紫外誘變選育大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的研究

寧祎　李基麗　道吉吉　王春臺　劉新瓊

摘要：營養(yǎng)缺陷型是一種生化突變株，它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。營養(yǎng)缺陷型菌株在遺傳學、食品生物技術(shù)、微生物代謝等領(lǐng)域的研究中均具有重要作用，另外它還是研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的常用材料。該研究以大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5a為實驗材料，利用紫外線（uv）對其進行誘變，并且采用青霉素法濃縮營養(yǎng)缺陷型細菌，采用逐個測定法檢出營養(yǎng)缺陷型，利用生長譜法對缺陷型菌株進行鑒定、分析，得到了4株穩(wěn)定的營養(yǎng)缺陷型突變株，分別為賴氨酸、組氨酸、精氨酸和嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；營養(yǎng)缺陷型；紫外誘變

微生物是遺傳學研究中常用的材料，常用多種方法誘發(fā)其基因突變進行遺傳育種，并且突變頻率遠遠超過自發(fā)突變。誘變劑主要包括物理誘變劑和化學誘變劑兩大類，物理誘變劑有紫外線、X-射線、γ射線、a射線，微生物誘變中常用紫外線（uv）進行物理誘變。DNA對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，紫外線能使同鏈DNA分子的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，阻礙堿基正常配對，阻礙DNA的復(fù)制或引起堿基排列順序的變化，導(dǎo)致遺傳基因發(fā)生變異，從而產(chǎn)生突變或死亡。

大腸桿菌由于其結(jié)構(gòu)簡單，遺傳背景已研究清楚，是遺傳學和分子生物學研究的極好材料。大腸桿菌紫外誘變和營養(yǎng)缺陷型菌株的選育，是遺傳學實驗中的一個重要實驗，通常情況下在本科生課堂開設(shè)該實驗，按照傳統(tǒng)的方法，很難得到理想的實驗結(jié)果。為此，筆者在多年教學的實踐基礎(chǔ)上，摸索出了一套成熟的實驗方法，能夠得到穩(wěn)定的營養(yǎng)缺陷型菌株。

1.材料與方法

1.1出發(fā)菌種 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株：DH5a。

1.2培養(yǎng)基 肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，超純水1 000mL，pH7.2，0.103 5mPa高壓滅菌15min。加倍肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏6g，蛋白胨20g，Nacl 30g，超純水1 000mL，0.103 5mPa高壓滅菌15min?；竟腆w培養(yǎng)基（g/L）：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，四水磷酸氫銨鈉3.5g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖20g，瓊脂20g，超純水1 000mL，pH7.0，0.055mPa高壓滅菌30min?；疽后w培養(yǎng)基：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，四水磷酸氫銨鈉3.5g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖20g，超純水1 000mL，pH 7.0，0.055mPa高壓滅菌30min。無氮基本液體培養(yǎng)基（g/L）：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖20g，超純水1000mL，pH 7.0，0.055mPa高壓滅菌30rain。2倍氮基本液體培養(yǎng)基：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，磷酸氫二鉀10g，硫酸銨2g，蛋氨酸0.2g，葡萄糖20g，超純水1 000mL，pH 7.0，0.055mPa高壓滅菌30min。固體完全培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCI 5g，超純水1 000mL，瓊脂20g，0.103 5 mPa高壓滅菌15min。

1.3主要試劑 20種基本氨基酸、7種維生素（硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙酰胺、生物素）、嘌呤、嘧啶、青霉素鈉鹽、冰醋酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、蔗糖、生理鹽水、0.1mol/L醋酸緩沖液（pH4.0）、0.1tool/L NaOH?；旌习被幔òê塑账幔┕卜?組，其中第1組到第VI組各有6種氨基酸（包括核苷酸），每種氨基酸（包括核苷酸）等量充分混合，第VII組為脯氨酸，因容易潮解，故單獨組成。各組具體組成如表1所示?；旌暇S生素：把硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙氨酸及生物素等研細.充分混合即可。

1.4菌液制備

1.4.1菌體的活化與培養(yǎng) 實驗前14-16h，挑取少量DH5a菌體，接種于盛有5mL肉湯培養(yǎng)液的三角瓶中，37℃培養(yǎng)過夜。第2天添加5mL新鮮的肉湯培養(yǎng)液，充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3-5h。

