高 杉 楊愛馥 董 穎 王 擺 陳 仲 蔣經(jīng)偉 關(guān)曉燕姜 北 孫紅娟 周遵春

(遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院, 遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連 116023)

仿刺參“化皮病”體壁組織DNA 甲基化的MSAP 分析

高 杉 楊愛馥 董 穎 王 擺 陳 仲 蔣經(jīng)偉 關(guān)曉燕姜 北 孫紅娟 周遵春

(遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院, 遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連 116023)

利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation-sensitive amplified polymorphism, MSAP)技術(shù)分析了健康仿刺參(Apostichopus japonicus)體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁DNA序列中CCGG位點(diǎn)的甲基化情況。結(jié)果顯示, 健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁總甲基化水平分別為(18.60±5.61)%、(26.70±6.82)%和(19.53±3.34)%, 其中全甲基化水平分別為(13.97±4.86)%、(20.08±5.26)%和(15.42±2.61)%, 半甲基化水平分別為(4.63±3.59)%、(6.62±3.80)%和(4.11±2.08)%。“化皮病”仿刺參病變體壁總甲基化水平和全甲基化水平顯著高于健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參正常體壁(P＜0.05), 健康仿刺參體壁與“化皮病”仿刺參正常體壁總甲基化水平和全甲基化水平差異不顯著(P＞0.05); 三者的半甲基化水平無顯著差異(P＞0.05)。因此, 推測仿刺參體壁“化皮”與DNA甲基化有關(guān)。

仿刺參; 體壁; 甲基化; MSAP; 化皮病

DNA甲基化(DNA methylation)是表觀遺傳學(xué)重要的修飾方式之一, 主要是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下, 將由S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶C5位上, 形成5-甲基胞嘧啶的過程[1], 也有少量轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的N-6位和鳥嘌呤的N-7位形成N6-甲基腺嘌呤和N7-甲基鳥嘌呤[2,3]。DNA甲基化可以在不改變DNA序列的情況下通過基因沉默等方式調(diào)控基因的表達(dá)[4,5], 在X染色體失活[6]、進(jìn)化[7]、腫瘤的產(chǎn)生[8]、基因印記[9]等生物過程中發(fā)揮重要的作用。DNA甲基化在細(xì)菌、植物、水產(chǎn)動物及人類(Homo sapiens)中有較廣泛研究: 細(xì)菌可以通過DNA甲基化的方式調(diào)控母細(xì)胞基因的表達(dá), 使子細(xì)胞更適應(yīng)環(huán)境[10]; DNA甲基化在調(diào)控高粱(Sorghum bicolor)的基因表達(dá)方面可能有重要的作用[11]; Cd2+和Pb2+的離子種類、濃度和作用時間與泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)DNA的甲基化水平有相關(guān)性[12]; 人類DNA甲基化與DNA損傷應(yīng)答之間聯(lián)系緊密[13]等。DNA甲基化在海洋無脊椎動物中的研究主要集中在DNA甲基化在生物不同組織之間的差異[14,15], 以及對環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制方面[16]。

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation-sensitive amplified polymorphism, MSAP)技術(shù)是在擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一種簡便可靠的DNA甲基化檢測技術(shù)。對胞嘧啶甲基化敏感性不同的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能識別并切割CCGG序列, 分別與對甲基化不敏感的EcoRⅠ組成兩對內(nèi)切酶, 經(jīng)過將DNA雙酶切、連接接頭、兩步PCR、凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)步驟后可以得到不同的特異性擴(kuò)增圖譜, 可以通過圖譜判斷甲基化的存在及狀態(tài)。盡管對非CCGG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基化有著無法檢測的局限性, 但相比于其他DNA甲基化檢測技術(shù), MSAP具有通用性強(qiáng)、操作簡單、效率高, 且無論有無基因組背景信息, 均可通過檢測獲得豐富的甲基化位點(diǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn), 因此受到廣泛應(yīng)用。

