孫美玲，鄒建文，徐賜棟，吳基良，李炎坤**，劉濱磊

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會生物科技股份有限公司)

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重組Ⅱ型單純皰疹病毒(OH2)基因組修飾穩(wěn)定性研究*

孫美玲1，鄒建文1，徐賜棟1，吳基良1，李炎坤1**，劉濱磊2**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會生物科技股份有限公司)

目的 探討重組Ⅱ型單純皰疹病毒(OH2)基因組修飾的穩(wěn)定性。方法 型別鑒定實驗根據(jù)I型(HSV-1)及II型(HSV-2)單純皰疹病毒gD糖蛋白基因的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，HSV-1 PCR片段上有一個MspI酶切位點，經(jīng)酶切及電泳實驗鑒別OH2病毒的型別；基因修飾實驗根據(jù)被敲除或插入的序列位點上下游病毒核酸序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳，并用電泳圖分析OH2病毒基因組中是否剔除ICP34.5基因、ICP47基因及插入hGM-CSF基因；ELISA檢測OH2上清中hGM-CSF含量驗證插入的hGM-CSF基因能否正常表達(dá)。結(jié)果 型別鑒定實驗中HSV-1經(jīng)酶切實驗出現(xiàn)130bp和70bp兩條條帶，而HSV-2和OH2病毒PCR條帶和酶切條帶均只有一條，且為200bp?；蛐揎棇嶒炛蠴H2病毒在四對引物下擴(kuò)增，能擴(kuò)增出對應(yīng)大小的條帶。ELISA實驗中hGM-CSF濃度在31.25～500pg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且OH2病毒中hGM-CSF表達(dá)量均大于2ng/mL。結(jié)論 OH2病毒中被修飾的基因穩(wěn)定地存在，同時插入的hGM-CSF基因能夠正常表達(dá)。

OH2病毒；型別鑒定；基因修飾；ELISA實驗

近年來溶瘤病毒的研究得到迅速的發(fā)展，單純皰疹病毒作為其中的一種溶瘤病毒已引起了學(xué)者們的極大關(guān)注。本研究團(tuán)隊主要致力于Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒(OH2)的研究。構(gòu)建的OH2病毒敲除了神經(jīng)毒力基因ICP34.5及免疫抑制基因ICP 47，并插入編碼人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因[1-2]。OH2病毒感染腫瘤細(xì)胞時更易產(chǎn)生合胞體，即為病毒導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)胞的融合現(xiàn)象，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜消失，成為多核巨細(xì)胞[3]。合胞體可以誘導(dǎo)加強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，在藥效學(xué)試驗中OH2病毒顯示出良好的治療效果。OH2為雙鏈DNA病毒，其基因組雖然比RNA病毒基因組穩(wěn)定，但也可能發(fā)生變異而影響OH2病毒的療效及安全性。因此，必須對OH2病毒基因組的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以確保OH2病毒抗腫瘤療效及降低危害人體的風(fēng)險。

本課題研究目的主要驗證改造后病毒基因組的穩(wěn)定性及在保證基因修飾穩(wěn)定存在的情況下，插入的hGM-CSF基因能否正產(chǎn)表達(dá)hGM-CSF。研究中涉及的實驗包括病毒基因組DNA提取、PCR產(chǎn)物酶切鑒定單純皰疹病毒的型別、PCR法鑒定OH2病毒基因修飾、細(xì)胞培養(yǎng)及ELISA檢測hGM-CSF含量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞系 Vero細(xì)胞來自正常的非洲綠猴腎上皮的細(xì)胞系，對脊髓灰質(zhì)炎病毒、SV40、麻疹病毒等多種病毒易感，該細(xì)胞系對溶瘤病毒HSV也高度易感。細(xì)胞培養(yǎng)時推薦的傳代比例為1∶4。培養(yǎng)條件為FGM(DMEM/F12培養(yǎng)基，含5%新生牛血清)，37℃恒溫，5%CO2的孵箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 病毒 Ⅰ型單純皰疹病毒17+、Ⅱ型單純皰疹病毒HG52及OH2病毒，均由本實驗室保存。

1.1.3 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)、新生牛血清(四季青)、50×TAE(Biosharp)、瓊脂糖(Biowest)、DNA Marker(Generay Biotech)、DNAzol(Bioteke corporation)、上樣5×buffer(Generay Biotech)、PCR Mix(Tran)、HSV gD基因上游引物FR1及下游引物FR2(天一致遠(yuǎn)公司合成)、MspI及對應(yīng)buffer(BioLabs)、基因修飾引物序列(天一致遠(yuǎn)公司合成)、High GC DNA聚合酶(Invitrogen)、hGM-CSF MAb(Thermo)、hGM-CSF Ab-biotin(Thermo)、Streptavidin-HRP(Thermo)、hGM-CSF(廈門特寶生物工程有限公司)、TMB顯色液(Beyotime)。

