試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT—PCR法同時(shí)檢測(cè)煙草花葉病毒病和馬鈴薯Y病毒病

任錫毅+劉永翔+黃永會(huì)++劉作易

摘要：為建立一套簡(jiǎn)單、快速、有效的病毒病檢測(cè)方法，避開(kāi)病毒病檢測(cè)中分子生物學(xué)方法檢測(cè)時(shí)RNA提取這一復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的過(guò)程，且能在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種病毒病，對(duì)我國(guó)常見(jiàn)的 2種煙草病毒的外殼蛋白基因部分序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和試管捕捉RT-PCR法，對(duì)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法加以改進(jìn)，與雙抗夾心酶聯(lián)免疫法（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay，簡(jiǎn)稱DAS-ELISA）和試管捕捉RT-PCR法進(jìn)行比較，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建多重試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系。結(jié)果首次成功構(gòu)建能同時(shí)檢測(cè)煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的多重試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系。該技術(shù)無(wú)須提取RNA，包括葉片研磨、捕捉、反轉(zhuǎn)錄、熒光PCR 擴(kuò)增等步驟，簡(jiǎn)單快捷、省時(shí)省力，具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：煙草花葉病毒；馬鈴薯Y病毒；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0096-05

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，簡(jiǎn)稱TMV）和馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，簡(jiǎn)稱PVY）是侵染煙草的主要病毒病害，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)煙草生產(chǎn)造成很大威脅[1-2]，尚無(wú)有效的防治藥劑，煙葉生產(chǎn)中，多采用截?cái)鄠鞑ネ緩竭M(jìn)行預(yù)防[3]。由于TMV多是通過(guò)農(nóng)事操作等進(jìn)行傳播，而PVY多以帶毒蚜蟲刺吸煙株進(jìn)行傳播，要截?cái)嗥鋫鞑ネ緩?，必須提前?duì)2種病毒進(jìn)行有效、快速和準(zhǔn)確的診斷和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)[4]。目前在對(duì)植物病毒進(jìn)行檢測(cè)中，主要方法有生物學(xué)測(cè)定法、血清學(xué)檢測(cè)法、電子顯微鏡檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法等[5-6]。生物學(xué)植物病毒檢測(cè)方法較慢，而且也受到季節(jié)和氣候等因素的限制，靈敏度不高，某些病毒因無(wú)法找到鑒別寄主而不能運(yùn)用這種檢測(cè)方法。血清學(xué)植物病毒檢測(cè)方法對(duì)操作環(huán)境和操作人員的要求都很高，且檢測(cè)成本較高，目前常用的血清學(xué)檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法、快速免疫濾紙法、免疫熒光技術(shù)、斑點(diǎn)免疫測(cè)定法以及免疫膠體金技術(shù)等；應(yīng)用電子顯微鏡檢測(cè)方法檢測(cè)之前一定要先了解不同病毒組具備何種形態(tài)以及典型病毒的特點(diǎn)，而且檢測(cè)的樣品應(yīng)該含有較高濃度的病毒。目前常用的分子檢測(cè)方法有普通逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱RT-PCR）法、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法（real time fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction）、試管捕捉RT-PCR（tube capture reverse transcription polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱TC-RT-PCR）法、免疫捕捉RT-PCR（immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱IC-RT-PCR）法。普通RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR、IC-RT-PCR法需要抗原抗體結(jié)合，成本高且費(fèi)時(shí)[5-6]。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR以高特異性、高靈敏度以及快速等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多地應(yīng)用于檢測(cè)疫病，其原理是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入1條特異性的熒光探針，隨著探針的水解與信號(hào)的積累，實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性產(chǎn)物的定性與定量分析，隨著熒光染料技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)已經(jīng)可以同時(shí)檢測(cè)多種樣品，缺點(diǎn)是當(dāng)大量樣品和幾種樣品復(fù)合侵染時(shí)，大批量的RNA或DNA的提取不僅工作量大，特別是RNA的提取對(duì)操作環(huán)境要求較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[7-11]。TC-RT-PCR是將離心管與病毒顆粒非特異性結(jié)合和反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增結(jié)合起來(lái)的一種病毒檢測(cè)和基因克隆的方法，該技術(shù)包括葉片研磨、包被、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)等步驟，但該方法檢測(cè)后期需要凝膠電泳檢測(cè)和接觸DNA染料等對(duì)人體有害的物質(zhì)[12-14]。本研究在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和TC-RT-PCR方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，旨在建立一套不需要RNA提取，避開(kāi)RNA提取這一復(fù)雜費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)程，且能在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種病毒病的多重試管捕捉實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄PCR（tube capture real time fluorescent RT-PCR）法，檢測(cè)煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒，為大量病毒病樣品和多種病毒病復(fù)合侵染的檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)單、快速有效的方法，對(duì)危害煙草的病毒進(jìn)行有效和快速檢測(cè)以及預(yù)防和控制煙草病毒病都具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

