宋 蕊武繼鋒劉海燕欒玉靜

（1 濟(jì)南市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 山東 濟(jì)南 250002；2 公安部物證鑒定中心 北京 100038）

HPLC-MS/MS法快速檢測人血中鉤吻毒素

宋 蕊1武繼鋒1劉海燕1欒玉靜2

（1 濟(jì)南市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 山東 濟(jì)南 250002；2 公安部物證鑒定中心 北京 100038）

建立了利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）快速檢測人血中兩種鉤吻毒素（鉤吻素甲和鉤吻素子）的定性定量分析方法。采用乙腈沉淀蛋白法處理血液，HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）記錄模式，保留時(shí)間和定性離子對定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。鉤吻素甲、鉤吻素子的檢測限在0.5ng/mL，線性范圍在1ng/mL～1μg/mL，平均回收率為85.2%～98.7%。該方法樣品前處理方法操作簡便，靈敏度較高，線性范圍較寬，適用于鉤吻中毒案人血中鉤吻素甲和鉤吻素子的快速檢測。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 血 鉤吻素甲 鉤吻素子

1 引言

鉤吻（Gelsemium elegans Benth，GEB）為馬錢科（Loganiacease）、鉤吻屬（Gelsemium）植物胡蔓藤的全草，分為中國鉤吻和北美鉤吻兩種，又名斷腸草、胡蔓草、野葛、大茶藤、黃藤、大炮葉、大茶藥等。其外形似金銀花，是一種重要的中藥材，具有抗炎、祛瘀止痛、殺蟲止癢、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等活性，主要分布于我國的浙江、福建、廣東、廣西、貴州、云南和湖南等地。鉤吻的應(yīng)用歷史相當(dāng)悠久，在美國藥物索引、日本《世界的民間藥》，以及我國的《神農(nóng)本草》和《本草綱目》已有其藥用記載，其根、莖、葉經(jīng)處理后可用來治療風(fēng)濕痹痛、濕疹、神經(jīng)痛、癰腫等病癥。鉤吻全株劇毒，尤其嫩葉更毒，被認(rèn)為是世界上最毒的植物之一，人誤食后可迅速致死[1]。近年來，因誤食鉤吻而中毒死亡的案件呈逐年攀升趨勢。因此，研究用于鉤吻毒素鑒定的分析方法具有重要的意義[2]。

目前報(bào)道的鉤吻毒素檢驗(yàn)手段主要為薄層色譜法[3]、液相色譜-紫外法[4]、氣質(zhì)聯(lián)用儀法檢測[5]、pH區(qū)精制逆流色譜法[6]、固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用-同位素峰形校正檢測技術(shù)[7]等。目前各類案事件中，主要以檢驗(yàn)是否存在鉤吻素甲（Gelsemine）作為鉤吻中毒的研判依據(jù)，而事實(shí)上因鉤吻素甲也廣泛存在于其他馬錢科有毒植物（如醉魚草）中，單一的鉤吻毒素檢測無法作為鉤吻中毒的直接關(guān)聯(lián)證據(jù)[8]。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鉤吻素子（Koumine）是鉤吻總生物堿中含量最多的，其次才是鉤吻素甲[9]。因此，測定人體液、組織或血液中鉤吻素甲和鉤吻素子的含量有助于鉤吻中毒鑒定及解救方案的制定。

本研究利用HPLC-MS/MS測定方法，建立了人血液中鉤吻素甲、鉤吻素子的檢測方法，同時(shí)建立復(fù)雜基質(zhì)中鉤吻毒素標(biāo)志物的檢驗(yàn)方法，有效解決了鉤吻中毒案例中的檢驗(yàn)難題，為中毒診斷、中毒解救提供參考依據(jù)和技術(shù)支撐。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

DGU-20A高效液相色譜（日本島津公司）；4000 Q Trap液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；Centrifuge 5804高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

鉤吻素甲、鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)品購于中國科學(xué)院成都生物研究所，純度分別為99.75%、99.56%。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：精密稱取鉤吻素甲、鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于10mL容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，4℃冰箱中保存，備用。

2.2 樣本制備

空白血液：采購于血站的新鮮血液。標(biāo)準(zhǔn)溶液：取標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL?？瞻滋砑訕颖荆喝】瞻籽?1份，每份1mL，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液至濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL。

