米諾環(huán)素體外抑制弓形蟲增殖作用的研究

趙瑩，楊曉燕，陳順儀，廖利銀

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511400）

米諾環(huán)素體外抑制弓形蟲增殖作用的研究

趙瑩，楊曉燕，陳順儀，廖利銀

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511400）

目的評價米諾環(huán)素(MNC)體外抑制弓形蟲速殖子的增殖作用。方法體外在96孔板中用Hela細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲速殖子，設(shè)置SMX給藥組、MNC給藥組和未給藥組。觀察各組弓形蟲速殖子的增殖情況、形態(tài)變化，并對各組進(jìn)行活蟲計(jì)數(shù)。結(jié)果給藥后72 h，與未給藥組比較，SMX給藥組活蟲計(jì)數(shù)顯著減少[(2.08±0.40)vs (15.17±2.07)，P＜0.01]，MNC給藥組活蟲數(shù)亦顯著減少[(1.42±0.20)vs(15.17±2.07)，P＜0.01]；給藥后96 h，與未給藥組相比，SMX給藥組活蟲計(jì)數(shù)顯著減少[(1.42±0.20)vs（10.92±0.47)，P＜0.01]，MNC給藥組活蟲數(shù)亦顯著減少[(1.92±0.33)vs(10.92±0.47)，P＜0.01]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥后120 h，各組活蟲計(jì)數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論MNC在體外能夠明顯抑制弓形蟲速殖子的增殖。

體外；弓形蟲；米諾環(huán)素；速殖子

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生、呈世界性分布的機(jī)會性致病原蟲，可引起廣泛人畜共患感染。免疫正常人群感染后多表現(xiàn)為隱性癥狀，但免疫低下或免疫缺陷者感染后，可引起全身廣泛弓形蟲病。孕婦等特殊人群感染弓形蟲可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果，如早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等[1]。宿主感染弓形蟲后，寄生蟲刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答，巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及各細(xì)胞因子如白介素、γ-干擾素(IFN-γ)等發(fā)揮重要抗感染作用[2]。在弓形蟲病治療方面，經(jīng)典藥物如磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等長期為臨床使用，效果顯著，但存在一定副作用，且不適用于孕婦。米諾環(huán)素(minocycline，MNC)是第二代半合成四環(huán)素類藥物的衍生物。研究表明，MNC具有良好的抗炎、抗菌等作用，同時具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，并且其相對分子量小，口服易吸收，可通過血—腦屏障[3]。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，體外米諾環(huán)素能顯著抑制弓形蟲速殖子增殖。

1 材料與方法

1.1 材料弓形蟲RH株速殖子(中山大學(xué)呂芳麗教授惠贈)由昆明鼠傳代保種。昆明鼠(Kunming, KM，6～8周)購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。小牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司。臺盼藍(lán)染液、雙抗(青霉素、鏈霉素抗生素)購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中，相對濕度為95%。培養(yǎng)液中加入10%小牛血清和雙抗。在細(xì)胞生長旺盛時，消化收集并轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含104個Hela細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察細(xì)胞生長情況。各實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)設(shè)置6孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)做一次。

1.3 藥物米諾環(huán)素購自美國Sigma公司。磺胺甲噁唑片(SMX)為中國廣州白云山藥物有限公司產(chǎn)品。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1× 104個Hela細(xì)胞，體積為100 μL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁生長達(dá)90%以上，每孔加入5×104個弓形蟲速殖子，體積為100 μL。兩者共同培養(yǎng)2 h后吸去各孔培養(yǎng)液，再用細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗兩次以除去Hela細(xì)胞外的速殖子。加入制備好的MNC和SMX，設(shè)置MNC給藥組、SMX給藥組及未給藥組。參照陳莉等[4]的實(shí)驗(yàn)方法，選取MNC的終濃度為100 μmol/L；參照趙瑩等[5]的實(shí)驗(yàn)方法，選取SMX的終濃度為1 mg/mL。鏡下觀察給藥后72 h、96 h、120 h 3個時間點(diǎn)弓形蟲速殖子的增殖情況及其形態(tài)變化，并酚酞藍(lán)染色以計(jì)數(shù)活蟲數(shù)，分析減蟲率[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間均值比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外觀察各組弓形蟲速殖子增殖情況給藥72 h、96 h、120 h后，倒置熒光顯微鏡觀察弓形蟲速殖子增殖情況及形態(tài)變化(圖1)。72 h，弓形蟲速殖子在Hela細(xì)胞內(nèi)大量增殖，形態(tài)大致正常。未給藥組弓形蟲速殖子增殖活躍，表現(xiàn)為高密度影，與之相比，MNC及SMX兩給藥組弓形蟲速殖子密度強(qiáng)度顯著減弱；鏡下，各組均可見部分弓形蟲速殖子從Hela細(xì)胞中釋放出，形態(tài)正常，活力較好。96 h，所有實(shí)驗(yàn)組弓形蟲速殖子密度強(qiáng)度均有所降低，未給藥組弓形蟲速殖子密度強(qiáng)度仍然高于兩給藥組；各組均可見部分弓形蟲蟲體腫脹、出現(xiàn)無活力的死蟲。120 h，各實(shí)驗(yàn)組弓形蟲速殖子密度強(qiáng)度均進(jìn)一步減弱，這可能是由于藥物的持續(xù)作用以及營養(yǎng)物質(zhì)消耗，出現(xiàn)大量無活力死亡蟲體。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組不同時間點(diǎn)弓形蟲速殖子增殖情況(×40)

