范美婧，陳媛，蔡興航，臧小丹，岳崇慧，孫琦，于廣吉，于國(guó)萍

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽(yáng)712046）

不同處理方式對(duì)乳中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

范美婧1，陳媛1，蔡興航2，臧小丹1，岳崇慧1，孫琦1，于廣吉1，于國(guó)萍1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽(yáng)712046）

利用青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒對(duì)乳中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)乳中β-內(nèi)酰胺酶的保存時(shí)間、滅菌方法和酸堿處理對(duì)其穩(wěn)定性影響進(jìn)行了研究，從而對(duì)乳中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性進(jìn)行全面的評(píng)估。結(jié)果表明，青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳中的β-內(nèi)酰胺酶的最低檢測(cè)限為2 U/m L。樣品儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)β-內(nèi)酰胺酶的活性越小，并且減小程度與溫度正相關(guān)。常規(guī)滅菌方法均不能使β-內(nèi)酰胺酶徹底失活，酸堿處理對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的抑制，其中堿性條件下比酸性條件下抑制作用強(qiáng)。

快速檢測(cè)；β-內(nèi)酰胺酶；乳；穩(wěn)定性

0 引言

隨著物質(zhì)生活的極大提高，牛奶的質(zhì)量安全受到人們的關(guān)注，有不法生產(chǎn)者在牛奶中加入生物解抗劑，為了掩蓋抗生素的殘留，這種解抗劑就是從微生物中提取的β-內(nèi)酰胺酶[1-4]，它能對(duì)青霉素產(chǎn)生破壞或抑制作用。，這可使消費(fèi)者對(duì)抗生素類藥物耐藥性增高，抵抗傳染病的能力降低，給消費(fèi)者的身體健康帶來(lái)危害[5-7]。

現(xiàn)已有許多針對(duì)于β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法[8-10]。而少有針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性的相關(guān)研究，本文采用快速檢測(cè)試劑盒[11]對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)市售牛奶制品的加工工藝及貯存方式，本實(shí)驗(yàn)選取保存時(shí)間、滅菌方法和酸堿處理[12-14]三個(gè)條件進(jìn)行研究，根據(jù)結(jié)果對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的潛在危害性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為我國(guó)乳品行業(yè)衛(wèi)生質(zhì)量管理提供安全保障和理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與設(shè)備

β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品(P0389-1 KU)，青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品（25 g），青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒，pH計(jì)。

1.2方法

1.2.1 檢測(cè)方法

北京優(yōu)尼賽斯科技有限公司提供的青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒，具體操作步驟：將孵育器溫度調(diào)節(jié)至40℃，取5個(gè)玻璃試劑瓶，用移液器吸取400μL樣品加入到玻璃試劑瓶中，將加入樣品的玻璃試劑瓶放置于孵育器上溫育45 min。待溫育結(jié)束后，從玻璃試劑瓶中吸取200μL待檢樣品置于微孔中，反復(fù)抽吸幾次，使混合液均勻變成粉色。將微孔放入孵育器中溫育3 min，溫育結(jié)束后，將試劑條插入微孔中，繼續(xù)溫育3 min，溫育結(jié)束后，取出試劑條，觀察結(jié)果。判定方式如表1所示。

表1 判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 最低檢測(cè)限的確定

將β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品加入到牛奶樣品中，配制含量分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3，4 U/mL的樣品，然后用青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒分別對(duì)其檢測(cè)，確定試劑盒最低檢測(cè)限。

1.2.3 貯存溫度和時(shí)間對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

步驟同1.2.1，配制β-內(nèi)酰胺酶終濃度分別達(dá)到2，2.5，3和4 U/mL。然后將其分別置于-18～-20，4，25和37℃無(wú)菌條件下貯藏1周，期間每1天用青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 滅菌方法對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

步驟同1.2.1，配置濃度為2，4，6，8，10，20，30，40 U/mL的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品的牛奶樣品，分裝到10 mL的試管中，如表2所示的滅菌方法[15]進(jìn)行處理，再通過(guò)青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

表2 滅菌方法對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

1.2.5 酸堿處理對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的影響

步驟同1.2.1，配制濃度為2，3，4，5，6 U/mL的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品的牛奶樣品，分別裝到10 mL的離心管中，用濃度為1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液分別將其pH值調(diào)制至3，4，5，6，7和8。再通過(guò)青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒最低檢測(cè)限的確定