取空白血、添加樣本分別加入2mL乙腈充分混旋，超聲10min，8000rpm離心5min，過0.22μm有機(jī)過濾膜過濾后供儀器分析。

2.3 儀器檢測條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent，Eclipse Plus C18柱（4.6mm ×50mm，5μm），流動(dòng)相為A：甲醇，B：0.1%甲酸+10mM甲酸銨溶液，梯度洗脫程序如表1所示。流速0.8mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量2μL。

表1 LC梯度洗脫程序

2.3.2 質(zhì)譜條件

采用ESI正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，電離電壓5.5kv，離子源溫度550℃，霧化氣壓力55psi。鉤吻素甲、鉤吻素子的MRM離子及所需去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）如表2所示，保留時(shí)間分別為3.24、3.45min。

表2 鉤吻素甲和鉤吻素子的MRM離子及DP和CE

3 結(jié)果與討論

3.1 儀器條件的選擇

鉤吻素甲、鉤吻素子的精確分子量分別為322.17、306.17。在ESI源下，母離子篩選情況如表3所示。在Product Ion 步驟中，將不同母離子產(chǎn)生的子離子峰按峰度大小排列，鉤吻素甲及鉤吻素子母離子均定為 （M+H）+峰。

液相色譜條件的水相選擇甲酸+甲酸銨溶液，可以使目標(biāo)檢測物更易離子化，并能改善化合物的峰形。相較于甲醇，選擇乙腈作為有機(jī)相時(shí)，鉤吻素甲和鉤吻素子的色譜峰分離效果更好。

表3 鉤吻素甲和鉤吻素子的母離子篩選表

3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照本文方法檢測鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)溶液，用目標(biāo)化合物定量離子對的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到鉤吻素甲和鉤吻素子線性回歸方程分別為Y=102.33X+39.46（R2=0.9999），Y=154.5X+675.25（R2=0.9996），如圖1、圖2所示。相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，表明化合物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 鉤吻素甲的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖2 鉤吻素子的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3.3 方法的線性關(guān)系

取空白血1mL分別加入一系列濃度的鉤吻素甲和鉤吻素子準(zhǔn)液使其在每一種樣品中的添加濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL，每個(gè)濃度3個(gè)樣本，按本文方法進(jìn)行分析檢測，用目標(biāo)化合物定量離子對的峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，ng/mL）求得線性回歸，得到鉤吻素甲和鉤吻素子在血中的線性回歸方程分別為Y=91.257X-68.72（R2=0.9993），Y=158.96X-942.96（R2=0.9982），工作曲線如圖3、圖4所示。結(jié)果表明血中的鉤吻素甲和鉤吻素子在1ng/mL~1μg/mL濃度范圍內(nèi)有著良好的線性關(guān)系。

圖3 血中鉤吻素甲的工作曲線

圖4 血中鉤吻素子的工作曲線

3.4 方法的回收率

取空白血1mL，分別加入一系列濃度的鉤吻素甲、鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液使其在每一種樣品中的添加濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL，每一樣品每一濃度平行5份，按本文方法分析檢測，以測得的添加各樣品中目標(biāo)物的峰面積與對照品相同濃度峰面積的比值來計(jì)算回收率（見表4）。在線性關(guān)系的所有濃度范圍內(nèi)，平均回收率均大于85.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6.3%。結(jié)果表明該方法回收率良好。

表4 鉤吻素甲和鉤吻素子的回收率

3.5 方法的精密度考察

取空白血1mL分別加入一系列濃度的鉤吻素甲、鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液使其在每一種樣品中的添加濃度分別為10、50、500ng/mL，每個(gè)濃度平行3個(gè)樣本，在同一天內(nèi)早、中、晚時(shí)段分別用本文方法進(jìn)行分析檢測，計(jì)算目標(biāo)物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到日內(nèi)精密度。連續(xù)測3天，計(jì)算目標(biāo)物峰面積3天的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到日間精密度（見表5）。結(jié)果表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

表5 鉤吻素甲和鉤吻素子的精密度

3.6 方法的靈敏度

以信噪比10/1計(jì)，該方法鉤吻素甲、鉤吻素子的最小定量限均為1ng/mL，以信噪比3/1計(jì)，該方法鉤吻素甲、鉤吻素子的最小檢出限均為0.5ng/mL。