1.2 方法

1.2.1 病毒血清及DNA獲得 培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待其匯合度為100%，按MOI=0.1感染細(xì)胞。接種OH2病毒后24～48h，觀察Vero細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞完全病變，收獲OH2病毒培養(yǎng)上清并于2300rpm離心5min，吸取上清液并分裝至若干支EP管，將其放至-70℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

用DNAzol試劑提取病毒(OH2病毒及Ⅰ型單純皰疹病毒17+、Ⅱ型單純皰疹病毒HG52)DNA，提取過程嚴(yán)格按照Bioteke corporation試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 型別鑒定實驗 實驗方法為本研究團(tuán)隊建立，因此在使用本方法之前按照藥典中規(guī)定，依照定性研究的要求對各實驗的各指標(biāo)進(jìn)行驗證。

根據(jù)Ⅰ型及Ⅱ型單純皰疹病毒的保守序列g(shù)D糖蛋白設(shè)計一對引物，HSV gD 上游引物FR1：5'-TGCTCCTACAACAAGTC-3'；HSV gD 下游引物FR2：5'-CGGTGCTCCAGGATAAA-3'。設(shè)置陰性對照組H2O及野生型對照組17+ DNA、HG52 DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：94℃ 2min，(94℃ 30s，50℃ 10s，72℃ 10s)×30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、電泳后，凝膠成像，記錄實驗結(jié)果。

1.2.3 基因修飾實驗 已按照定性實驗的要求驗證。

(1)根據(jù)被修飾的基因序列設(shè)計引物

表1 修飾基因及對應(yīng)引物

(2)OH2 DNA、陰性對照(Vero DNA)及野生型對照(17+ DNA、HG52 DNA) 分別在四對引物條件下擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：96℃ 2min，(96℃ 1min，50℃ 30s，72℃ 3min)×30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、電泳后，凝膠成像，記錄實驗結(jié)果。

1.2.4 ELISA檢測hGM-CSF含量 ELISA實驗檢測hGM-CSF含量的方法為本實驗室建立和驗證。

采用夾心法，根據(jù)hGM-CSF的特性，選擇符合要求的一抗hGM-CSF MAb及二抗hGM-CSF Ab-biotin。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求被測樣品中hGM-CSF的含量,需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品濃度，分別為500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL，同時設(shè)置陰性對照(樣品稀釋液)，空白對照未包被一抗加入500pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品。所有實驗步驟按自建的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行。

最終用酶標(biāo)儀檢測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，用標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用樣品OD值參比標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中hGM-CSF含量。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物酶切鑒定單純皰疹病毒的型別實驗 單純皰疹病毒PCR產(chǎn)物電泳所得條帶約出現(xiàn)200bp陽性條帶。酶切判定：PCR產(chǎn)物用MspI酶切，出現(xiàn)約130bp和70bp兩條帶，則為Ⅰ型單純庖疹病毒。不出現(xiàn)兩條帶則為Ⅱ型單純皰疹病毒(Ⅰ型病毒片段序列nt131-134處有唯一MspI酶切位點CCGG，Ⅱ型病毒則沒有)。

如圖1(封三)所示，OH2病毒(泳道2和6)及Ⅱ型單純皰疹病毒HG52(泳道4和8)可以與Ⅰ型單純皰疹病毒(泳道3和7)區(qū)別開。

比較圖1 P9代OH2病毒及圖2(封三)P3代OH2病毒型別鑒定圖譜結(jié)果，OH2病毒在傳代過程中，基因型別未發(fā)生變化。

2.2 PCR法鑒定基因修飾實驗 引物H2D3F和BGHPAR2擴(kuò)增出的條帶大小約為2.6kp，引物CMVF和H2D3R擴(kuò)增出的條帶大小約為1.8kp，提示剔除了ICP34.5及插入了hGM-CSF表達(dá)盒。

引物H2D4F和引物47DSR3擴(kuò)增出的條帶大小約為1.7kp，引物H2D4R和引物47USF1擴(kuò)增出的條帶大小約為1.3kp，即可證明基因ICP47已被剔除。

陰性對照Vero DNA擴(kuò)增出的條帶大小能夠與OH2預(yù)期條帶大小相區(qū)別或未出現(xiàn)條帶。而野生Ⅰ型單純皰疹病毒17+及野生Ⅱ型單純皰疹病毒HG52擴(kuò)增出條帶大小與OH2預(yù)期條帶大小不同。OH2病毒經(jīng)四對引物擴(kuò)增、電泳，出現(xiàn)條帶的大小可以作為OH2基因修飾是否穩(wěn)定存在的依據(jù)。

OH2病毒基因組中敲除了基因ICP34.5及ICP47，并插入hGM-CSF基因。比較圖3(封三)P9代OH2病毒及圖4(封三)P10代OH2病毒的基因修飾結(jié)果，OH2病毒在傳代過程中修飾基因穩(wěn)定存在。

