一種快速測(cè)定硫酸黏桿菌素注射液含量的方法

馬碧峰，羅永祥，李林

（湖南圣雅凱生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

試驗(yàn)研究

一種快速測(cè)定硫酸黏桿菌素注射液含量的方法

馬碧峰，羅永祥，李林

（湖南圣雅凱生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

［目的］為建立快速測(cè)定硫酸黏菌素注射液中粘菌素含量的方法。［方法］利用紫外-可見分光光度計(jì)法，以多粘菌素為對(duì)照品，在堿性環(huán)境下，能夠與硫酸銅發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成紫紅色的絡(luò)合物，最大吸收波長(zhǎng)為560nm。取10mL樣品供試液于25mL容量瓶中，加入2mL氫氧化鈉溶液和1mL硫酸銅溶液，并加水定容至刻度，30℃保溫15min后過濾，以純水為空白在560nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。［結(jié)果］粘菌素回歸方程為y=0.0085x+0.0184，R2=0.9953，線性范圍為20mg～80mg，加標(biāo)回收率為（n=6）100.0%。［結(jié)論］該方法測(cè)定準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，適用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)硫酸黏桿菌素注射液的快速測(cè)定，提高企業(yè)效率。

快速測(cè)定；硫酸粘菌素；紫外-分光光度法

硫酸黏菌素為白色至微黃色粉末，無(wú)臭或幾乎無(wú)臭、有引濕性，易溶于水，微溶于乙醇，幾乎不溶于三氯甲烷或乙醚[1]。硫酸黏桿菌素是由多粘桿菌產(chǎn)生，對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)抗菌作用，用于治療革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病，用作飼料添加劑，且有明顯促生長(zhǎng)作用[2]。農(nóng)業(yè)部已于2016年11月1日起禁止將硫酸粘菌素用作飼料添加劑[3]，硫酸黏菌素注射液將成日后使用的主要形式。硫酸粘菌素在2015版獸藥典中規(guī)定依舊采用抗生素微生物檢定法進(jìn)行測(cè)定，但生物效價(jià)法測(cè)定歷時(shí)較長(zhǎng)，且操作十分復(fù)雜，在企業(yè)規(guī)模生產(chǎn)安排中屬于明顯短板環(huán)節(jié)，而利用紫外-可見分光光度法[4]能夠高效率快速測(cè)定硫酸粘菌素的含量[5]，方法簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，可應(yīng)用于企業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中，提升企業(yè)效率。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新制純化水，3mol/L氫氧化鈉溶液（分析純，西隴化工股份有限公司），5%硫酸銅溶液（分析純，廣東光華科技股份有限公司），硫酸黏桿菌素注射液（規(guī)格5mL：0.1g，湖南圣雅凱生物科技有限公司），粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)30327-200305，中國(guó)藥品生物檢定所，每mg含22106單位）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取粘桿菌素標(biāo)準(zhǔn)品400.0 mg，用純水于100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度。

100 mL容量瓶，25 mL容量瓶，10 mL容量瓶，常用體積刻度吸管，電子天平（島津AUW-220D），水浴鍋（北京永光明DZKW-S-4），紫外-可見分光光度計(jì)（島津UV-1800）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取 5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL、15.0 mL以及20.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL棕色容量瓶中，并按順序加入3mol/L的氫氧化鈉溶液2mL和5%的硫酸銅溶液1 mL，邊加邊振搖，用純水稀釋至刻度，搖勻，將容量瓶置于30℃水浴中15 min，之后過濾，取續(xù)濾液，在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以該處吸光度A對(duì)粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（m，mg）線性歸回方程。

1.3 樣品的測(cè)定

精密吸取5.0mL硫酸黏桿菌素注射液樣品于25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，作為供試樣品液。

精密吸取10.0 mL供試樣品液于25 mL容量瓶中，按順序加入3 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL和5%的硫酸銅溶液1 mL，邊加邊振搖，用純水稀釋至刻度，搖勻，將容量瓶置于30℃水浴中15 min，之后過濾，取續(xù)濾液，在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，將測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，求得硫酸黏桿菌素注射液中粘菌素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

