智利進口種牛乳頭瘤病毒的檢測與分析

王 昱，唐昌杰，肖紅波，聶福平，馬 飛，楊 俊，陳冉越，吳 蕊

（1. 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶 400044；2. 武隆縣畜牧獸醫(yī)局，重慶武隆 408528；3. 唐山出入境檢驗檢疫局，河北唐山 063000）

智利進口種牛乳頭瘤病毒的檢測與分析

王 昱1，唐昌杰1，肖紅波2，聶福平1，馬 飛3，楊 俊1，陳冉越1，吳 蕊1

（1. 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶 400044；2. 武隆縣畜牧獸醫(yī)局，重慶武隆 408528；3. 唐山出入境檢驗檢疫局，河北唐山 063000）

通過臨床觀察、采樣、PCR檢測、克隆和測序，對智利進口種牛進行了牛乳頭瘤病毒（BPV）檢測和基因分型。結(jié)果表明，智利進口牛的BPV總體感染率為0.4%，病毒亞型有BPV2和BPV13，其中以BPV2為主，BPV13的感染率僅為0.09%。L基因進化分析表明，BPV智利株和我國BPV的感染情況顯著不同，呈現(xiàn)明顯的地域特征，兩國的BPV2L1基因具有較高的同源性。BPV陽性牛的治療結(jié)果顯示，75%左右的陽性牛經(jīng)外科剪切、抗生素治療后愈合良好，但仍有部分牛出現(xiàn)新的小疣。調(diào)查結(jié)果提示：BPV感染并非全為一過性感染；BPV13亞型仍為我國外來亞型，仍需進出口檢驗檢疫部門加強對BPV的檢疫。

牛乳頭瘤病毒；智利進口奶牛；檢測與分析

隨著人們生活水平的提高，牛乳及其制品的消費量持續(xù)增長。近年來我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展迅速，從國外進口架子種牛成為各大乳牛場改善種質(zhì)資源、提高牛乳產(chǎn)能的重要手段。進口種牛對于豐富我國現(xiàn)有乳牛種群，快速提升生產(chǎn)性狀，改善原乳質(zhì)量，豐富我國牛種基因資源等具有積極意義。目前，我國種牛的主要進口國為智利、新西蘭和澳大利亞，引種前的檢疫項目主要有結(jié)核病、牛病毒性腹瀉/粘膜病、副結(jié)核、牛流行性地方性白血病、牛傳染性鼻氣管炎、藍舌病和赤羽病，但針對不同來源國，檢疫項目略有所不同。牛乳頭瘤病毒（BPV）感染常因損害皮革質(zhì)量、影響牛乳品質(zhì)或引發(fā)惡性腫瘤而造成嚴重經(jīng)濟損失[1]。在產(chǎn)地預(yù)檢和入境隔離檢疫中，BPV感染常常會出現(xiàn)因頭頸皮膚疣狀物而被剔除。

多年來，天津、河北等口岸從澳大利亞等國進口的奶牛中多次檢出BPV[2]。由于BPV通常被認為是自限性疫病，其感染和流行并沒有得到足夠的重視。因此，對于該病在進口奶牛群體中的多態(tài)性和危害水平研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，BPV的部分亞型，除了導(dǎo)致明顯的皮膚乳頭瘤外，還可能導(dǎo)致出現(xiàn)牛生殖道和消化道腫瘤，引起較嚴重后果[3]。若僅憑肉眼觀察，只能發(fā)現(xiàn)有明顯皮膚疣的BPV陽性動物，而對于乳頭瘤存在于消化道、生殖道、尿道、乳腺等內(nèi)部或隱蔽部位的陽性動物，則很難發(fā)現(xiàn)。為此，本文以智利進口種牛作為調(diào)查對象，探討各貿(mào)易國流行的BPV亞型和國內(nèi)牛BPV亞型（1和2型為主）的差異。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒（Takara）、深加工食品DNA提取試劑盒（GMO food DNA Extraction Kit）、膠回收提取試劑盒（E.Z.N.A.TMGel Extrection Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒（E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit）、pMD19-T載體、感受態(tài)細胞（DH5α）、營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、氨芐青霉素、DEPC水、EX Taq 酶（Takara）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及治療。從河北和天津兩處指定隔離場，采集陽性牛的組織及血液樣本，冷藏運輸?shù)綄嶒炇?。采集樣本時，使用手術(shù)剪逐一切除可見皮膚疣，并用碘酒消毒后，噴灑抗生素治療，1個月后觀察康復(fù)情況。