仿刺參(Apostichopus japonicus)又稱刺參, 是我國北方重要的增養(yǎng)殖品種之一, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖池塘的老化、集約化程度的提升, 仿刺參在養(yǎng)殖過程中時有病害發(fā)生, 仿刺參“化皮病”(腐皮綜合征)就是其中之一, 該病具較強(qiáng)的傳染性、較廣的波動性和較高的死亡率, 大量病原學(xué)研究表明, 燦爛弧菌(Vibrio splendidus)是其主要病原之一[17], 并常伴以霉菌和寄生蟲產(chǎn)生繼發(fā)性感染[18], 感染初期的仿刺參表現(xiàn)為厭食、“搖頭”、并對外界反應(yīng)遲鈍, 感染中期仿刺參表現(xiàn)為體壁“化皮”(白點(diǎn)狀潰瘍)、排臟, 感染后期仿刺參“化皮”的體壁逐漸惡化為大面積腐爛,直至死亡。本文以仿刺參為試驗(yàn)材料, 應(yīng)用MSAP技術(shù)檢測和分析健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁的甲基化程度的差異, 以期為研究仿刺參“化皮”過程中的分子調(diào)控機(jī)制積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)幼參(10—12) g取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心, 于育苗池暫養(yǎng)一周, 暫養(yǎng)期間持續(xù)充氣, 水溫12℃左右, pH 8.1—8.3, 鹽度32, 每日換水量25%。

試驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的燦爛弧菌感染仿刺參[19,20], 燦爛弧菌于2216E培養(yǎng)基中在28℃下培養(yǎng)24h, 10000 r/min離心分離后收集。

1.2 菌液刺激及樣品收集

將80只健康幼參等量分為兩組, 分別放入兩個長方形水族箱中(長0.80 m, 寬0.45 m, 高0.45 m), 其中一組為健康組, 每日換水量為25%; 另一組為“化皮病”組, 在每只幼參背部體壁用解剖刀輕劃0.5 cm× 0.5 cm小口(頭部下方), 并投入收集的菌液, 使養(yǎng)殖水體菌液終濃度為5×109CFU/mL, 每日換水量為25%, 并補(bǔ)充適量菌液維持菌液濃度。每日觀察“化皮病”組仿刺參體壁(非切口處)是否發(fā)生病變(化皮)。當(dāng)仿刺參體壁出現(xiàn)兩處化皮部位(非切口處, 化皮部位直徑大于0.2 cm)時開始取樣, 健康仿刺參的體壁及“化皮病”仿刺參病變體壁和同一個體的正常體壁取樣方法參照Yang等[21]。累計(jì)收集15只健康仿刺參的體壁, 以及15只“化皮病”仿刺參的病變體壁和正常體壁。每次將收集的樣品投入液氮中迅速冷凍后, 放入–80℃冰箱中保存。

1.3 DNA提取

采用海洋動物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取DNA, Implen NanoPhotometer核酸蛋白分析儀(德國)檢測DNA的質(zhì)量和濃度, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物和接頭

所有引物和接頭均由深圳華大基因科技有限公司合成。引物和接頭序列見表 1。

表 1 MSAP中所用的接頭與引物序列Tab. 1 Adapters and primers used for MSAP analysis

1.5 MSAP分析

在Xiong等[22]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改。每個樣品設(shè)置EcoRⅠ+MspⅠ和EcoRⅠ+HpaⅡ兩組雙酶切組合。酶切反應(yīng)體系為: 100 ng DNA, 5 U EcoRⅠ(NEB HF), 5 U HpaⅡ/MspⅠ(NEB), 2 μL 10×NEB Buffer (NEB), ddH20補(bǔ)足至20 μL。該反應(yīng)體系經(jīng)過37℃金屬浴4h, 80℃ 20min滅活內(nèi)切酶。然后進(jìn)行連接反應(yīng), 反應(yīng)體系為: 酶切產(chǎn)物15 μL, 10 μmol/L Ea、Eb各0.2 μL, 100 μmol/L MHa、MHb各0.2 μL, T4 連接酶 200 U(NEB), T4 10×Buffer 2 μL (NEB), ddH2O補(bǔ)足至20 μL, 16℃連接過夜。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系: 連接產(chǎn)物2 μL, E0 0.4 μL, MH0 0.4 μL, Premix TaqTM(TaKaRa) 10 μL, ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 1min, 30個循環(huán); 72℃ 10min; 4℃保存。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋40倍作為選擇性擴(kuò)增模板。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系: 稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL, Ex (E1-E5) 0.4 μL, MHx (MH1-MH3) 0.4 μL, Premix TaqTM(TaKaRa) 10 μL, ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 65℃ 30s (每個循環(huán)遞減0.7℃), 72℃ 1min, 13個循環(huán); 94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 1min, 23個循環(huán); 72℃ 10min; 4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測, 經(jīng)GeneFinder染色后統(tǒng)計(jì)凝膠上各種甲基化模式的片段條帶。

1.6 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)各甲基化模式條帶后通過SPSS 16.0軟件進(jìn)行ANOVA分析和Duncan多重比較, 獲得不同甲基化模式之間的差異, P＜0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 仿刺參的甲基化模式