2.3 ELISA檢測hGM-CSF含量 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的log值為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品OD值為Y軸，根據(jù)5個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制出5個坐標(biāo)點，然后依據(jù)這五個坐標(biāo)點用Excel擬合出線性回歸方程，取在線性范圍內(nèi)的待測樣本OD值計算hGM-CSF的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為上清中hGM-CSF的濃度。檢測樣品中hGM-CSF含量均大于2ng/mL，說明插入的hGM-CSF基因正常表達(dá)。

表2 被測樣品中hGM-CSF含量

檢測出P10代及P1代OH2病毒中hGM-CSF含量均大于2ng/mL。

以上實驗表明，OH2病毒基因組被修飾基因穩(wěn)定存在，并且插入的hGM-CSF基因能夠正常表達(dá)。且在病毒傳代過程中，修飾的基因穩(wěn)定存在，hGM-CSF表達(dá)量穩(wěn)定。

3 討 論

腫瘤疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，而現(xiàn)有的治療往往不盡如意，且有嚴(yán)重的副反應(yīng)，因此尋找一種安全并且可靠的治療方法成為腫瘤學(xué)界一直努力的目標(biāo)。

近年來，利用單純皰疹病毒的特性經(jīng)基因重組后用于治療腫瘤成為國內(nèi)外研究的熱點。重組單純皰疹病毒的抗腫瘤效應(yīng)表現(xiàn)在選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，殺死腫瘤細(xì)胞的同時改變腫瘤生存的微環(huán)境，進(jìn)而引發(fā)一連串的宿主抗腫瘤反應(yīng)[4]。針對這一特點，有目的地改造單純皰疹病毒的基因使其能夠表達(dá)抗腫瘤蛋白并結(jié)合其他療法加強(qiáng)抗腫瘤作用。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，重組能表達(dá)血管抑制素的溶瘤單純皰疹病毒結(jié)合貝伐單抗治療腫瘤能夠促進(jìn)病毒在腫瘤組織的擴(kuò)散及細(xì)胞的溶解，增加抑制血管內(nèi)皮生長因子的血管抑素的表達(dá)和貝伐單抗誘導(dǎo)的入侵標(biāo)記蛋白，有效地誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，重組單純皰疹病毒還可與埃羅替尼等抗腫瘤藥物聯(lián)合治療惡性周邊鞘神經(jīng)轉(zhuǎn)移瘤，并在腫瘤治療模型中能夠抑制腫瘤生長及血管形成[6]。

本研究源于改造后的Ⅱ型單純皰疹病毒基因組穩(wěn)定性，Ⅱ型單純皰疹病毒相較于RNA病毒比較穩(wěn)定，但在改造過程中依然會發(fā)生基因組的變異。改造后的病毒基因組發(fā)生改變一般都會影響其生物活性，甚至用于人體后會引起嚴(yán)重不良反應(yīng)。

本課題設(shè)計不同代次OH2病毒的型別鑒定、基因修飾及ELISA檢測hGM-CSF表達(dá)量實驗，實驗結(jié)果表明修飾基因穩(wěn)定存在，并能正常表達(dá)需要的蛋白，且傳代過程不影響基因組的穩(wěn)定性。

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The Genome Stability of Recombinant Oncolytic HSV2 (OH2)

SUN Mei-ling，LI Yan-kun，LIU Bin-lei,et al

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To evaluate the genome stability of a recombinant oncolytic HSV-2 (OH2) modified with deletions for neural virulence gene ICP34.5 and immune suppressor gene ICP47,and insertion of the expression cassette for granulocyte macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF)at the ICP34.5 site. Methods The HSV-1 and HSV-2 are distinguished by restriction fragments after PCR amplification.This experiment is designed based on gD glycoprotein conserved sequence in which HSV-1 has a MspI sequence.The OH2 modifications can be identified by PCR/agrose gel analysis with the primers designed from the sequences for deletion,insertion and down/up-stream flanking regions.hGM-CSF expression in OH2 culture supernatant can be validated by ELISA.Results The HSV1 has two fragments in 130bp and 70bp by enzyme digestion in identification experiment,while HSV-2 and OH2 have only one fragment in 200bp.OH2 virus can amplify the corresponding size of the strips under the four pairs of primers amplification in genetic modification experiments.The liner of hGM-CSF in range 31.25 500pg/mL is good,and the expression of hGM-CSF is more than 2ng/mL in OH2 virus.Conclusion The modified genes in OH2 virus genome are stable,and the hGM-CSF expression can be detected.

OH2 virus;Type identification;Genetic modification;ELISA test

湖北省自然科學(xué)基金面上項目(2014CFB186)

R373

A

2095-4646(2017)02-0097-04

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.02.0097

2016-12-03)

**通訊作者，E-mail：李炎坤：10833297@qq.com；劉濱磊：1836035949@qq.com