1.2.2 DNA提取。將采集的疣塊剪碎，分裝于1.5 mL離心管中，經(jīng)液氮冷凍后，用超低溫自動研磨儀將樣本打碎，放入-80 ℃超低溫冰箱備用。對血液樣本使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取DNA，對組織樣本使用GMO food DNA Extraction Kit提取DNA，方法參照試劑盒說明書。

1.2.3 PCR擴增和測序。將提取的DNA進行PCR擴增，引物為FAP59/FAP64（表1）[12]。普通PCR擴增反應(yīng)體系和擴增條件為：25 μL Ex Taq Buffer，2 μL FAP59（10 μM），2 μL FAP64（10μM），16 μL滅菌水，5 μL DNA模板；94 ℃ 10 min；45個循環(huán)：94 ℃ 90 s、50 ℃ 90 s、72 ℃ 90 s ；72 ℃5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，電泳條件為110 V/400 mA，30 min。將目的條帶進行膠回收，方法參照膠回收試劑盒說明書。將膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：5 μL Solution I，1 μL pMD19-T，4 μL膠回收產(chǎn)物，16 ℃連接3 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)。陽性菌經(jīng)M13引物鑒定，提取質(zhì)粒，進行測序。

表1 檢測用引物

1.2.4 序列分析。獲得序列后，首先去除兩端的質(zhì)粒序列；然后用NCBI 在線BLAST軟件進行分析比對，得到BPV的分型情況。為了探明智利牛和我國本地牛的BPV亞型差異，將智利牛的BPV序列和GenBank中的我國分離株的L1基因序列進行比對分析。通過對L1基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，分析相互之間的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀察和治療情況

在兩批智利牛（約4 500頭）中觀察到19頭BPV陽性牛，主要臨床表現(xiàn)為凸起于皮膚表面的呈菜花型的疣狀物，沒有觀察到不愿進食或血尿等其他臨床癥狀。在采集陽性組織樣本的同時，進行創(chuàng)面消毒和抗生素治療，1個月后觀察發(fā)現(xiàn)愈合率大于75%，有 少部分牛在創(chuàng)面以外的皮膚上有新的乳頭瘤形成。

2.2 PCR檢測情況

全部19份皮膚組織樣本的FAP-PCR均為陽性，而對應(yīng)的血液樣本均為陰性。PCR擴增后的DNA片段大小均為470 bp左右，與預(yù)定的產(chǎn)物長度一致。產(chǎn)物均成功連接克隆到pMD19-T質(zhì)粒上（圖1、圖2）。

圖1 引物FAP59/FAP64的PCR擴增結(jié)果（1）

圖2 引物FAP59/FAP64的PCR擴增結(jié)果（2）

2.3 序列分析及比對結(jié)果

序列分析表明，在全部19頭陽性牛中，有15頭感染BPV2型，另外4頭感染BPV13型。BPV2的感染率為0.3%，BPV13為0.09%（表2）。

表2 智利牛BPV感染情況

將智利分離株L1基因的序列同國內(nèi)報道的BPVL1基因序列進行多重比對和系統(tǒng)樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)智利的BPV2和我國的BPV2在L1基因上有較高的同源性（圖3），但是否存在同源重組和基因交換有待進一步分析。其主要區(qū)別在于智利BPV13的分離株數(shù)量明顯多于我國，且同源性較低。同我國復(fù)雜的BPV感染情況相比，智利的牛BPV感染具有一定的地域特征。