每個DNA樣品利用MSAP方法, 在EcoRⅠ和MspⅠ、EcoRⅠ和HpaⅡ兩組雙酶切處理后, 經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增和15對選擴(kuò)引物選擇性擴(kuò)增后, 電泳凝膠上呈現(xiàn)清晰擴(kuò)增條帶(圖 1)。每個凝膠為同一DNA樣品, 每對引物對應(yīng)M、H兩條泳道。其中, M泳道上有而H泳道上無的條帶, 為全甲基化位點(diǎn)(A型); M泳道無而H泳道上有的條帶為半甲基化位點(diǎn)(B型); M、H泳道均有的條帶為非甲基化位點(diǎn)(C型)。擴(kuò)增片段主要在100—800 bp。

圖 1 不同引物組合在仿刺參基因組DNA中的MSAP圖譜Fig. 1 DNA methylation profiles in A. japonicus amplified using different primer pairs第一條泳道為Marker(m); M表示EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ酶切; H表示EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切; 1—15表示Ex(E1-E5)和MHx(MH1-MH3)不同組合形成的15對引物。A. 全甲基化帶型; B. 半甲基化帶型; C. 非甲基化帶型The first lane is marker(m); M means digested by EcoR Ⅰ/MspⅠ, H means digested by EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ; 1—15 means different combination forms of 15 primer pairs by Ex (E1-E5) and MHx (MH1-MH3). A. Full methylated bands; B. Hemi-methylated bands; C. Non-methylated bands

2.2 健康和“化皮病”仿刺參體壁組織的甲基化條帶統(tǒng)計(jì)

利用15對引物分別對健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁進(jìn)行擴(kuò)增, 發(fā)現(xiàn)每個DNA樣品均存在A型、B型和C型三種甲基化模式條帶, 統(tǒng)計(jì)各模式下100—800 bp的擴(kuò)增條帶, 獲得的甲基化多態(tài)性片段結(jié)果見表 2。健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁的總擴(kuò)增條帶分別為1916條、2124條和2204條, 以非甲基化條帶為主, 分別為1567條、1560條和1772條; 總甲基化條帶分別為349條、564條和432條, 以全甲基化條帶為主, 分別為263條、427條和342條。

2.3 健康和“化皮病”仿刺參體壁組織的甲基化水平分析

仿刺參體壁總甲基化的水平為(A+B)/(A+B+C),全甲基化的水平為A/(A+B+C), 半甲基化的水平為B/(A+B+C), 非甲基化水平為C/(A+B+C)。結(jié)果顯示(表 3), 健康仿刺參體壁的總甲基化水平為(18.60± 5.61)%, 其中全甲基化(13.97±4.86)%, 半甲基化(4.63±3.59)%; “化皮病”仿刺參病變體壁的總甲基化水平為(26.70±6.82)%, 其中全甲基化(20.08± 5.26)%, 半甲基化(6.62±3.80)%; “化皮病”仿刺參正常體壁的總甲基化水平為(19.53±3.34)%, 其中全甲基化(15.42±2.61)%, 半甲基化(4.11±2.08)%?！盎げ　狈麓虆⒉∽凅w壁總甲基水平和全甲基化水平均顯著高于健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參正常體壁(P＜0.05), 而健康仿刺參體壁與“化皮病”仿刺參正常體壁的總甲基化水平和全甲基化水平差異不顯著(P＞0.05)。三者間的半甲基化水平無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 MSAP在水產(chǎn)動物DNA甲基化研究中的應(yīng)用

