孫 芳，任天宇，嚴(yán) 錦，段躍強(qiáng)，王希良，張紹庚，楊鵬輝

·論 著·

重組溶瘤流感病毒靶向殺傷肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

孫 芳，任天宇，嚴(yán) 錦，段躍強(qiáng)，王希良，張紹庚，楊鵬輝

目的拯救獲得重組溶瘤流感病毒株rFlu△NS/HCC，對其全面鑒定并評價(jià)特異性殺傷肝癌細(xì)胞的效果。方法利用流感病毒反向遺傳學(xué)（reverse genetics, RG）技術(shù)，以A/Puerto Rico/8/34（PR8）為載體，將NS基因部分敲除，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFlu△NS1，與流感病毒PR8的7個質(zhì)粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M共轉(zhuǎn)染MDCK和COS-Ⅰ細(xì)胞，經(jīng)拯救、篩選、鑒定獲得重組溶瘤流感病毒，命名為rFlu△NS/HCC。重組溶瘤流感病毒株rFlu△NS/HCC經(jīng)SPF雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心純化等步驟獲得重組病毒，通過血凝試驗(yàn)、RT-PCR、電鏡觀察病毒形態(tài)等方法對rFlu△NS/HCC進(jìn)行全面鑒定，并通過MTS細(xì)胞活力測定、細(xì)胞病變檢測評價(jià)重組溶瘤流感病毒對不同類型肝癌細(xì)胞系的殺傷效果。結(jié)果成功拯救重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/ HCC，血凝效價(jià)為29～10，在HpG2細(xì)胞上感染病毒滴度log10TCID50/ml為6.5。MTS和結(jié)晶紫染色檢測結(jié)果顯示，重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）≥1時，能夠顯著降低HepG2細(xì)胞活力（P均＜0.05）；MOI≥3時，對SMMC-7721細(xì)胞活力影響達(dá)顯著水平（P均＜0.05）；而不同MOI值的rFlu△NS/HCC對正常細(xì)胞L02無明顯影響。結(jié)論重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC能靶向殺傷肝癌細(xì)胞，有望為臨床肝癌靶向治療提供新的治療策略。

流感病毒；溶瘤病毒；肝癌細(xì)胞

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，病死率位居第二，每年發(fā)病接近40萬人[1]。因其惡性度高、病情進(jìn)展快，臨床上發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)患者已處于中晚期，病死率和復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[2]。溶瘤病毒是一類具有復(fù)制能力的腫瘤殺傷型病毒，能夠靶向在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制和增殖，致腫瘤細(xì)胞溶解和死亡，而不影響正常細(xì)胞，為臨床腫瘤治療提供了新思路[3-4]。目前已有包括腺病毒、Ⅰ型單純皰疹病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、水皰性口炎病毒和麻疹病毒等在內(nèi)的10余種溶瘤病毒用于腫瘤臨床研究，充分證實(shí)了溶瘤病毒在腫瘤治療領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景[5-7]。

流感病毒為單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒，反向遺傳學(xué)（reverse genetics, RG）技術(shù)易于操作且不存在潛在DNA安全性問題等優(yōu)勢，為開

發(fā)溶瘤病毒藥物提供了新思路。在前期本課題組建立了成熟的流感病毒RG平臺，基于流感病毒為載體的重組病毒株rFLU-RSV、rFLU-HAdv、rHCV/FLU均在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生良好的黏膜免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時可產(chǎn)生免疫保護(hù)效果[8-9]。本研究利用RG技術(shù)，以期獲得流感病毒PR8為載體的重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/ HCC，用MTS、結(jié)晶紫染色檢測其對肝癌細(xì)胞的體外抑制作用，為肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、病毒、雞胚 MDCK細(xì)胞、COS-Ⅰ細(xì)胞均購自美國ATCC（American Type Culture Collection）細(xì)胞庫，正常肝細(xì)胞（L02）、肝癌細(xì)胞系（SMMC-7721、HepG2）由本中心保存；流感病毒8個質(zhì)粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS均由本中心保存；流感病毒A/Puerto Rico/8/34（PR8）由本中心保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胰酶購自美國GIBCO公司；質(zhì)粒提取試劑盒和Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國QIAGEN公司；無支原體胎牛血清購自杭州四季青公司；1%雞紅細(xì)胞按常規(guī)方法自行制備；SolutionⅠ、限制性內(nèi)切酶、EX Taq聚合酶、DNTP等購自日本TaKaRa公司；基因合成、引物合成及測序均由上海生工公司完成；酶聯(lián)免疫分析儀購自美國Thermo公司；臺式掃描電鏡購自荷蘭Phenom 公司產(chǎn)品；MTS試劑盒購自美國Promega公司；結(jié)晶紫染色試劑購自北京索萊寶公司。