用青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒分別對(duì)樣品檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，當(dāng)溶液濃度≥2 U/mL時(shí)，能檢測(cè)出有β-內(nèi)酰胺酶。所以，青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒的最低檢測(cè)限為2 U/mL。

表3 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)限的測(cè)定

2.2貯存溫度和時(shí)間對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

用青霉素活性檢測(cè)試劑條檢測(cè)奶樣，檢測(cè)周期為1天1次，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

表4 不同溫度下貯存不同時(shí)間后β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性

由表4可以看出，在-18～-20℃和4℃下貯存1周，各個(gè)濃度的牛奶樣品都能檢出β-內(nèi)酰胺酶，貯存2周，仍能檢出（表內(nèi)未列出），說(shuō)明低溫貯存條件對(duì)牛奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的活性基本沒有影響。在25℃下貯存1周，濃度為2.5，3，4 U/mL的牛奶樣品1周內(nèi)均能檢出β-內(nèi)酰胺酶；濃度為2 U/mL的樣品，貯存6 d已無(wú)法檢出。在37℃下貯存1周，濃度為3 U/mL和4 U/mL的樣品，一周內(nèi)均能檢出β-內(nèi)酰胺酶；濃度為2.5 U/mL的樣品，貯存第6天時(shí)已無(wú)法檢出；濃度為2 U/mL的樣品，貯存第3天時(shí)已無(wú)法檢出。

比較25℃和37℃條件下的牛奶樣品，濃度為3 U/mL和4 U/mL的牛奶樣品基本沒有變化，分析低濃度2 U/mL的樣品，37℃條件下的樣品第3天開始就無(wú)法檢出，25℃從第6天開始無(wú)法檢出。隨著貯存時(shí)間的增長(zhǎng)，牛奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的活性呈下降趨勢(shì)。同時(shí)說(shuō)明隨著貯存溫度的升高，加速了β-內(nèi)酰胺酶的活性減少，但沒有完全失活。

2.3滅菌方法對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

用青霉素活性檢測(cè)試劑條檢測(cè)不同滅菌方法的牛奶樣品，結(jié)果如表5所示。

表5 63，75，100和121℃下β-內(nèi)酰胺酶酶活的變化

由表5可以看出，在63℃和75℃加熱30 min和1 h時(shí)，當(dāng)含β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品的牛奶樣品濃度為2，4，6，8 U/mL時(shí)，均未檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶。當(dāng)牛奶樣品濃度為10 U/mL和20 U/mL時(shí)，均檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶，這說(shuō)明巴氏滅菌（63℃和75℃）方法對(duì)低濃度的β-內(nèi)酰胺酶有一定的滅活作用，而對(duì)于高濃度的β-內(nèi)酰胺酶即大于10 U/mL時(shí)，巴氏滅菌方法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的滅活作用不明顯。

在100℃加熱不同時(shí)間時(shí)，當(dāng)牛奶樣品含β-內(nèi)酰胺酶的濃度為2，4，6，8 U/mL時(shí)，均未檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶。當(dāng)牛奶樣品濃度大于10 U/mL時(shí)，加熱處理時(shí)間小于30 min后，均檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶，但是從試劑條中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度為10 U/mL時(shí)，第二個(gè)指示橫杠顏色隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)明顯變淺，說(shuō)明β-內(nèi)酰胺酶的活性在較高溫度隨著時(shí)間的增加而有所降低。

而對(duì)于121℃條件，當(dāng)濃度為10 U/mL和20 U/mL時(shí)，牛奶樣品在121℃下加熱處理15 s，1 min，10 min后，β-內(nèi)酰胺酶被檢測(cè)出，而加熱30 min后，β-內(nèi)酰胺酶未被檢測(cè)出。將濃度增至30 U/mL和40 U/mL，在121℃下加熱處理30 min后，β-內(nèi)酰胺酶被檢測(cè)出（結(jié)果未列出）。說(shuō)明在超高溫度下處理牛奶樣品對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的活性影響較大。

