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，impdh的丟失影響了254個基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括impdh的下調(diào)基因177個，上調(diào)基因77個。對差異基因進(jìn)行同類群聚類（Clusters of Orthologous Groups，COG）分析，顯示差異基因主要集中于氨基酸、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，以及核糖體、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物合成和防御機(jī)制。本研究較為全面地分析了impdh對豬鏈球菌2型基因轉(zhuǎn)錄譜的影響，為解釋impdh在豬鏈球菌致病中發(fā)揮的作用提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型；表達(dá)譜芯片；同類群聚類；次黃嘌呤核苷酸脫氮酶；基因轉(zhuǎn)錄譜

中圖分類號： S858.285.1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0027-03

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是有莢膜的革蘭氏陽性球菌，是世界范圍內(nèi)流行的一種重要的豬病原菌[1]，該菌往往引起保育豬或斷奶仔豬發(fā)生腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎[2]。依據(jù)莢膜多糖抗原可將S. suis分為33個血清型（包括1～31、33、1/2型）[3]，其中S. suis 2致病力最強(qiáng)、流行范圍最廣，并且能夠引起人發(fā)生腦膜炎和嚴(yán)重的毒性休克綜合征[4-6]。1998、2005年分別在我國江蘇省、四川省部分地區(qū)暴發(fā)了人感染豬鏈球菌病，病原菌即為豬鏈球菌2型[7]。S. suis已成為越南南部地區(qū)成人細(xì)菌性腦膜炎的主要病因[8]，人可通過與發(fā)病豬的直接接觸感染S. suis，而人與人之間的傳播目前尚未得到證實。對S. suis 2的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了莢膜、溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白、血清渾濁因子等毒力相關(guān)因子[9]。筆者所在研究室的前期工作中，對SS2-H、ZY05719菌株的impdh基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)與親本株相比，缺失株對豬的致病力均有所下降，提出IMPDH為S. suis 2的毒力相關(guān)因子[10-11]，但I(xiàn)MPDH對S. suis 2致病力的影響還缺少系統(tǒng)性認(rèn)識。本研究采用豬鏈球菌2型的表達(dá)譜芯片，比較了親本菌株ZY05719（ZY）和impdh敲除菌株（ΔZY）的基因轉(zhuǎn)錄譜，并對差異基因進(jìn)行了歸類分析。

1材料與方法

1.1細(xì)菌培養(yǎng)

本研究涉及2株豬鏈球菌2型菌株，包括強(qiáng)毒菌株ZY、ΔZY。ZY為2005年分離自四川省資陽市發(fā)生豬鏈球菌病的豬組織（由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物組惠贈）；ΔZY為敲除impdh的ZY菌株，由筆者所在研究室構(gòu)建獲得。

細(xì)菌在THB（Todd-Heitt broth，BD）平板上進(jìn)行培養(yǎng)，無菌挑取菌落進(jìn)入THB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)過夜。將此培養(yǎng)物按照1%的接種比例接入新的THB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)至細(xì)菌對數(shù)生長期，革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2RNA提取和純化

采用TRIzol Reagent（Life technologies，US）并根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的細(xì)菌總RNA抽提。采用Biomate 3S型超微量紫外可見分光光度計（Thermo，US）測定抽提所得總RNA樣品的濃度及D260 nm/D280 nm比值，另外經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100型電泳（Agilent technologies，US）質(zhì)檢合格后使用RNeasy mini kit（Qiagen，Germany）和RNase-Free DNase Set（Qiagen，Germany），純化總RNA。

1.3樣品RNA的放大和標(biāo)記

采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒、Low RNA Input Linear Amplification kit（Agilent technologies，US）、5-（3-aminoallyl）-UTP（Ambion，US）、Cy3 NHS ester（GE healthcare Biosciences，US），按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程對樣品總RNA中的mRNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，并用RNeasy mini kit（QIAGEN，Germany）純化標(biāo)記后的cRNA。

1.4芯片雜交

依據(jù)SS2-05ZYH33菌株基因序列，定制Agilent公司的8×15 kbp表達(dá)譜芯片，該芯片包含2 178個探針（每個探針含60個堿基）。按照Agilent表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒，采用Gene Expression Hybridization Kit（Agilent technologies，US），在Hybridization Oven型滾動雜交爐（Agilent technologies，US）中以65 ℃、10 r/min滾動雜交 17 h，雜交cRNA上樣量為1.65 μg，并在staining dishes型洗缸（Thermo Shandon，US）中洗片，洗片所用試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit（Agilent technologies，US）、Stabilization and Drying Solution（Agilent technologies，US）。

1.5結(jié)果掃描

完成雜交的芯片采用Agilent Microarray Scanner（Agilent technologies，US）進(jìn)行掃描，用Feature Extraction software 10.7軟件（Agilent technologies，US）讀取數(shù)據(jù)，最后采用Gene Spring Software 11.0軟件（Agilent technologies，US）對數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile算法的歸一化處理。每個菌株設(shè)3個重復(fù)，比較親本株與缺失株之間差異2倍以上且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）的基因。以上內(nèi)容均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