1.3 重組pFlu△NS1質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測分析結(jié)合序列優(yōu)化，將PR8流感病毒的NS基因片段部分缺失，設(shè)計(jì)的基因序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。合成片段與pHW2000載體進(jìn)行連接，陽性克隆測序驗(yàn)證。

1.4 重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC的拯救 依照Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，用MDCK和COS-Ⅰ細(xì)胞鋪6孔板，細(xì)胞3×105個/孔，COS-Ⅰ和MDCK比例為2∶1，2 ml/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至單層后即可轉(zhuǎn)染。用重組質(zhì)粒pFlu△NS1與PR8骨架的7質(zhì)粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA和pHW197-M均等量混合，各質(zhì)粒濃度均稀釋為250 ng/μl，轉(zhuǎn)染至MDCK和COS-Ⅰ細(xì)胞混合液中，72 h后接種雞胚，測血凝效價(jià)。

1.5 重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC的鑒定

1.5.1 血凝試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的上清液于-70 ℃反復(fù)凍融1次，接種9 d齡SPF雞胚，0.2 ml/枚，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 ～96 h后，4 ℃凍死雞胚，收集尿囊液測定血凝效價(jià)。

1.5.2 TCID50檢測 用MDCK、L02、SMMC-7721、HepG2細(xì)胞分別鋪96孔板，每孔2×104個細(xì)胞。待細(xì)胞長至單層后，重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC用無血清DMEM培養(yǎng)基按照10-1、10-2、10-3……稀釋，5 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并用1%雞紅細(xì)胞檢測細(xì)胞上清的血凝滴度。

1.5.3 RT-PCR基因鑒定 用TRIZOL法提取重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC RNA后，RT-PCR擴(kuò)增pFlu△NS1、NP、M片段，酶切，膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落，菌液PCR，測序后序列比對分析，并做PR8流感病毒NS陽性對照。

1.5.4 電鏡觀察 將第三代重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC，300 KD膜包超濾濃縮，60%和30%蔗糖密度梯度離心，經(jīng)脫糖后獲得純化病毒rFlu△NS/HCC。負(fù)染處理后，透射電鏡觀察重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC的形態(tài)與大小分布。

1.6 重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC對肝癌細(xì)胞體外抑制效果

1.6.1 MTS檢測細(xì)胞活性 選用L02、SMMC-7721、HepG2細(xì)胞分別鋪96孔板，計(jì)細(xì)胞數(shù)1.5×104個/孔，100 μl/孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至單層后將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去后，用PBS洗滌3次，加入感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）依次為0.1、1.0、3.0、5.0、10.0的重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC并設(shè)立陰性對照，吸附1 h后棄液，換新鮮DMEM培養(yǎng)基。按上述感染條件感染48 h、72 h、96 h后，每孔加入預(yù)先配好的MTS試劑，30 min后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測OD值。

1.6.2 結(jié)晶紫染色檢測細(xì)胞病變 鋪24孔板，選用L02、SMMC-7721、HepG2細(xì)胞，7×104個/孔，500 μl/孔，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至單層后將24孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去，用PBS洗滌3次，加入MOI依次為0.1、1.0、3.0的重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC感染細(xì)胞并做陰性對照，按照上述條件吸附1 h后棄液，換新鮮DMEM培養(yǎng)基，72 h后加濃度為1%的結(jié)晶紫染色液，觀察結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。不同MOI值的重組病毒組間肝癌細(xì)胞活力差異性比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pFlu△NS1的構(gòu)建 經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研、生物信息學(xué)分析、序列優(yōu)化將流感病毒的NS片段部分缺失，構(gòu)建策略（圖1A），合成片段與pHW2000連接，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pFlu△NS1（命名為5、7、10、13、14、15），片段大小為478 bp（圖1B），測序結(jié)果與預(yù)期序列相符一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1C）。