1.1番茄與馬鈴薯病葉

番茄與馬鈴薯病葉采自貴州省主要的產(chǎn)煙區(qū)，經(jīng)貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定為陽(yáng)性的TMV和PVY染病煙葉和TMV與PVY復(fù)合侵染的病葉。

1.2主要試劑

rTaq酶、dNTP、莫洛尼（氏）鼠白血病病毒[Moloney murine leukemia virus，簡(jiǎn)稱M-MuLV]反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo（dT）18、RNA酶抑制劑購(gòu)自TaKaRa[寶生物工程（大連）有限公司]。MakerⅡ購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，條帶大小依次為100、300、500、700、900、1 200 bp。洗滌緩沖液和樣品提取緩沖液所需藥品均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。TMV雙抗夾心酶聯(lián)免疫法的DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

洗滌緩沖液：氯化鉀（KCl）0.2 g、氯化鈉（NaCl）8 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2 g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9 g、吐溫20（Tween-20）500 μL，調(diào)節(jié)pH值至7.4，加蒸餾水定容至1 000 mL，4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?

樣品提取緩沖液：亞硫酸鈉（Na2SO3）1.3 g、聚乙烯基吡咯烷酮（MV24000-4000，簡(jiǎn)稱PVP）20 g、疊氮鈉（NaN3）0.2 g、吐溫20（Tween-20）20 mL，溶解于800 mL洗滌緩沖液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，加洗滌緩沖液定容至1 000 mL，4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1‰焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，簡(jiǎn)稱DEPC）水：將DEPC水用ddH2O稀釋1 000倍，高壓滅菌后備用。

1.3TaqMan探針及相應(yīng)引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中已報(bào)道的TMV和PVY的外殼蛋白基因序列（GenBank登錄號(hào)分別為AJ239099和EU719650），按照TaqMan探針和特異性引物的設(shè)計(jì)原則，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)用的TaqMan探針和相應(yīng)的擴(kuò)增引物利用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)，TC-RT-PCR用引物用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，如表1所示。

1.4方法

1.4.1TMV和PVY煙草病毒病的TC-RT-PCR檢測(cè)

1.4.1.1磨樣取0.1 g病葉，按質(zhì)量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，獲得病毒提取液。

1.4.1.2捕捉取病毒提取液1 00 μL包被0.2 mL PCR管，于37 ℃水浴3 h或4 ℃過(guò)夜；PBST洗管3次，DEPC水洗1次。

1.4.1.3反轉(zhuǎn)錄直接在PCR管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，向已捕捉抗原的PCR管中同時(shí)加入10 μmol/μL病毒反向引物TMVA1/PVYA11.0 μL、1‰DEPC水11.5 μL、5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、0.1 mol/L Oligo（dT）18 1.0 μL，70 ℃水浴預(yù)變性10 min處理，然后立即置于冰上冷卻5 min，再加入40 U/μL RNA酶抑制劑0.5 μL、200 U/μL M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL；經(jīng)42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min 合成cDNA，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.4PCR 擴(kuò)增加入10 μmol/μL正反向引物TMVS1&TMVA1/ PVYS1&PVYA1各1.0 μL；再加入10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、5 U/μL Taq酶 0.25 μL、cDNA5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4min；94 ℃ 45s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.4.2試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)TMV和PVY煙草病毒病

1.4.2.1前3個(gè)步驟同“1.4.1”節(jié)。

1.4.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR采用25 μL PCR反應(yīng)體系：加入10 μmol/μL正反向引TMVS & TMVA/PVYS & PVYA各1.0 μL；再加入10×PCR 緩沖液2.5μL、2.5mmol/L dNTPs 20 μL、5 U/μL Taq酶0.25 μL、cDNA 5 μL，TaqMan探針 1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.4.3試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法同時(shí)檢測(cè)TMV和PVY煙草病毒病

1.4.3.1磨樣取0.1 g病葉，按質(zhì)量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，獲得病毒提取液。

1.4.3.2捕捉按表2分別對(duì)同一管中加入TMV和PVY病毒提取液；包被0.2 mL PCR管，在37 ℃水浴3 h或4 ℃過(guò)夜；PBST洗管3次，DEPC水洗1次。

