寧祎 李基麗 道吉吉 王春臺 劉新瓊
摘要:營養(yǎng)缺陷型是一種生化突變株,它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。營養(yǎng)缺陷型菌株在遺傳學、食品生物技術(shù)、微生物代謝等領(lǐng)域的研究中均具有重要作用,另外它還是研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的常用材料。該研究以大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5a為實驗材料,利用紫外線(uv)對其進行誘變,并且采用青霉素法濃縮營養(yǎng)缺陷型細菌,采用逐個測定法檢出營養(yǎng)缺陷型,利用生長譜法對缺陷型菌株進行鑒定、分析,得到了4株穩(wěn)定的營養(yǎng)缺陷型突變株,分別為賴氨酸、組氨酸、精氨酸和嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。
關(guān)鍵詞:大腸桿菌;營養(yǎng)缺陷型;紫外誘變
微生物是遺傳學研究中常用的材料,常用多種方法誘發(fā)其基因突變進行遺傳育種,并且突變頻率遠遠超過自發(fā)突變。誘變劑主要包括物理誘變劑和化學誘變劑兩大類,物理誘變劑有紫外線、X-射線、γ射線、a射線,微生物誘變中常用紫外線(uv)進行物理誘變。DNA對紫外線有強烈的吸收作用,尤其是堿基中的嘧啶,紫外線能使同鏈DNA分子的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體,結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,阻礙堿基正常配對,阻礙DNA的復(fù)制或引起堿基排列順序的變化,導(dǎo)致遺傳基因發(fā)生變異,從而產(chǎn)生突變或死亡。
大腸桿菌由于其結(jié)構(gòu)簡單,遺傳背景已研究清楚,是遺傳學和分子生物學研究的極好材料。大腸桿菌紫外誘變和營養(yǎng)缺陷型菌株的選育,是遺傳學實驗中的一個重要實驗,通常情況下在本科生課堂開設(shè)該實驗,按照傳統(tǒng)的方法,很難得到理想的實驗結(jié)果。為此,筆者在多年教學的實踐基礎(chǔ)上,摸索出了一套成熟的實驗方法,能夠得到穩(wěn)定的營養(yǎng)缺陷型菌株。
1.材料與方法
1.1出發(fā)菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)菌株:DH5a。
1.2培養(yǎng)基 肉湯液體培養(yǎng)基:牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl 5g,超純水1 000mL,pH7.2,0.103 5mPa高壓滅菌15min。加倍肉湯液體培養(yǎng)基:牛肉膏6g,蛋白胨20g,Nacl 30g,超純水1 000mL,0.103 5mPa高壓滅菌15min?;竟腆w培養(yǎng)基(g/L):七水硫酸鎂0.2g,檸檬酸鈉2g,四水磷酸氫銨鈉3.5g,磷酸氫二鉀10g,葡萄糖20g,瓊脂20g,超純水1 000mL,pH7.0,0.055mPa高壓滅菌30min?;疽后w培養(yǎng)基:七水硫酸鎂0.2g,檸檬酸鈉2g,四水磷酸氫銨鈉3.5g,磷酸氫二鉀10g,葡萄糖20g,超純水1 000mL,pH 7.0,0.055mPa高壓滅菌30min。無氮基本液體培養(yǎng)基(g/L):七水硫酸鎂0.2g,檸檬酸鈉2g,磷酸氫二鉀10g,葡萄糖20g,超純水1000mL,pH 7.0,0.055mPa高壓滅菌30rain。2倍氮基本液體培養(yǎng)基:七水硫酸鎂0.2g,檸檬酸鈉2g,磷酸氫二鉀10g,硫酸銨2g,蛋氨酸0.2g,葡萄糖20g,超純水1 000mL,pH 7.0,0.055mPa高壓滅菌30min。固體完全培養(yǎng)基:牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCI 5g,超純水1 000mL,瓊脂20g,0.103 5 mPa高壓滅菌15min。
1.3主要試劑 20種基本氨基酸、7種維生素(硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙酰胺、生物素)、嘌呤、嘧啶、青霉素鈉鹽、冰醋酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、蔗糖、生理鹽水、0.1mol/L醋酸緩沖液(pH4.0)、0.1tool/L NaOH?;旌习被幔òê塑账幔┕卜?組,其中第1組到第VI組各有6種氨基酸(包括核苷酸),每種氨基酸(包括核苷酸)等量充分混合,第VII組為脯氨酸,因容易潮解,故單獨組成。各組具體組成如表1所示?;旌暇S生素:把硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙氨酸及生物素等研細.充分混合即可。
1.4菌液制備
1.4.1菌體的活化與培養(yǎng) 實驗前14-16h,挑取少量DH5a菌體,接種于盛有5mL肉湯培養(yǎng)液的三角瓶中,37℃培養(yǎng)過夜。第2天添加5mL新鮮的肉湯培養(yǎng)液,充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3-5h。
1.4.2收集菌體 將活化的菌體菌液取5mL倒入離心管中,3 500r離心10min,棄去上清液,吸入5mL生理鹽水,打勻沉淀形成懸液。