3.7 方法的專屬性

取空白血，加入鉤吻素甲、鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文方法進(jìn)行分析檢測，同時(shí)做空白血的對照試驗(yàn)，將兩者的圖譜進(jìn)行比較（見圖5~8）。結(jié)果在鉤吻素甲、鉤吻素子出峰時(shí)間段內(nèi)，空白檢材均未出現(xiàn)明顯的色譜峰，表明生物檢材中內(nèi)源性雜質(zhì)不會(huì)對鉤吻素甲、鉤吻素子的測定造成干擾，說明實(shí)驗(yàn)建立的方法具有較高的專屬性。

圖5 空白血液鉤吻素甲色譜圖

圖6 血添加鉤吻素甲色譜圖

圖7 空白血液鉤吻素子色譜圖

圖8 血添加鉤吻素子色譜圖

綜上，本文建立了人血中兩種鉤吻毒素（鉤吻素甲和鉤吻素子）的提取凈化和檢測方法。所建立方法操作簡便、實(shí)用性強(qiáng)、回收率高、重現(xiàn)好，能夠有效去除雜質(zhì)干擾，提取產(chǎn)物色譜圖比較干凈。血中添加標(biāo)準(zhǔn)的提取回收率均在85.2%以上，且在1ng/mL~1μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。所建立方法不受生物檢材中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾且分離度好，方法的最低檢出限為0.5ng/mL，解決了復(fù)雜基質(zhì)中鉤吻毒素的快速檢驗(yàn)難題，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中鉤吻中毒案例的診斷與鑒定。

[1]Jin GL,Su YP,Liu M,et al.Medicinal plants of the genus Gelsemium (Gelsemiaceae, Gentianales)—a review of their phytochemistry, pharmacology, toxicology and traditional use[J]. J.Ethnopharmacol.,2014(1):33-52.

[2]Zhang JY,Wang YX.Gelsemium analgesia and the spinal glycine receptor/allopregnanolone pathway[J]. Fitoterapia,2015(100):35-43.

[3]黃偉雄,李汴生,范山湖,等.應(yīng)用TLC法鑒定斷腸草中的鉤吻堿[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2008(1):60-62.

[4]丘宏強(qiáng),程昱,劉茂柏,等.人血漿中鉤吻素甲和鉤吻素子HPLC-UV測定[J].中草藥,2016(13): 2324-2327.

[5]吳惠勤,黃春華,黃曉蘭,等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測尿液中15種有毒生物堿[J].分析測試學(xué)報(bào),2013(9):1031-1037.

[6]Su YP,Shen J,Xu Y,et al.Preparative separation of alkaloids from Gelsemium elegans Benth. using pH-zone-refining countercurrent chromatography[J].J.Chromatogr. A,2011(23):3695-3698.

[7]羅達(dá)龍.固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合同位素峰形校正檢索技術(shù)分析鉤吻中的鉤吻堿和鉤吻堿子[J].藥物分析雜志,2016(1):96-101.

[8]龍軍標(biāo),周金森,梁志軒.一起誤食斷腸草引起家庭性食物中毒的調(diào)查分析[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2013(12):1472-1473.

[9]葉麗香,蘇燕評,曹大炫,等.UPLC測定鉤吻素子的含量及其水溶液穩(wěn)定性[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2015(4):471-474.

（責(zé)任編輯：孟凡騫）

Rapid Determination of Gelsemine and Koumine in Blood by HPLC-MS/MS Technique

SONG Rui1WU Ji-feng1LIU Hai-yan1LUAN Yu-jing2
(1 Institute of Criminal Science and Technology of Jinan Bureau of Public Security Shandong Jinan 250002; 2 Institute of Forensic Science Ministry of Public Security P.R.C. Beijing 100038)

A qualitative and quantitative analysis method of rapid determination of the gelsemine and koumine in blood by HPLC-MS/MS technique is established. Gelsemine and koumine in blood were extracted by acetonitrile and determined by HPLC-MS/MS. The qualitative analysis was based on retention time and MRM ions. The quantitative analysis was based on a calibration curve. The detection limits of gelsemine and koumine were 0.5ng/mL. The linear curve covered the range of 1ng/mL～1μg/mL and the average recovery rate was 85.2%～98.7%. The HPLC-MS/MS method, which is simple, sensitive and has a wide linear range, can be applied to the rapid detection of gelsemine and koumine in human blood.

HPLC-MS/MS Blood Gelsemine Koumine

D918.92

A

2095-7939(2017)02-0103-04

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.02.021

2016-12-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81273346）。

宋蕊（1988-），女，山東菏澤人，山東省濟(jì)南市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所初級工程師，主要從事刑事毒物毒品分析研究。