2.2 重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC的拯救 將測序正確的重組質(zhì)粒pFlu△NS1和PR8流感病毒7質(zhì)粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA和pHW197-M共轉(zhuǎn)染MDCK和COS-I細(xì)胞，成功拯救的重組溶瘤流感病毒命名為rFlu△NS/HCC。重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC經(jīng)雞胚連續(xù)傳5代，血凝效價(jià)達(dá)到29～10，分裝置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組pFlu△NS1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定A.質(zhì)粒pFlu△NS1構(gòu)建圖；B.質(zhì)粒跑膠圖，5、7、10、13、14、15是構(gòu)建質(zhì)粒pFlu△NS1，M是DNA marker ；C. 質(zhì)粒pFlu△NS1測序圖Figure 1 Construction and characterization of recombinant pFlu△NS1 plasmid

2.3 病毒TCID50檢測 用MDCK、L02、SMMC-7721、HepG2細(xì)胞鋪96孔板，每孔2×104個細(xì)胞，重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC 10-1、10-2、10-3……倍比稀釋，5 d后觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果顯示，重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC在MDCK、L02細(xì)胞的感染滴度≤1.0，而在SMMC-7721、HepG2細(xì)胞上感染滴度log10TCID50/ml為6.5。

2.4 RT-PCR基因鑒定 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增重組溶瘤病毒rFlu△NS/HCC的pFlu△NS1、NP、M片段，并做陽性對照pHW198-NS。擴(kuò)增的3個片段大小分別是478 bp、1595 bp、1056 bp，陽性對照質(zhì)粒pHW198- NS PCR擴(kuò)增片段大小為919 bp（圖2）。結(jié)果表明，重組溶瘤病毒rFlu△NS/HCC基因片段與預(yù)期大小一致，表明重組病毒拯救成功。

2.5 電鏡觀察重組病毒形態(tài) 如圖3所示，經(jīng)負(fù)染透射電鏡觀察可見重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/ HCC的病毒顆粒多數(shù)為球型，可見包膜、基質(zhì)蛋白、核心，顆粒直徑大小約80～120 nm，表明重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC的病毒形態(tài)分布和顆粒大小符合流感病毒的典型特征，約80%病毒分布在80～120 nm之間。

圖2 RT-PCR基因鑒定重組病毒rFlu△NS/HCC基因片段M. DNA marker；1. PCR pFlu△NS1片段；2. PCR pHW198-NS片段；3. PCR NP片段；4. PCR M片段Figure 2 Gene segments of rFlu△NS/HCC amplified by RT-PCR

2.6 MTS檢測細(xì)胞活力 用MOI依次為0.1、1.0、3.0、5.0、10.0的重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/ HCC分別感染肝癌細(xì)胞 SMMC-7721和HepG2，如圖4所示，在病毒感染SMMC-7721細(xì)胞后48 h，MOI為 0.1和1.0的病毒對細(xì)胞活力無明顯影響，而MOI 為3.0、5.0、10.0的病毒使細(xì)胞活力分別減少至50%、30%、12%（F=1.247，P=0.001；MOI 0.1組與MOI 1.0組比較，P＞0.05，MOI 3.0、5.0、10.0 3組間兩兩比較，P均＜0.05）；在病毒感染后72 h（F =1.468，P=0.001）和96 h（F=2.577，P=0.001），顯示了同樣變化趨勢。同樣，在病毒感染HepG2細(xì)胞后48 h，MOI為0.1的病毒對細(xì)胞活力無明顯影響，而MOI為1.0、3.0、5.0、10.0的病毒使細(xì)胞活力分別減少至25%，20%，15%，10%（F=143.8，P=0.000；組間兩兩比較，P均＜0.05）；在病毒感染后72 h（F=135.1， P=0.000）和96 h（F=107.5，P=0.000），顯示了同樣變化趨勢。各感染劑量重組病毒、不同時間點(diǎn)均對正常肝細(xì)胞L02無明顯殺傷作用。結(jié)果表明，重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC可選擇性殺傷肝癌細(xì)胞，隨著時間的延遲，肝癌細(xì)胞病變更加明顯。