2.2 各組各時間點(diǎn)活蟲計(jì)數(shù)酚酞藍(lán)染色，計(jì)數(shù)各時間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組活蟲數(shù)見表1。72 h，與未給藥組比較，MNC給藥組和SMX給藥組活蟲數(shù)均顯著降低(P＜0.01)。其中，SMX給藥組活蟲數(shù)進(jìn)一步低于MNC給藥組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.493)。96 h，與未給藥組比較，兩給藥組活蟲數(shù)亦顯著降低(P＜0.01)。120 h，各實(shí)驗(yàn)組活蟲數(shù)均明顯減少，出現(xiàn)大量死蟲，各組間活蟲數(shù)對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與未給藥組比較，SMX給藥組在72 h、96 h、120 h減蟲率分別為88.5%、86.9%、50.2%；MNC給藥組在72 h、96 h、120 h減蟲率分別為86.3%、82.4%、30.9%。說明SMX、MNC體外均能較好抑制弓形蟲速殖子增殖，其中SMX作用效果更好。

表1 各實(shí)驗(yàn)組不同時間點(diǎn)活蟲計(jì)數(shù)()

表1 各實(shí)驗(yàn)組不同時間點(diǎn)活蟲計(jì)數(shù)()

注：每一組12個副孔；與未給藥組比較，aP＜0.01。

組別120 h 72 h 96 h MNC給藥組SMX給藥組未給藥組F值P值1.50±0.34 1.08±0.37 2.12±0.56 0.212 0.652 1.42±0.20a2.08±0.40a15.17±2.07 18.007 0.001 1.92±0.33a1.42±0.20a10.92±0.47 97.416 0.000

3 討論

弓形蟲寄生于除成熟紅細(xì)胞之外的所有有核細(xì)胞，能侵入多種臟器甚至免疫豁免區(qū)引起嚴(yán)重弓形蟲病[6]。作為機(jī)會致病性原蟲，免疫低下人群罹患弓形蟲病往往是致死性的。弓形蟲感染引起T細(xì)胞介導(dǎo)的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，釋放大量Th1型細(xì)胞因子如γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。IFN-γ既可抑制弓形蟲的繁殖，也是重要的巨噬細(xì)胞活化因子，在抗弓形蟲感染中發(fā)揮重要作用[7]。同時研究證實(shí)，宿主感染弓形蟲RH強(qiáng)毒株后，刺激IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，這些細(xì)胞因子一方面發(fā)揮積極的抗感染作用，一方面由于其大量釋放導(dǎo)致肝、脾等器官損傷，故在感染后期，機(jī)體Th2免疫應(yīng)答增強(qiáng)以拮抗過度的Th1型免疫應(yīng)答，使機(jī)體度過急性期并存活[8-9]。

治療弓形蟲病的經(jīng)典藥物為磺胺類藥物，如磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等，其作用機(jī)制為通過阻礙二氫葉酸的形成、影響核酸和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制弓形蟲的生長與繁殖。但此類藥物存在一定副作用，如產(chǎn)生骨髓抑制等，孕婦使用可能導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)[10]。米諾環(huán)素為半合成四環(huán)素，在四環(huán)素類藥物中抗菌作用最強(qiáng)，具有抗菌、抗支原體、衣原體等作用。研究顯示，米諾環(huán)素能抑制多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在抗炎、抗菌等免疫調(diào)節(jié)的同時亦具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用[3,11]。本實(shí)驗(yàn)旨在評價米諾環(huán)素體外抑制弓形蟲速殖子增殖作用。

本研究顯示：體外Hela細(xì)胞內(nèi)，MNC和SMX均能較好的抑制弓形蟲速殖子的增殖。72 h，與未給藥組比較，MNC和SMX給藥組活蟲數(shù)均顯著減少，表現(xiàn)為弓形蟲密度影的顯著降低，但兩給藥組之間活蟲數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；96 h，隨著培養(yǎng)時間的延長和藥物的作用，速殖子的增殖受到進(jìn)一步抑制，并呈現(xiàn)異常形態(tài)，如蟲體膨脹、活性減弱等，與未給藥組比較，MNC和SMX兩給藥活蟲計(jì)數(shù)顯著減少，兩給藥組之間活蟲計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；120 h，各實(shí)驗(yàn)組弓形蟲密度均進(jìn)一步減弱，各組間活蟲計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于藥物的持續(xù)作用、營養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物大量堆積，細(xì)胞環(huán)境不利于弓形蟲生長，故出現(xiàn)大量死蟲。

