利用SSR、SRAP分子標(biāo)記鑒定桃早熟芽變

馮濤+劉娟+華夏雪

摘要：以桃品種小白桃及其早熟芽變品種津柳早紅為材料，利用SSR、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，分別使用17對SSR引物、12條SRAP引物，對小白桃、津柳早紅基因組DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增，探討桃成熟期芽變機(jī)制。結(jié)果表明，UDP96-008、CPPCT 022、BPPCT 028、UDP98-411、UDP96-99等5個(gè)SSR標(biāo)記具有多態(tài)性，并將它們分別定位在1、2、3、6號染色體；SRAP標(biāo)記中me1/em5、me2/em1、me2/em5、me3/em2、me3/em6、me5/em5、me5/em6、me6/em2具有多態(tài)性。SSR、SRAP標(biāo)記可以用于桃成熟期芽變的鑒定。

關(guān)鍵詞：桃；芽變；果實(shí)成熟期；SSR；SRAP

中圖分類號： S662.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0042-03

芽變是果樹常見現(xiàn)象，早在公元1059年，我國宋朝的《荔枝譜》中就對荔枝的芽變有所描述。芽變選種作為新品種選育的手段，開始于20世紀(jì)初期。與雜交育種相比，果樹芽變選種具有多種優(yōu)勢，如育種周期短，進(jìn)程快，這對于育種周期長的果樹來說意義重大。同時(shí)，芽變選種一般是以主栽品種作為資源材料，即芽變的選擇是在對主栽品種性狀修飾的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，因此更容易獲得優(yōu)良品種（品系）。

傳統(tǒng)的芽變鑒定主要通過形態(tài)學(xué)的觀察比較，但在有些情況下，芽變和飾變的形狀特征非常相似，僅通過形態(tài)學(xué)觀察無法準(zhǔn)確判斷?，F(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)，如同工酶標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)用于果樹芽變鑒定，有一些成功的試驗(yàn)報(bào)道[1]。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）是其中一類現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)，也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 bp，其中最常見的是雙核苷酸重復(fù)，即（CA）n、（TG）n每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)量是10～60個(gè)，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)量的不同。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)，因此在園藝作物種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究方面應(yīng)用較多。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，針對基因外顯子里GC含量豐富、啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物（F-primer）含17個(gè)堿基，5′端的10 bp是一段非特異性的填充序列，接著是CCGG序列，這14 bp組成核心序列，最后是3′端的3個(gè)選擇性堿基，對外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。反向引物含18個(gè)堿基，在5′端前11個(gè)是填充序列，和緊接的AATT組成核心序列，3′端是3個(gè)選擇性堿基，對內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，由于不同個(gè)體及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔序列變異很大，所以產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。SRAP無需任何序列信息，而且多態(tài)性高、重復(fù)性好。

桃（Prunus persica）原產(chǎn)我國，是世界第三大落葉果樹，有4 000多年栽培歷史，我國有800多個(gè)品種桃。桃樹在自然栽培條件下具有較高頻率的芽變，目前發(fā)現(xiàn)桃芽變品種中約有60%屬于成熟期芽變。因此本研究選擇桃這種代表性的樹種研究芽變機(jī)制，為芽變選種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本研究選用桃品種是小白桃及其早熟芽變品種津柳早紅，取自天津?qū)W香果蔬有限公司。津柳早紅桃是2004年在天津市地方品種小白桃上發(fā)現(xiàn)的早熟芽變。該品種成熟早，在天津市6月上旬成熟；著色好，果面90%著鮮紅色；果個(gè)大，平均單果質(zhì)量129 g，最大單果質(zhì)量205 g；肉質(zhì)細(xì)、硬溶質(zhì)。津柳早紅桃在2014年6月通過天津市農(nóng)作物新品種審定委員會(huì)審定。

1.2基因組DNA提取

采用北京艾德萊生物科技有限公司的Easyspin RNA提取試劑盒，提取小白桃、津柳早紅基因組DNA，用RNA酶Ⅰ消化去除RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，用微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度。