1.4.3.3反轉(zhuǎn)錄向已捕捉抗原的PCR管中同時(shí)加入 10 μmol/μL 反向引物TMVA和PVYA各1.0 μL、1‰ DEPC水8.5 μL、5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、0.1 mol/L Oligo（dT）18 1.0 μL、RNA 2 μL，70 ℃ 水浴預(yù)變性10 min處理，然后立即置于冰上冷卻 5 min，再加入40 U/μL 的RNasin 0.5 μL、200 U/μL M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL；經(jīng)42 ℃、1 h，70 ℃、10 min合成cDNA，在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.4實(shí)時(shí)熒光PCR采用25 μLPCR反應(yīng)體系：同時(shí)加入10 μmol/μL正反向引TMVS & TMVA/PVYS & PVYA各1.0 μL；再加入10×PCR Buffer2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.25 μL、cDNA 5 μL，同時(shí)加入TMV和PVY的TaqMan探針各1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足 25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.4.4試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法與DAS-ELISA和TC-RT-PCR法的比較取TMV病葉0.1 g，按質(zhì)量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，獲得病毒提取液，分別在酶聯(lián)免疫板內(nèi)進(jìn)行DAS-ELISA（參考美國(guó)Agdia公司TMV DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書）試驗(yàn)。最后結(jié)果用ELX-800 UV自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀在405 nm處測(cè)定樣品的D405 nm）、TC-RT-PCR（參照“1.4.1”節(jié)）和試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)（參照“1.4.2”節(jié)），并將粗提液作梯度稀釋：100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 mg/mL；1.000、0.200、0.040、0.008 μg/mL；1.600、0.320、0064 ng/mL，共12個(gè)處理，每個(gè)梯度取3份，用于DAS-ELISA、TC-RT-PCR和試管捕捉實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 靈敏度試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1TMV和PVY的TC-RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

試管捕捉時(shí)捕獲溫度在35～39 ℃較好，且36～37 ℃最佳，捕獲時(shí)間3～5 h均能得到較好的結(jié)果；反轉(zhuǎn)錄時(shí)預(yù)變性時(shí)間在6～8 min都能得到較好的結(jié)果，反轉(zhuǎn)錄時(shí)dNTPs濃度在 18 mmol/L 以上，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶濃度在140～260 U/μL 時(shí)，RNA酶抑制劑濃度在16 U/μL以上，Oligo （dT）18 濃度在 0.09 mol/μL 以上，反向引物濃度在 0.5 μmol/μL 以上，均能得到較好的結(jié)果；PCR擴(kuò)增時(shí)rTaq酶濃度在1～3 U/μL均能得到較好結(jié)果，dNTPs濃度在 3.75 mmol/μL 以上，正反向引物濃度在 10 μmol/μL 以上，均能得到較好的結(jié)果（圖1、圖2）。

2.2TMV和PVY的試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

由圖3、圖4可知，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)，曲線呈“S”形，而陰性對(duì)照呈水平直線，根據(jù)TMV和PVY的保守序列設(shè)計(jì)引物和 TaqMan 探針，分別以帶有TMV和PVY的煙草病毒病樣品作為檢測(cè)對(duì)象，可以特異性地?cái)U(kuò)增目的條帶（循環(huán)閾值分別為17.71、21.82 ），而對(duì)健康的樣品和空白對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增，呈陰性；檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10 μmol/μL的TaqMan探針加入量在 25 μL 體系中為1.0 μL以上均能得到較好的結(jié)果。

2.3TMV和PVY的試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR同時(shí)檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于樣品中帶毒量和病毒的穩(wěn)定性不一，所以同時(shí)捕捉時(shí)，對(duì)于帶毒量低、穩(wěn)定性差、易降解的病毒樣品，加樣時(shí)應(yīng)多加，才能得到較好的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于帶毒量高、穩(wěn)定性好的病毒樣品，加樣時(shí)少加也能得到好的效果，本試驗(yàn)中若要在同一個(gè)管中同時(shí)檢測(cè)到TMV和PVY，同一個(gè)管中加入的TMV量至少要達(dá)到3.5 mg/μL以上才能捕獲成功，PVY的加樣量至少達(dá)到6.0 mg/μL以上才能捕獲成功。當(dāng)每個(gè)反應(yīng)管中2對(duì)引物和2對(duì)探針同時(shí)存在時(shí)，只有對(duì)應(yīng)模板被加入才發(fā)生相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)；2個(gè)模板同時(shí)加入時(shí)，既不發(fā)生交叉反應(yīng)也不影響各自反應(yīng)效率（圖5）。說(shuō)明針對(duì)TMV、PVY設(shè)計(jì)的引物和探針特異性強(qiáng)，多重試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法構(gòu)建成功，且檢測(cè)效果理想。