1.4.2收集菌體 將活化的菌體菌液取5mL倒入離心管中，3 500r離心10min，棄去上清液，吸入5mL生理鹽水，打勻沉淀形成懸液。

1.5紫外線誘變處理 處理前先開紫外燈（15W）穩(wěn)定30min，然后吸取菌液3mL均勻的涂布于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于紫外燈下，距燈管28.5cm處；先連蓋在紫外燈下滅菌1min，然后開蓋處理1min（處理時間依70%的殺菌率而定）；照射后先蓋上皿蓋，再關(guān)紫外燈并注意避光。吸取3mL加倍肉湯培養(yǎng)液，注入處理后的培養(yǎng)皿中，37℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)18h。

1.6突變型的篩選與檢出

1.6.1青霉素法淘汰野生型 吸取5mL處理菌液于滅菌離心管中，3 500r離心10min。棄上清液，加人生理鹽水，打勻沉淀，離心洗滌3次，加生理鹽水至原體積。吸取菌液0.1mL于5mL無氮基本培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)12h。加入等體積2倍氮基本培養(yǎng)液，并加入青霉素鈉鹽使最終濃度約為1 000單位/mL，達到殺死野生型，濃縮缺陷型的目的。培養(yǎng)12、16、24h時分別取菌液0.1mL，涂布基本及完全培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.6.2逐個測定法檢出營養(yǎng)缺陷型 以上平板培養(yǎng)36-48h后，進行菌落計數(shù)。選用完全培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)大大超過基本培養(yǎng)基的那一組，用牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長出的菌落100個，分別先點種基本培養(yǎng)基，后點種完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12h后，選擇在基本培養(yǎng)基上不生長，而在完全培養(yǎng)基上生長的菌落，再在基本培養(yǎng)基的平板上劃線，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)。24h后不生長的可能是營養(yǎng)缺陷型。

1.7生長譜鑒定

1.7.1突變菌株的培養(yǎng)與收集 將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5mL肉湯培養(yǎng)液的離心管中，37%培養(yǎng)14-16h。培養(yǎng)后，3 500r離心10min，倒去上清液，加生理鹽水，打勻沉淀，然后離心洗滌3次，最后加生理鹽水到原體積。

1.7.2營養(yǎng)缺陷型的鑒定 吸取經(jīng)離心洗滌的菌液150uL涂布于基本固體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)皿底等分8格并標記，依次取5uL各組混合氨基酸（包括核苷酸）、混合維生素和脯氨酸分別滴于平板每格的中央。然后置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24-48h，觀察生長圈，當某一格內(nèi)出現(xiàn)圓形混濁的生長圈時，即說明是某一氨基酸、維生素或核苷酸的缺陷型。

2.結(jié)果與分析

大腸桿菌菌株DH5a經(jīng)紫外誘變處理，通過青霉素法淘汰野生型，進行生長譜測定，分別用8組不同的混合氨基酸和維生素等進行篩選，得到了4株不同營養(yǎng)缺陷型的突變菌株（圖1）。如圖1-a，在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上，分別在I號區(qū)域長出了菌落，根據(jù)營養(yǎng)成分的比較，發(fā)現(xiàn)該菌株為賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。如圖1-b，在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上，分別在Ⅱ號區(qū)域長出了菌落，通過營養(yǎng)成分的比較，推定該菌株為組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。如圖1-c，在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上，分別在I號和Ⅱ號區(qū)域同時長出了菌落，通過營養(yǎng)成分的比較，推定該菌株為精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。如圖1-d，在2個重復(fù)的補充培養(yǎng)基上，分別在II號和VI號區(qū)域同時長出了菌落，通過營養(yǎng)成分的比較，推定該菌株為嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。

3.討論

大腸桿菌誘變處理與營養(yǎng)缺陷型篩選是普通遺傳學實驗中的一個重要實驗，大腸桿菌誘變處理的方法很多，但常用物理方法誘變處理，由于誘變之后的菌株所占的比例相當小，必須淘汰野生型的大腸桿菌菌株而篩選突變的菌株。細菌中常用的篩選方法是青霉素法，青霉素是一種殺菌劑，能夠抑制細胞壁的合成，從而可以殺死正在生長的大腸桿菌，而對不生長的大腸桿菌則沒有致死作用，因此，在含有青霉素的基本培養(yǎng)基中，野生型大腸桿菌能生長而被殺死，突變之后的菌株不能生長可被保存。隨后采用逐個測定法檢出營養(yǎng)缺陷型，并用生長譜法鑒定被初步確定為營養(yǎng)缺陷型的菌株，最終篩選營養(yǎng)缺陷型菌株。本研究利用紫外誘變處理，誘變處理的過程中防止光修復(fù)的產(chǎn)生，并且對輻射的距離和時間進行了優(yōu)化，其間經(jīng)過嚴格的篩選，獲得了4種不同的營養(yǎng)缺陷型菌株，結(jié)果通過進一步驗證，表現(xiàn)穩(wěn)定。