3 討論

圖3 L1基因系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ法，Bootstrap值500）

在進口智利牛中采集到的陽性樣本以皮膚疣為主，其感染率為0.4%，說明進口前的產(chǎn)地檢疫效果有效，大部分陽性牛在境外已被淘汰。75%以上的牛在切掉乳頭瘤1個月后不再復(fù)發(fā)，表明多數(shù)病例可以簡單治療康復(fù)。部分陽性牛在切除后，仍出現(xiàn)新的小疣，這可能和個體的易感性或免疫狀況有關(guān)。由此證明，BPV感染并非境外獸醫(yī)所述的均為一過性感染，不治而愈。值得注意的是，全部BPV陽性牛的血液樣本中均無陽性條帶，這證明了所采集的BPV感染牛均為局部皮膚感染，而非全身性感染，這也與其無其他臨床癥狀的特征相吻合。實驗采集的樣本數(shù)來自牛的頭部、頸部、面部的纖維乳頭狀瘤體，與現(xiàn)有報道的BPV2和BPV13感染的臨床癥狀相吻合[5]。FAP引物的產(chǎn)物均為BPVL1基因。L1基因的進化分析表明，智利牛的BPV同我國的BPV有顯著區(qū)別，但在BPV2之間存在較高的同源性，是否暗示有基因水平的重組和交換，需要深入研究。當前，BPV13暫非我國的主要感染亞型，外來亞型的傳入和“定殖”可能會讓國內(nèi)的BPV防控難度加大。

綜上所述，牛BPV感染主要表現(xiàn)為對皮膚的損傷，大部分陽性牛均能有效控制或治愈。但由于BPV亞型眾多，仍需進出口檢驗檢疫部門繼續(xù)加強檢疫，特別要防范外來亞型BPV13的傳入，一但發(fā)現(xiàn)病畜，應(yīng)堅決淘汰[6]。此外，應(yīng)加強研究，開發(fā)針對引起全身感染或?qū)е聬盒阅[瘤的BPV亞型的診斷方法和技術(shù)。

[1] 史巧蕓，龐峰，杜麗，等. 牛乳頭瘤病毒的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（6）：1613-1619.

[2] 張鶴曉，劉繼 ，張玉忠，等. 從進口牛中檢出纖維乳頭狀瘤[J]. 中國獸醫(yī)雜志，1992（1）：21.

[3] 王遠東，張亞軍，楊淑清. 畜禽的腫瘤及其危害[J]. 黑龍江畜牧科技，2000（2）：27-28.

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[5] 梁辰，姜曉文，劉旭，等. 牛乳頭狀瘤的病理學觀察及其病毒基因型分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2013（5）：423-425.

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（責任編輯：朱迪國）

Detection and Analysis on Papillomavirus of Breeding Cows Imported from Chile

Wang Yu1，Tang Changjie1，Xiao Hongbo2，Nie Fuping1，Ma Fei3，Yang Jun1，Chen Ranyue1，Wu Rui1
（1. Technical Center for Inspection and Quarantine，Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400044；2. Wulong Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Wulong，Chongqing 408528；3. Tanghan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tangshan，Hebei 063000）

In this article，by the means of clinical observation，sampling，PCR，clone and sequencing，the detection and genes analysis of bovine papillomavirus（BPV）were conducted towards the imported breeding cows from Chile. Results showed that the overall infection rate of BPV was 0.4%. Two subtypes consisting of BPV2 and BPV13 were detected and confirmed，between the two subtypes，BPV2 was absolutely dominant，while the cattle infected by BPV13 accounted for just 0.09%. The phylogenetic analysis ofL1gene indicated obvious geographical difference in the overall infection status between China and Chile. And the homology of BPV2L1gene was high between strains in the two countries. After treatment for BPV positive cows，75% of them were cured by surgical removal with an attachment of antibiotics. However，small new verrucas still grew up again in some cows. According to the results of investigation，BPV infection didn′t showed transient for all bovines and subtype BPV13 was still exotic for China，hence BPV inspection and quarantine needed to be further strengthened by relevant entry-exist departments.

Bovine papilloma virus（BPV）；cows imported from Chile；detection and analysis

S851.3

：B

：1005-944X（2017）05-0047-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.012

國家質(zhì)檢總局2015年度科技攻關(guān)項目（2015IK331）