1.6差異基因的同類群聚類（COG）

參照文獻(xiàn)[12]中的方法，將上述篩選的差異基因進(jìn)行同源群聚類（clusters of orthologous groups，COG）分析。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

對ZY、ΔZY 2組樣品的3個重復(fù)分別采用隨機(jī)方差 t-檢驗，測算2組樣品間每個轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)的顯著性強(qiáng)度，差異基因P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)

ZY與ΔZY經(jīng)過革蘭氏染色，通過顯微鏡觀察1 000倍放大下的形態(tài)，可見藍(lán)紫色球菌排列成鏈狀的細(xì)菌，ΔZY成鏈稍長于ZY（圖1）。

2.2RNA的質(zhì)量檢測

提取生長對數(shù)期細(xì)菌的RNA，測定D260 nm、D280 nm，依據(jù)D260 nm×稀釋倍數(shù)×40 μg/mL計算RNA的濃度以及 D260 nm/D280 nm 比值。每個RNA樣品電泳后可見3條條帶，由大到小依次為23S、16S、5S，依據(jù)條帶灰度值計算23S/16S比值。D260 nm/D280 nm≥1.8、23S/16S>0.7為合格RNA樣本，結(jié)果見表1、圖2。

2.3ZY和ΔZY表達(dá)譜芯片的比較

利用定制的Agilent表達(dá)譜芯片比較ZY和ΔZY基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明，有254個基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生2倍以上顯

著水平（P<0.05）的變化，ΔZY菌株中177個基因下調(diào)，其中impdh轉(zhuǎn)錄下調(diào)了99.97%以上，另外ΔZY中上調(diào)基因有77個。對這些差異基因進(jìn)行COG歸類，發(fā)現(xiàn)impdh的丟失引起了ZY菌株多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，主要集中于氨基酸、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，以及核糖體、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物合成和防御機(jī)制，結(jié)果見表2。

3結(jié)論與討論

溶菌酶釋放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）早前被作為 S. suis 2的毒力標(biāo)記物[13]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，敲除這些因子的S. suis 2后仍對仔豬具有致病力[14-15]。目前尚未明確 S. suis 2關(guān)鍵的毒力標(biāo)記物，從而限制了對S. suis 2致病機(jī)制的認(rèn)識，同時也阻礙了該病的防控技術(shù)研究，因此對S. suis 2毒力因子的進(jìn)一步研究非常重要。IMPDH已被證實為 S. suis 2一類重要的毒力相關(guān)因子，本研究通過定制S. suis 2表達(dá)譜芯片，比較了親本株ZY和impdh缺失株ΔZY之間轉(zhuǎn)錄本的差異。結(jié)果表明，ΔZY下調(diào)基因中直接關(guān)系到核糖體蛋白大、小亞基合成的相關(guān)基因有18個，占表達(dá)譜芯片此類基因總數(shù)的32%以上；而ΔZY上調(diào)基因中沒有關(guān)系到核糖體蛋白大、小亞基合成的基因。核糖體是蛋白質(zhì)合成的機(jī)器，由蛋白質(zhì)和RNA組成，提示impdh基因的丟失下調(diào)部分核糖體蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄，可能干擾了核糖體的正常合成，影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常合成，前期試驗表明豬鏈球菌2型菌株GN061215中也有類似發(fā)現(xiàn)[16]。

莢膜為S. suis 2細(xì)胞壁外的結(jié)構(gòu)，能夠增強(qiáng)細(xì)菌抵抗吞噬細(xì)胞吞噬的能力，是目前較為公認(rèn)的毒力因子[17-18]。莢膜組成包括半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、唾液酸，表達(dá)譜芯片中包含了莢膜合成基因（cps2A、B、C、E、D、F、H、I、J）和唾液酸合成基因。結(jié)果顯示，與ZY相比，ΔZY中cps2F、H、I均出現(xiàn)67%以上的顯著下調(diào)，提示impdh的丟失可能影響ΔZY莢膜的合成。ΔZY防御機(jī)制的相關(guān)基因中有6個下調(diào)，包括ABC多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、 β-內(nèi)酰胺酶。ABC系統(tǒng)能夠攝取營養(yǎng)、信號分子，并能提供細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)[19]；β-內(nèi)酰胺酶能夠水解一些藥物β-內(nèi)酰胺環(huán)而使藥物失活，這是病原菌常見的β-內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素類、頭孢菌素類）耐藥的主要方式[20]，提示ZY可能比ΔZY更容易產(chǎn)生針對此類藥物的耐受力。

ZY菌株丟失impdh基因后，引起較多基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，且其中部分基因與細(xì)菌的致病力存在聯(lián)系，較全面地解釋了ΔZY毒力下降的現(xiàn)象。

致謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金梅林教授提供豬鏈球菌2型SS2-05ZYH33基因表達(dá)譜芯片探針序列。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.006