圖3 電鏡觀察重組病毒rFlu△NS/HCC的病毒樣顆粒及病毒大小分布A. 電鏡觀察重組病毒rFlu△NS/HCC形態(tài)；B. 病毒顆粒大小分布Figure 3 Virus-like particle size and distribution of recombinant virus of rFlu△NS/HCC by electron microscope

圖4 重組溶瘤流感病毒在不同細(xì)胞上MTS檢測結(jié)果Figure 4 Cytopathic assay of recombinant virus of rFlu△NS/HCC on different cells

2.7 細(xì)胞病變檢測 如圖5所示，在感染劑量為3.0 MOI時，SMMC-7721細(xì)胞病變超過90%；在感染劑量為0.1、1.0、3.0 MOI時，HepG2細(xì)胞病變均超過70%，表明rFlu△NS/HCC對SMMC-7721、HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用；而各感染劑量在病毒感染后48 h對正常肝細(xì)胞L02無明顯殺傷作用，該結(jié)果與MTS結(jié)果相一致。進(jìn)一步證實(shí)了，重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC對肝癌細(xì)胞有選擇性殺傷作用，而對正常細(xì)胞無明顯影響。

圖5 不同細(xì)胞上結(jié)晶紫染色檢測結(jié)果Figure 5 Crystal violet of recombinant virus of rFlu△NS/HCC on different cells

3 討 論

肝癌是我國高發(fā)的、危害性極大的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升[10]。目前的常規(guī)治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融治療、經(jīng)肝動脈化學(xué)栓塞、放療、分子靶向治療、綜合治療等，但治療效果往往不盡人意[11-12]。因此，尋找對腫瘤組織能選擇性殺傷、不良反應(yīng)低的肝癌治療新策略，將為肝癌的靶向性治療提供里程碑式的新思路[13-14]。2015年，美國FDA首次批準(zhǔn)以單純皰疹病毒為載體的溶瘤病毒T-VEC用于黑色素瘤治療[15-16]。 而以流感病毒為載體的溶瘤病毒對肝癌細(xì)胞的選擇性殺傷作用未見報(bào)道，因此，本研究基于前期成熟的RG技術(shù)，創(chuàng)新性開展重組溶瘤流感病毒研究，并評價(jià)該病毒對肝癌細(xì)胞的選擇性殺傷效果。

我們首先對流感病毒A/Puerto Rico/8/34（PR8）的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）進(jìn)行基因改造，通過RG技術(shù)以流感病毒為載體，采用“7+1”轉(zhuǎn)染模式共轉(zhuǎn)染MDCK和COS-Ⅰ細(xì)胞，成功拯救出重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC。經(jīng)血凝試驗(yàn)、RT-PCR、TCID50、電鏡等方法證實(shí)拯救的重組溶瘤流感病毒為rFlu△NS/HCC，血凝效價(jià)達(dá)到29～10，能夠在雞胚上穩(wěn)定傳代，RT-PCR測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致。經(jīng)超濾濃縮、密度梯度離心純化后，電鏡觀察重組病毒顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)及大小分布，rFlu△NS/HCC符合流感病毒典型特征，并測得滴度達(dá)6.5 log10TCID50/ml。經(jīng)MTS檢測細(xì)胞活性、細(xì)胞病變檢測等，對溶瘤流感病毒感染肝癌細(xì)胞SMMC-7721、 HepG2、正常肝細(xì)胞 L02 的殺傷效果進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，溶瘤流感病毒可選擇性殺傷肝癌細(xì)胞，而對正常肝細(xì)胞無明顯影響。