2.4酸堿處理對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

用青霉素活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)對(duì)酸堿處理的含β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品的牛奶樣品，結(jié)果如表6所示。

表6 在不同pH值下β-內(nèi)酰胺酶酶活的變化

由表6可以看出，當(dāng)pH值為6和7時(shí)，所有濃度的含β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品的牛奶樣品均被檢出，且被檢出的最低濃度與試劑盒最低檢測(cè)限相同，均為2 U/mL。當(dāng)pH值為5時(shí)，青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒在β-內(nèi)酰胺酶濃度為3 U/mL時(shí)才檢出，牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢測(cè)限升高，可能是酸性條件下導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶活力降低。當(dāng)pH值為3和4時(shí)，青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒在β-內(nèi)酰胺酶的濃度為4 U/mL時(shí)才檢出，牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢測(cè)限進(jìn)一步升高，但β-內(nèi)酰胺酶仍具有一定的活性。說(shuō)明隨著pH值的降低，β-內(nèi)酰胺酶的活性有所減弱。當(dāng)pH值為8時(shí)，青霉素酶活性檢測(cè)試劑盒在β-內(nèi)酰胺酶的濃度為5 U/mL時(shí)才檢出，牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺酶活性大幅度降低，且下降速率比酸性條件快，說(shuō)明酸或堿性條件均對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有破壞作用。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)快速檢測(cè)試劑盒對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，分別對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的保存時(shí)間、滅菌方法和酸堿處理進(jìn)行研究。

（1）隨著貯存時(shí)間的增加，β-內(nèi)酰胺酶的活性減小，并且減小程度與溫度成正相關(guān)。但是活性沒有完全喪失，表明β-內(nèi)酰胺酶在乳中有很高的穩(wěn)定性。

（2）對(duì)于滅菌方法，巴氏滅菌及短時(shí)間煮沸對(duì)β-內(nèi)酰胺酶無(wú)明顯影響，長(zhǎng)時(shí)間煮沸和高溫對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的滅活效果，表明β-內(nèi)酰胺酶有很強(qiáng)的耐熱性，一些滅菌方法都不能徹底的使β-內(nèi)酰胺酶失活。

（3）酸堿處理對(duì)乳中β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的抑制作用，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)酸具有較強(qiáng)的耐受性，堿的抑制作用比酸的強(qiáng)，說(shuō)明β-內(nèi)酰胺酶在酸乳制品仍能表現(xiàn)出較高活性。

本研究的意義在于表明如果原料乳中含有β-內(nèi)酰胺酶，以此為原料制備的牛奶制品，在生產(chǎn)加工后仍會(huì)有殘留，尤其是低溫巴氏奶，這對(duì)消費(fèi)者的健康是極大的威脅，所以我們應(yīng)從源頭抓起，對(duì)原料乳的質(zhì)量安全進(jìn)行監(jiān)控，從而減少β-內(nèi)酰胺酶對(duì)消費(fèi)者的危害。

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Effect of different treatment on the stability ofβ-lactamase in milk

FAN Meijing1,CHEN Yuan1,CAIXinghang2,ZANG Xiaodan1,YUE Conghui1,SUN Qi1, YU Guangji1,YU Guoping1
(1.College of food science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China；2.Shanxi University of Chinese Medicine,Shannxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal,Xianyang 712046，China)

The stability ofβ-lactamase in milk was detected with Penicillin activity detection kit in this study,and the effect ofthe hold time, sterilization methods and acid or alkaline environment on stability ofβ-lactamase in milk were studied respectively.A comprehensive assess?ment of the stability ofβ-lactamase was conducted finally.As a result,the detection limit ofβ-lactamase in milk is 2 U/mL when used the method of penicillin activity detection kit.The activity ofβ-lactamase was reduce as the hold time increase,the correlation between the de?crease degree of activity ofβ-lactamase and temperature was positively.The conventional sterilization methods could not completely make β-lactamase inactivated.There were different degrees of inhibition forβ-lactamase under acid or alkaline environment,wherein the inhibi?tion of alkaline treatmentwere stronger than thatofacid.

rapid detection;β-lactamase;stability

Q93-33

A

1001-2230（2017）04-0008-03

2016-09-13

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD18B00）。

范美婧（1992-），女，碩士，從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

于國(guó)萍