樊琛+徐旺燁+曾慶華+王會(huì)+鄭煥芹

摘要：為獲得抗大腸桿菌Iss蛋白的抗體，將純化的GST-Iss蛋白分別免疫雛雞及小鼠。結(jié)果顯示，無免疫佐劑、弗氏佐劑免疫雛雞所產(chǎn)生的Iss抗血清效價(jià)僅為1∶100，氫氧化鋁佐劑免疫小鼠所產(chǎn)生的Iss抗血清效價(jià)為1∶60 000。Iss融合蛋白采用氫氧化鋁佐劑免疫小鼠，可獲得更強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，抗體效價(jià)更高。

關(guān)鍵詞：Iss抗體；免疫佐劑；免疫動(dòng)物

中圖分類號(hào)：S852.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）07-1307-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.027

The Influence of Immune Methods on Iss Antibody

FAN Chen1，XU Wang-ye2，ZENG Qing-hua1，WANG Hui1，ZHENG Huan-qin1

（1.Agricultural College，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract： In order to obtain the antibody against the Iss protein of E. coli，the purified GST-Iss protein was immunized to chicken and mouse respectively. The results showed that Iss antiserum titer of the immune adjuvant-free，F(xiàn)reund's adjuvant immunized chicken was just 1∶100，the aluminum hydroxide adjuvant immunized mice generated Iss titer of antiserum to 1∶60 000. The Iss fusion protein using aluminum hydroxide adjuvant immunized mice can obtain stronger humoral immune responses，antibody titer was higher.

Key words： Iss antibody； immune adjuvant； immune animal

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常稱為大腸桿菌，屬于腸道桿菌中的一種，當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境差，通風(fēng)不好，營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激等情況出現(xiàn)會(huì)誘發(fā)大腸桿菌病，為人獸共患且危害食品安全[1-3]。進(jìn)入血流是細(xì)菌發(fā)揮其致病作用的關(guān)鍵一步，在條件適合時(shí)E. coli從肺泡毛細(xì)血管進(jìn)入血循環(huán)，引起菌血癥，從而在全身組織內(nèi)增殖，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，E. coli大量繁殖引起敗血癥。一旦病原體獲得到血流的通路，它將面對(duì)血清的抑菌作用和殺菌作用[4，5]。Iss蛋白為大腸桿菌毒力島的iss基因（increased serum survival gene）所編碼的外膜蛋白，可增強(qiáng)大腸桿菌在血清中的存活能力，是大腸桿菌的重要毒力因子之一[6]。本試驗(yàn)以Iss融合蛋白為抗原，探討免疫動(dòng)物與免疫佐劑對(duì)Iss抗體產(chǎn)生水平的影響。

1 材料與方法

1.1 抗原

GST-Iss融合蛋白由聊城大學(xué)食品安全教研室進(jìn)行分離純化，溶解于PBS溶液中，其濃度為1.3 mg/mL。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡SPF雛雞購于聊城陽谷；4～6周齡小鼠為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑

碳酸鈉、碳酸氫鈉購自Biotopped公司；兔抗雞gY++（IgG）（H+IL）購自Abcam；TMB染色液購自Beyotime Biotechnology；脫脂奶粉購自伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司。

1.4 抗血清的制備

1）雞-無免疫佐劑。將1日齡SPF雛雞飼養(yǎng)14 d，分為空白、對(duì)照、試驗(yàn)3組。空白組10只，不注射；對(duì)照組10只，肌肉注射PBS溶液100 μL/只；試驗(yàn)組10只，肌肉注射融合蛋白100 μL/只（100 μg/只）。對(duì)照組及試驗(yàn)組每隔一周免疫一次，并取血直到四免，四免后5 d取血。

2）雞-弗氏佐劑。取兩支滅過菌的管，分別標(biāo)記對(duì)照組、試驗(yàn)組。對(duì)照組等量加入PBS溶液、弗氏佐劑，試驗(yàn)組等量加入融合蛋白、弗氏佐劑，乳化[7]。將1日齡SPF雛雞飼養(yǎng)14 d，分為空白、對(duì)照、試驗(yàn)3組。空白組10只，不注射；對(duì)照組10只，肌肉注射PBS溶液200 μL/只；試驗(yàn)組10只，肌肉注射融合蛋白200 μL/只（100 μg/只）。對(duì)照組及試驗(yàn)組每隔一周免疫一次，并取血直到四免，四免后5 d取血。一免佐劑為完全弗氏佐劑，二免后為不完全弗氏佐劑。