近年來，溶瘤病毒包括新城疫病毒、單純皰疹病毒及腺病毒等一系列可用于腫瘤治療的臨床研究如火如荼，有一定的臨床治療效果，但是溶瘤病毒用于腫瘤治療面臨巨大挑戰(zhàn)。流感病毒RG技術(shù)迅猛發(fā)展，為腫瘤治療提供了新的病毒載體[17-18]。然而，人們對流感病毒的生物學(xué)特性并未完全認(rèn)識，比如經(jīng)基因改造后的病毒是否回復(fù)突變以及是否致癌尚未得到驗(yàn)證。此外，機(jī)體對流感病毒存在預(yù)存免疫現(xiàn)象，體內(nèi)存在的抗體會中和病毒，易導(dǎo)致治療效果不理想。本研究采用RG技術(shù)重組的溶瘤流感病毒rFlu△NS/HCC能夠選擇性殺傷肝癌細(xì)胞，而對正常肝組織未造成明顯影響。后續(xù)研究中我們將深入研究重組溶瘤流感病毒在荷瘤裸鼠體內(nèi)的抑瘤效果和分子機(jī)制。

綜上所述，本研究通過RG技術(shù)成功拯救獲得流感病毒為載體的重組溶瘤流感病毒rFlu△NS/ HCC，該重組病毒在體外能夠選擇性殺傷肝癌細(xì)胞系，而對正常肝細(xì)胞無明顯殺傷效果，這為肝癌靶向治療基因工程藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。最終重組溶瘤流感病毒的單一或聯(lián)合化療藥物應(yīng)用方案將有望用于肝癌臨床治療，并為其他腫瘤治療提供新思路。

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（2017-01-02收稿 2017-02-10修回）

（本文編輯 張?jiān)戚x）

Experiment of recombinant oncolytic influenza virus targecting effects on liver carcinoma cells

SUN Fang, REN Tian-yu, YAN Jin, DUAN Yue-qiang, WANG Xi-liang, ZHANG Shao-geng, YANG Peng-hui*
First Center of Hepatobiliary Surgery, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

ObjectiveTo investigate the characterization and selective anti-tumor effects of the recombinant oncolytic virus rFlu△NS/HCC on liver carcinoma cells.MethodsBy using reverse genetics (RG), a recombinant oncolytic influenza virus rFlu△NS/HCC was rescued and identified in the backbone of A/Puerto Rico/8/34 (PR8). rFlu△NS1 based on partial deletion of NS(deNS1)was constructed, which was cotransfected with the influenza virus remaining seven plasmids of PB2, PB1, PA, HA, NP, NA and M into MDCK and COS-Ⅰcells. Recombinant rFlu△NS/HCC virus were amplified by SPF chicken embryos, purified by sucrose gradient, then morphological characteristics of virus were detected with electron microscope, hemagglutination titers and viral titers. MTS and cytopathic assay were used to investigate the oncolytic targeting effects of the recombinant rFlu△NS/HCC virus on liver carcinoma cells and normal liver cells.ResultsThe hemagglutination titers of recombinant rFlu△NS/HCC virus was 29-10and the log10TCID 50/ml was 6.5 of rFlu/RSV/F virus in HepG2 cells. The results were measured by MTS assay and cytopathic assay. The recombinant rFlu△NS/HCC virus could induce selective cytotoxicity in liver carcinoma cells HepG2 at MOI of 1(P＜0.01), and SMMC-7721 at MOI of 3 (P＜0.001), without effect in the normal liver cell line (L02). In summary, the recombinant rFlu△NS/HCC virus with differment MOI didn′t effect the normal liver cell line (L02).ConclusionsThe recombinant oncolytic rFlu△NS/HCC virus can induce selective cytotoxicity in liver carcinoma cells and provide a new theoretical strategy for the clinical therapy of cancer.

influenza virus; oncolytic virus; liver carcinoma cells

R575.2

A

1007-8134(2017)02-0086-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.02.005

國家“863”計(jì)劃青年科學(xué)家專題（SS2015AA020924）

100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院肝膽外科一中心（孫芳、任天宇、嚴(yán)錦、張紹庚、楊鵬輝）；100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所（段躍強(qiáng)、王希良、楊鵬輝）

楊鵬輝，E-mail: ypenghuiamms@hotmail.com

*Corresponding author, E-mail: ypenghuiamms@hotmail.com