2.4DAS-ELISA法、TC-RT-PCR和試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的比較

針對(duì)本研究中選用DAS-ELISA法、TC-RT-PCR和試

管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法。從檢測(cè)時(shí)間上來(lái)看，試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR耗時(shí)最短，檢測(cè)1個(gè)病毒病樣品所用時(shí)間為100 min左右。DAS-ELISA耗時(shí)最長(zhǎng)，檢測(cè)1個(gè)病毒病樣品所用的時(shí)間基本為5 h左右。從檢測(cè)費(fèi)用上看，DAS-ELISA法遠(yuǎn)高于TC-RT-PCR和試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法。從檢測(cè)靈敏度上來(lái)看，DAS-ELISA法檢測(cè)靈敏度在 0.2 μg/mL；TC-RT-PCR法檢測(cè)靈敏度在0.32 ng/mL（圖6）；試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法反應(yīng)靈敏度 1.6 ng/mL（圖7）。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)合TC-RT-PCR法與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法，構(gòu)建了試管捕捉實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙重試管捕捉RT-PCR法，目前用于檢測(cè)廣泛發(fā)生于煙草上的主要的2種病毒病TMV和PVY，利用2種TaqMan熒光探針實(shí)時(shí)檢測(cè)2個(gè)目的基因的擴(kuò)增，在同一管中RT-PCR與探針檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需90 min左右，且只需在加樣時(shí)打開(kāi)1次蓋子，其后的過(guò)程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，消除了PCR產(chǎn)物的污染，減少了檢測(cè)步驟，節(jié)省了時(shí)間，解決了以往同時(shí)檢測(cè)TMV和PVY方法存在的不足之處，在同一個(gè)反應(yīng)管中，利用多重試管捕捉和同一波段的不同熒光染料同時(shí)標(biāo)記多種待測(cè)樣品，使得單管反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出多種病毒病，對(duì)于大量病毒病的檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，靈敏度高，針對(duì)2種不同病毒病和2種病毒病復(fù)合侵染的情況，可經(jīng)1個(gè)反應(yīng)1次就檢測(cè)出來(lái)，省時(shí)省力，省去了RNA的提取步驟，進(jìn)而省去了RNA提取時(shí)所需的試劑費(fèi)，從而避免了RNA提取時(shí)的復(fù)雜操作，尤其是多種病毒同時(shí)檢測(cè)時(shí)，前期幾種RNA的提取更費(fèi)時(shí)費(fèi)力，此技術(shù)只須要將幾種病毒病的粗提液同時(shí)加入同一個(gè)管中，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、特異性強(qiáng)，收集熒光在較高的退火溫度進(jìn)行，排除了模板的非特異性擴(kuò)增，無(wú)交叉反應(yīng)，可用于2種病毒特異性的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，且操作快速簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀準(zhǔn)確。因所有試驗(yàn)在封閉系統(tǒng)內(nèi)完成，可變因素大大減少，避免了普通PCR方法容易產(chǎn)生交叉污染而發(fā)生非特異性的擴(kuò)增，因?yàn)椴恍枰笃谔幚恚煞乐箯?qiáng)致癌物溴化乙錠對(duì)操作人員的危害，也不需要通過(guò)測(cè)序來(lái)對(duì)病毒進(jìn)行判定，但檢測(cè)時(shí)可能由于一些病毒病樣品的帶毒量與穩(wěn)定性不一致，所以捕捉時(shí)，對(duì)于穩(wěn)定性差、帶毒量低的樣品，加樣時(shí)應(yīng)多加，才能得到較好的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于穩(wěn)定性好、帶毒量高的病毒加樣時(shí)少加也能得到好的效果，如TMV和PVY同時(shí)檢測(cè)時(shí)，PVY的量達(dá)到60 μL以上才能捕獲成功，而TMV卻只要加入35 μL以上就能捕獲成功，具有諸多優(yōu)點(diǎn)的試管捕捉雙重實(shí)時(shí)熒光技術(shù)在病毒檢測(cè)方面有廣闊的應(yīng)用前景。此外該方法的建立在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、種子流通及種子檢驗(yàn)檢疫中具有一定意義，該方法的構(gòu)建成功，使TC-RT-PCR法變得更高效，豐富了病毒病的檢測(cè)方法，對(duì)病毒病的檢測(cè)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.025