1.5紫外線誘變處理 處理前先開紫外燈(15W)穩(wěn)定30min,然后吸取菌液3mL均勻的涂布于培養(yǎng)皿內(nèi),置于紫外燈下,距燈管28.5cm處;先連蓋在紫外燈下滅菌1min,然后開蓋處理1min(處理時間依70%的殺菌率而定);照射后先蓋上皿蓋,再關(guān)紫外燈并注意避光。吸取3mL加倍肉湯培養(yǎng)液,注入處理后的培養(yǎng)皿中,37℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)18h。
1.6突變型的篩選與檢出
1.6.1青霉素法淘汰野生型 吸取5mL處理菌液于滅菌離心管中,3 500r離心10min。棄上清液,加人生理鹽水,打勻沉淀,離心洗滌3次,加生理鹽水至原體積。吸取菌液0.1mL于5mL無氮基本培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)12h。加入等體積2倍氮基本培養(yǎng)液,并加入青霉素鈉鹽使最終濃度約為1 000單位/mL,達到殺死野生型,濃縮缺陷型的目的。培養(yǎng)12、16、24h時分別取菌液0.1mL,涂布基本及完全培養(yǎng)基,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)。
1.6.2逐個測定法檢出營養(yǎng)缺陷型 以上平板培養(yǎng)36-48h后,進行菌落計數(shù)。選用完全培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)大大超過基本培養(yǎng)基的那一組,用牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長出的菌落100個,分別先點種基本培養(yǎng)基,后點種完全培養(yǎng)基,置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12h后,選擇在基本培養(yǎng)基上不生長,而在完全培養(yǎng)基上生長的菌落,再在基本培養(yǎng)基的平板上劃線,置于37℃恒溫箱培養(yǎng)。24h后不生長的可能是營養(yǎng)缺陷型。
1.7生長譜鑒定
1.7.1突變菌株的培養(yǎng)與收集 將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5mL肉湯培養(yǎng)液的離心管中,37%培養(yǎng)14-16h。培養(yǎng)后,3 500r離心10min,倒去上清液,加生理鹽水,打勻沉淀,然后離心洗滌3次,最后加生理鹽水到原體積。
1.7.2營養(yǎng)缺陷型的鑒定 吸取經(jīng)離心洗滌的菌液150uL涂布于基本固體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)皿底等分8格并標記,依次取5uL各組混合氨基酸(包括核苷酸)、混合維生素和脯氨酸分別滴于平板每格的中央。然后置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24-48h,觀察生長圈,當某一格內(nèi)出現(xiàn)圓形混濁的生長圈時,即說明是某一氨基酸、維生素或核苷酸的缺陷型。
2.結(jié)果與分析
大腸桿菌菌株DH5a經(jīng)紫外誘變處理,通過青霉素法淘汰野生型,進行生長譜測定,分別用8組不同的混合氨基酸和維生素等進行篩選,得到了4株不同營養(yǎng)缺陷型的突變菌株(圖1)。如圖1-a,在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上,分別在I號區(qū)域長出了菌落,根據(jù)營養(yǎng)成分的比較,發(fā)現(xiàn)該菌株為賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。如圖1-b,在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上,分別在Ⅱ號區(qū)域長出了菌落,通過營養(yǎng)成分的比較,推定該菌株為組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。如圖1-c,在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上,分別在I號和Ⅱ號區(qū)域同時長出了菌落,通過營養(yǎng)成分的比較,推定該菌株為精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。如圖1-d,在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上,分別在II號和VI號區(qū)域同時長出了菌落,通過營養(yǎng)成分的比較,推定該菌株為嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。
3.討論
大腸桿菌誘變處理與營養(yǎng)缺陷型篩選是普通遺傳學實驗中的一個重要實驗,大腸桿菌誘變處理的方法很多,但常用物理方法誘變處理,由于誘變之后的菌株所占的比例相當小,必須淘汰野生型的大腸桿菌菌株而篩選突變的菌株。細菌中常用的篩選方法是青霉素法,青霉素是一種殺菌劑,能夠抑制細胞壁的合成,從而可以殺死正在生長的大腸桿菌,而對不生長的大腸桿菌則沒有致死作用,因此,在含有青霉素的基本培養(yǎng)基中,野生型大腸桿菌能生長而被殺死,突變之后的菌株不能生長可被保存。隨后采用逐個測定法檢出營養(yǎng)缺陷型,并用生長譜法鑒定被初步確定為營養(yǎng)缺陷型的菌株,最終篩選營養(yǎng)缺陷型菌株。本研究利用紫外誘變處理,誘變處理的過程中防止光修復(fù)的產(chǎn)生,并且對輻射的距離和時間進行了優(yōu)化,其間經(jīng)過嚴格的篩選,獲得了4種不同的營養(yǎng)缺陷型菌株,結(jié)果通過進一步驗證,表現(xiàn)穩(wěn)定。