綜上所述，米諾環(huán)素體外能較好地抑制弓形蟲速殖子增殖。由于MNC在抗菌的同時可下調(diào)免疫應(yīng)答，降低過度免疫反應(yīng)對機(jī)體造成的傷害[12]，因此具有高效和長效性，在四環(huán)素類中，其抗菌作用最強(qiáng)。不僅如此，MNC還有一定的抗支原體、衣原體、真菌感染作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)米諾環(huán)素體外具有一定抗弓形蟲感染作用，為弓形蟲病的治療提供一個新思路。若生物體在感染弓形蟲的同時感染對米諾環(huán)素敏感的細(xì)菌，使用MNC治療或許能起到更好的效果。

[1]楊慧,武一娜,苑文英,等.弓形蟲感染與慢性疾病的關(guān)系[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(10):2468-2469.

[2]苑文英,趙清,張平,等.白細(xì)胞介素家族在弓形蟲感染中的作用[J].中國血吸蟲病防治雜志,2010,22(1):96-99.

[3]Yong VW,Wells J,Giuliani F,et al.The promise of minocycline in neurology[J].Lancet Neurol,2004,3(12):744-751.

[4]陳莉,朱乃軍,袁媛.米諾環(huán)素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞黏附的抑制作用及其機(jī)制研究[J].中國藥房,2015,26(31):4381-4384.

[5]趙瑩,呂芳麗.匹多莫德體外抑制弓形蟲增殖作用的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2013,13(5):531-534.

[6]Tardiuex I,Menard R.Migration of apicomplexa across biological barriers:the Toxoplasma and Plasmodium rides[J].Traffic,2008,9 (5):627-635.

[7]Suzuki Y,Orellana MA,Schreiber RD,et al.Interferon-gamma:the major mediator of resistance against Toxoplasma gondii[J].Science, 1988,240(4851):516-518.

[8]Mordue DG,Monroy F,La RM,et al.Acute toxoplasmosis lead to lethal overproduction of Th1 cytokines[J].J Immunol,2001,167(8): 4574-4584.

[9]Gavrilescu LC,Denkers EY.IFN-gamma overproduction and high level apoptosis are associated with high but not low virulence toxoplasma gondii infection[J].J Immunol,2001,167(2):902-909.

[10]王大為,郭曉改,司海洋,等.弓形蟲感染治療方法的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016,3:54-57.

[11]Wang J,Wei Q,Wang CY,et al.Minocycline up-regulates Bcl-2 and protects against cell death in mitochondria[J].J Biol Chem,2004, 279(19):19948-19954.

[12]姚滿林,曾耀英,黃秀艷,等.米諾環(huán)素對小鼠T淋巴細(xì)胞體外活化和增殖的影響[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2008,28(2):136-141.

In vitro effects of Minocycline on the proliferation of Toxoplasma gondii.

ZHAO Ying,YANG Xiao-yan,CHEN Shun-yi,LIAO Li-yin.Department of Clinical Laboratory,Guangzhou Panyu District Central Hospital,Guangzhou 511400, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the in vitro effect of Minocycline on the proliferation of Toxoplasma gondii. MethodsThe T.gondii tachyzoites were cultured in Hela cells.The cells were divided into the SMX-treated group,Minocycline-treated group and untreated control group.Proliferation of the tachyzoites and morphological changes were observed,and the numbers of live tachyzoites at 72 h,96 h and 120 h were recorded after using drugs.ResultsAt 72 hours after treatment,compared with the untreated control group,the the numbers of live tachyzoites in SMX-treated group and Minocycline-treated group were significantly decreased[(2.08±0.40)vs(15.17±2.07),P＜0.01;(1.42±0.20)vs (15.17±2.07),P＜0.01].At 96 hours after treatment,compared with the untreated control group,the the numbers of live tachyzoites in SMX-treated group and Minocycline-treated group were significantly decreased[(1.42±0.20)vs(10.92± 0.47),P＜0.01;(1.92±0.33)vs(10.92±0.47),P＜0.01].At 120 hours after treatment,there were no significant difference in the the number of live tachyzoites among the three groups(P＞0.05).ConclusionMinocycline can inhibit T.tachyzoite proliferation in vitro.

In vitro;Toxoplasma gondii;Minocycline;Tachyzoites

R531.8

A

1003—6350（2017）07—1036—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.002

2016-10-11)

廣東省廣州市番禺區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2015-Z03-18）

陳順儀。E-mail：1277063279@qq.com