1.3SSR鑒定

使用17對SSR引物對進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)記名稱分別為 BPPCT001、BPPCT009、BPPCT015、BPPCT016、BPPCT020、BPPCT028、BPPCT030、CPDCT008、CPPCT013、CPPCT022、CPPCT025、CPPCT030、UDP98-411、UDP96-099、UDP97-401、UDP96-008、CDDCT045[2]。PCR反應(yīng)體系包括10 ng DNA模板、1.5 mmol/L MgCl2、0.15 mmol/L dNTPs、0.55 μmol/L引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、1×PCR buffer，反應(yīng)總體積為10 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用凝膠成像儀拍照。

1.4SRAP鑒定

使用的SRAP引物包括me1、me2、me3、me4、me5、me6，em1、em2、em3、em4、em5、em6。

反應(yīng)體系同“1.3”。SRAP標(biāo)記擴(kuò)增程序：SRAP反應(yīng)程序共40個(gè)循環(huán)，94 ℃預(yù)變性5 min；前5個(gè)循環(huán)：94 ℃變性 1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min；后35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸1 min；循環(huán)結(jié)束后 72 ℃ 延伸10 min。

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用凝膠成像儀拍照。

1.5SSR差異序列的基因組定位

在GDR數(shù)據(jù)庫（http：//www.rosaceae.org/peach/genome）查詢多態(tài)性SSR標(biāo)記在桃基因組圖譜中的位置。

2結(jié)果與分析

2.1DNA純度、濃度檢測結(jié)果

采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。由圖1可見，電泳條帶較亮，表明DNA純度較高，雜質(zhì)很少；另外未見RNA條帶，微量紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果表明濃度、純度較高（表1）。

2.2SSR標(biāo)記鑒別芽變品種

從17對引物中篩選出5對擴(kuò)增效率高、重復(fù)性好、對2個(gè)供試品種擴(kuò)增產(chǎn)物有差異條帶的引物，分別為BPPCT001、CPDCT008、BPPCT009、BPPCT020、UDP98-411。BPPCT001、BPPCT020、UDP98-411在2個(gè)供試品種中都獲得1條擴(kuò)增產(chǎn)物，但條帶長度不同；而CPDCT008，BPPCT009在2個(gè)供試品種中獲得2條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶（圖2）。

2.3差異性SSR標(biāo)記在基因組中的位置

通過查詢GDR數(shù)據(jù)庫，得到差異性SSR標(biāo)記在基因組中的位置信息。除了UDD-411在數(shù)據(jù)庫中沒有定位信息外，其他SSR標(biāo)記分別位于1、2、3、6號染色體（表2）。

2.4SRAP標(biāo)記鑒別芽變品種

篩選出來多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物對分別是me1/em5、me2/em1、me2/em5、me3/em2、me3/em6、me5/em5、me5/em6、me6/em2，用于小白桃、津柳早紅基因組DNA差異檢測。

由圖3可見，選取的這8對引物都可以獲得清晰的擴(kuò)增條帶。me1/em5組以小白桃基因組DNA為模板未獲得擴(kuò)增條帶，以津柳早紅基因組DNA為模板獲得2條擴(kuò)增條帶，其中1條在400～500 bp之間，另1條在900～1 000 bp之間；me2/em1組以小白桃基因組DNA、津柳早紅基因組DNA為模板獲得了1條長度相同的擴(kuò)增條帶，在750 bp左右，但以津柳早紅基因組DNA為模板還獲得1條長度約250 bp的擴(kuò)增條帶；me2/em5在2個(gè)模板中都獲得1條長度在400～500 bp 之間的擴(kuò)增產(chǎn)物，但以津柳早紅基因組DNA為模板另獲得2條長度分別為500～600 bp、750 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物；me3/em2組在2個(gè)模板中都獲得多條擴(kuò)增產(chǎn)物；me3/em6組在2個(gè)模板中都獲得1條長度在1 000～1 200 bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物，但以津柳早紅基因組DNA為模板另獲得3條長度分別為750、1 500、2 000 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物；me5/em5組在2個(gè)模板獲得了3個(gè)相同的擴(kuò)增產(chǎn)物，但是以小白桃基因組DNA為模板另獲得1條100～200 bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物；me5/em6 組以小白桃基因組DNA為模板多獲得1條擴(kuò)增條帶；me6/em2組以小白桃基因組DNA為模板未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，以津柳早紅基因組DNA為模板獲得2條擴(kuò)增條帶，長度分別是600～750 bp、1 000 bp左右。