多粘菌素是一種多肽類抗生素，能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)顯色，雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生的紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。取一定量粘菌素用純水溶解，以純水為空白對(duì)含硫酸粘菌素溶液和不含硫酸粘菌素溶液使用氫氧化鈉和硫酸銅溶液進(jìn)行處理，并用紫外-可見分光光度計(jì)在一定波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，經(jīng)查看分析確定最終測(cè)定波長(zhǎng)為560 nm。

2.2 氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液的正交實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備液于25mL容量瓶中，按順序加入氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液，氫氧化鈉溶液濃度為1 mol/L、2 mol/L和3 mol/L，硫酸銅溶液濃度為1%、3%和5%，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，由結(jié)果可得在加入3 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL以及5%硫酸銅溶液1mL時(shí)該處吸光度有最大值，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。

表1 氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 氫氧化鈉溶液和5%硫酸銅溶液的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 溫度的選擇

精密吸取10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)曲線制備液于25 mL容量瓶中，按順序加入2 mL的氫氧化鈉溶液和1 mL硫酸銅溶液，并用純水定容至刻度。分別在10～50℃水浴保溫15 min進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 溫度選擇實(shí)驗(yàn)

由表3可知，在水浴溫度30℃時(shí)，本實(shí)驗(yàn)在560nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度值最大，因此選定30℃作為實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

2.4 穩(wěn)定性考察

精密量取10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)曲線制備液于25 mL容量瓶中，加入3 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL和5%的硫酸銅溶液1 mL，邊加邊振搖，用純水稀釋至刻度，搖勻，將容量瓶置于30℃水浴中15 min，之后濾過，取續(xù)濾液，在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每10min測(cè)定一次，結(jié)果如表4所示。

表4 實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性考察

由表4可知，在反應(yīng)結(jié)束后的30min之內(nèi)，溶液性質(zhì)基本保持穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果變化小，整體來(lái)看略有下降的趨勢(shì)，但變化甚微，基于對(duì)最佳結(jié)果的考慮，應(yīng)于反應(yīng)完成后，盡快進(jìn)行測(cè)定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照實(shí)驗(yàn)方法做吸光度A對(duì)多黏菌素質(zhì)量（m，mg）線性回歸方程，結(jié)果如表5所示。

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值

由表5得到線性回歸方程y=0.0085x+0.0184，相關(guān)系數(shù) R2=0.9953，表明粘菌素在供試質(zhì)量20mg～80mg的范圍內(nèi)線性良好。

2.6 測(cè)定方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證

精確吸取12.5mL多粘菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備液于已量取5.0mL供試品的25mL容量瓶中，用純水定容至刻度。準(zhǔn)確吸取10mL該溶液加入供試液中，按確定試驗(yàn)條件進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，方法的平均回收率（n=6）為100.0%，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)吸光度測(cè)定結(jié)果如表6所示。

表6 準(zhǔn)確度測(cè)定實(shí)驗(yàn)吸光度值

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該快速測(cè)定方法待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品線性符合要求，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度符合要求，經(jīng)筆者多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品含量測(cè)定吸光度值變化較小，方法重現(xiàn)性較好，說明用紫外-分光光度法測(cè)定硫酸粘桿菌素注射液的含量方法可行，實(shí)際生產(chǎn)過程中測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以采取單點(diǎn)外標(biāo)法進(jìn)行定量。該方法能夠適用于規(guī)?；a(chǎn)硫酸黏桿菌素注射液中間環(huán)節(jié)的快速檢測(cè)中，提高企業(yè)效率?！?/p>

[1]中國(guó)獸藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)獸藥典[M].1部.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[2]李德培.抗革蘭氏陰性菌促長(zhǎng)藥物——粘桿菌素[J].獸藥與飼料添加劑，1999，4（1）：21-24.

[3]農(nóng)業(yè)部（2428號(hào)）.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告2428號(hào)[S].

[4]中國(guó)獸藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)獸藥典[M].1部.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[5]石曉光，丁瑜，周曉紅，等.紫外-可見分光光度法快速測(cè)定硫酸粘桿菌素E[J].吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，28（5）：41-42.

S859.79

A

1006-4907（2017）02-0033-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.02.015

2017-03-15