3）小鼠-氫氧化鋁佐劑。對(duì)照組等量加入PBS溶液、氫氧化鋁佐劑，試驗(yàn)組等量加入融合蛋白、氫氧化鋁佐劑，乳化[7]。4～6周齡小鼠每7 d免疫一次，連免4次，腹腔100 μL，頸后皮下、腹股溝皮下各50 μL，四免后加強(qiáng)腹腔100 μL，加強(qiáng)免后3 d眼球采血制血清。

1.5 間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至蛋白質(zhì)含量為10 μg/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次。加倍比稀釋的待檢樣品及1∶100稀釋的陰性血清0.1 mL于上述反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h。加入1∶2 000酶標(biāo)抗體0.1 mL，37 ℃孵育1 h，洗滌。加入TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃ 30 min。各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL，于450 nm處以空白調(diào)零后測(cè)各孔OD值。計(jì)算P/N≥2.1時(shí)的最高稀釋度作為抗體效價(jià)[8]。

2 結(jié)果與分析

將Iss融合蛋白無免疫佐劑按常規(guī)程序肌肉注射免疫雛雞，四免后取血經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，抗血清效價(jià)為1∶100；Iss融合蛋白加入弗氏佐劑，按常規(guī)程序肌肉注射免疫雛雞所產(chǎn)生的Iss抗血清，與無免疫佐劑時(shí)相近。Iss融合蛋白加入氫氧化鋁佐劑按常規(guī)程序免疫小鼠所產(chǎn)生的Iss抗血清效價(jià)為 1∶60 000，具體見表1。從表1可以看出，3種免疫方式所用的Iss融合蛋白免疫量相同，免疫佐劑及免疫動(dòng)物有差異。在對(duì)雛雞進(jìn)行免疫時(shí)，弗氏佐劑組與無免疫佐劑組的效價(jià)一樣，弗氏佐劑未能明顯提高Iss抗體效價(jià)。采用氫氧化鋁佐劑對(duì)小鼠進(jìn)行免疫時(shí)，Iss抗體效價(jià)達(dá)到1∶60 000，抗體效價(jià)明顯提高。

李榮貞等[8]通過對(duì)比酶聯(lián)免疫法與小鼠血清中和試驗(yàn)法所測(cè)定的破傷風(fēng)抗體效價(jià)，發(fā)現(xiàn)酶聯(lián)免疫法與中和試驗(yàn)法所測(cè)得的破傷風(fēng)抗體效價(jià)結(jié)果相關(guān)性高，酶聯(lián)免疫法測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)RSD<10%，表明酶聯(lián)免疫法真實(shí)可靠。侯偉杰等[7]以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性表皮葡萄球菌及產(chǎn)色葡萄球菌，經(jīng)甲醛37 ℃滅活，分別與鋁膠鹽、蜂膠和轉(zhuǎn)移因子混合制備鋁膠鹽佐劑疫苗、蜂膠佐劑疫苗和轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗，結(jié)果顯示，鋁膠鹽佐劑疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平在3個(gè)免疫組中最高。韓露等[9]用磷酸鋁（AP）、不同濃度磷酸鹽處理的氫氧化鋁（PTAH）以及氫氧化鋁（AH）佐劑吸附百白破抗原，檢測(cè)不同佐劑對(duì)各抗原的吸附率；制備不同佐劑類型和吸附率的制劑腹腔免疫NIH小鼠，ELISA法測(cè)定免疫后各組小鼠血清抗體滴度，結(jié)果表明，鋁佐劑吸附力不影響抗原免疫原性。鄧中華等[10]探討鋁佐劑對(duì)HBoV1 VP2 VLPs誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的影響，加明礬佐劑肌肉注射免疫，結(jié)果顯示，明礬佐劑使HBoV1 VP2 VLPs誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)而細(xì)胞免疫反應(yīng)減弱。

3 小結(jié)

在本試驗(yàn)中，分別采用雛雞與小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，氫氧化鋁、弗氏佐劑為免疫佐劑。結(jié)果顯示，加入氫氧化鋁佐劑免疫小鼠，可獲得較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，抗體效價(jià)較高。試驗(yàn)僅探討了免疫佐劑及免疫動(dòng)物對(duì)抗體產(chǎn)生水平的影響，后續(xù)試驗(yàn)可繼續(xù)以小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物、氫氧化鋁為佐劑，探討免疫劑量、免疫途徑等因素對(duì)抗體水平的影響。

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