3結(jié)論與討論

最早用于果樹芽變的分子標(biāo)記技術(shù)是RAPD[3-5]，但是

由于RAPD標(biāo)記本身重復(fù)性差，造成結(jié)果可靠性不高。AFLP標(biāo)記成功鑒定果樹芽變的報(bào)道較多。劉永忠以奉節(jié)72-1臍橙及其晚熟芽變品種奉節(jié)晚橙為材料，采用cDNA-AFLP技術(shù)分析了2個(gè)品種的果實(shí)在成熟過程中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有34對引物出現(xiàn)差異帶，通過測序和序列比對（Blastx）分析表明，表達(dá)差異片段主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、成熟衰老、抗逆性、核糖體蛋白、DNA復(fù)制等有關(guān)[6]。張小軍以六月酥及其對照早酥梨為材料，運(yùn)用AFLP標(biāo)記對梨極早熟性進(jìn)行分析，對差異片段克隆及測序發(fā)現(xiàn)，與DNA聚合酶I、葉綠體基因、NADH脫氫酶的表達(dá)調(diào)控有關(guān)[7]。何建華對嘎拉蘋果早熟芽變和原品種進(jìn)行AFLP分析，發(fā)現(xiàn)3條多態(tài)性帶，芽變與原品種之間的遺傳相似系數(shù)為0.999 5，遺傳距離為 0.000 5[8]。許淼等利用AFLP技術(shù)，對鄂柑一號椪柑的3個(gè)少核芽變及其母株進(jìn)行分子鑒定，其中9對引物可擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，認(rèn)為鄂柑一號椪柑的少核芽變由遺傳物質(zhì)改變引起[9]。

SSR標(biāo)記成功鑒定果樹芽變的報(bào)道很少，而且還有失敗的試驗(yàn)報(bào)道。孫淑霞等利用ISSR、SSR標(biāo)記，對北京28號桃芽變株系進(jìn)行分子鑒定，認(rèn)為3株疑似芽變株系很可能是由對照芽變而來，標(biāo)記CPPCT022、BPPCT023可能是其變異位點(diǎn)[10]。劉永忠利用SSR、AFLP鑒定奉節(jié)72-1臍橙及其晚熟芽變奉節(jié)晚橙，未發(fā)現(xiàn)差異[6]。本研究使用17對SSR引物，對小白桃及其早熟芽變品種津柳早紅基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，找到了UDP96-008、CPPCT 022、BPPCT 028、UDP98-411、UDP96-99等5個(gè)多態(tài)性標(biāo)記；然后進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因組定位。

利用SRAP進(jìn)行芽變鑒定和機(jī)理研究報(bào)道也很少，既有成功區(qū)別芽變的報(bào)道，也有無法區(qū)分的報(bào)道。齊丹等采用SRAP分子標(biāo)記對遼寧省綏中縣地方梨品種秋白梨、綏中謝花甜、水紅宵、粉紅宵、洋紅宵及8個(gè)秋白梨可能變異單株進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，認(rèn)為SRAP技術(shù)可有效地應(yīng)用于梨品種及芽變鑒定、遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究[11]。張四普等利用優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系，對紅花石榴母株上的白花變異枝進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果表明白花變異枝條的產(chǎn)生可能與母株DNA片段缺失有關(guān)[12]。秦賀蘭等通過SRAP技術(shù)對小菊粉色花芽變與黃色花對照進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析，結(jié)果表明芽變品種與對照在遺傳背景上高度一致[13]。陳巍等通過SRAP標(biāo)記對13份浙南柚類地方資源和琯溪蜜柚的芽變進(jìn)行遺傳多樣性分析鑒定，結(jié)果表明15份材料間檢測到的SRAP位點(diǎn)多態(tài)性不高，不同引物組合可將11個(gè)基因型完全分開[14]。陽志慧以紐荷爾臍橙為材料，利用SRAP技術(shù)研究其變異株系的主要形狀，結(jié)果表明長紅臍橙與湘科號臍橙母子代的差異都不大[15]。本研究使用36對SRAP引物，對小白桃及其早熟芽變品種津柳早紅基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，找到8對多態(tài)性條帶，顯示桃芽變是基因組DNA序列發(fā)生了變化。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.010