在水產(chǎn)動物甲基化研究方面, Jiang等[23]應(yīng)用MSAP方法對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)閉殼肌的甲基化情況進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)總甲基化水平為26.4%, 其中全甲基化水平24.8%, 半甲基化水平1.6%; 呂佳等[24]利用MSAP方法檢測到海灣扇貝(Argopecten irradias)閉殼肌總甲基化水平25.99%,其中全甲基化水平18.90%, 半甲基化水平7.09%; 蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)閉殼肌的總甲基化水平32.88%, 其中全甲基化水平25.85%, 半甲基化水平7.03%; 吳彪等[25]通過MSAP方法得到蝦夷扇貝閉殼肌的總甲基化水平23.65%, 其中全甲基化水平16.37%, 半甲基化水平7.28%。郭婷婷等[14]采用MSAP方法分析了仿刺參不同組織基因組甲基化情況, 發(fā)現(xiàn)體壁中總甲基化水平33.51%, 其中全甲基化水平為18.39%, 半甲基化水平為15.12%, 高于本試驗(yàn)用同一方法得出的結(jié)果。同一物種相同組織表現(xiàn)出不同的甲基化水平在蝦夷扇貝中也有類似的報(bào)道: 吳彪等[25]研究表明, 蝦夷扇貝閉殼肌的總甲基化和全甲基化水平低于呂佳等[24]的研究結(jié)果,而在半甲基化水平間差別較小。Roberts和Gavery[26]報(bào)道了環(huán)境脅迫可能改變甲基化的模式; 曹家雪等[27]認(rèn)為環(huán)境可通過影響DNA的甲基化水平從而調(diào)控基因的表達(dá)。因此本次試驗(yàn)仿刺參體壁總甲基化水平低于前人的研究結(jié)果可能與同一物種分屬于不同的群落或者同一物種處于不同的生長環(huán)境有關(guān)。在本試驗(yàn)中, 健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁中半甲基化水平均低于全甲基化水平, 說明體壁的全甲基化水平占有優(yōu)勢,櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、蝦夷扇貝、太平洋牡蠣等都有相似的結(jié)果, 而耐寒品系的尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)半甲基化和全甲基化水平相當(dāng)[28], 雞(Gallus domestiaus)的半甲基化水平高于全甲基化水平[29], 體現(xiàn)不同物種間的甲基化水平呈現(xiàn)多元化。

3.2 DNA甲基化在水產(chǎn)動物病害研究中的應(yīng)用

迄今為止, DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)研究重要的內(nèi)容之一, 較多的應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)方面的研究,腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病等都與其有關(guān), 例如抑癌基因和DNA修復(fù)基因呈現(xiàn)高甲基化水平、整個基因組呈現(xiàn)低甲基化水平與多種腫瘤的發(fā)生聯(lián)系緊密[30]; T淋巴細(xì)胞基因組的低甲基化與系統(tǒng)性紅斑狼瘡密切相關(guān)[31]; 冠心病患者外周淋巴細(xì)胞的基因組甲基化水平顯著高于健康人[32]等。水產(chǎn)動物中甲基化研究更多是在育種方面, 蝦夷扇貝選育品種“玉貝”的總甲基化水平和全甲基化水平均低于對照組, 半甲基化水平高于對照組[25]; 尼羅羅非魚耐寒品系的總甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平均低于對照組[28]; 中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)選育品種“黃海1號”鰓、血液、肌肉三個組中的甲基化水平均低于對照組三個相同組織的甲基化水平[33]。

關(guān)于甲基化對水產(chǎn)動物病害免疫方面的研究還處于起步階段, 較多都與基因的調(diào)控有關(guān): Li等[34]研究表明半乳凝素基因Galectin可能參與珍珠貝(Pinctada fucata)外套膜損傷愈合的免疫應(yīng)答, DNA的甲基化作用可能是Galectin基因表達(dá)的調(diào)控因子之一; Shang等[35]通過對呼腸病毒(GCRV)感染草魚(Ctenopharyngodon idella)的試驗(yàn)推斷出DNA甲基化在草魚LGP2基因抗病毒轉(zhuǎn)錄中起到重要的調(diào)控作用。在本研究中, “化皮病”仿刺參病變體壁的總甲基化水平和全甲基化水平均顯著高于健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參正常體壁(P＜0.05), 而“化皮病”仿刺參的正常體壁與健康仿刺參體壁的總甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平均無顯著差異(P＞0.05), 推測仿刺參體壁的“化皮”可能與DNA甲基化相關(guān)。在通常情況下, DNA低甲基化會激活基因的轉(zhuǎn)錄, 而高甲基化則抑制基因的轉(zhuǎn)錄[36], 仿刺參“化皮”體壁組織中DNA甲基化位點(diǎn)和甲基化水平與基因表達(dá)存在怎樣的相關(guān)性, 較高的DNA甲基化水平是否與“化皮”過程中基因的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān), 我們將會做進(jìn)一步的研究, 為揭示仿刺參“化皮”過程中的分子調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

表 2 健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁DNA甲基化擴(kuò)增條帶Tab. 2 The amplified bands of DNA methylation of body wall from healthy A. japonicus, and diseased A. japonicus

表 3 健康仿刺參體壁和“化皮病”仿刺參病變體壁、正常體壁的甲基化程度Tab. 3 The methylation levels of body wall from the healthy and diseased A. japonicus

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ANALYSIS OF DNA METHYLATION IN THE BODY WALL OF SEA CUCUMBER APOSTICHOPUS JAPONICUS WITH SKIN ULCERATION BY THE METHYLATION-SENSITIVE AMPLIFIED POLYMORPHISM (MSAP)

GAO Shan, YANG Ai-Fu, DONG Ying, WANG Bai, CHEN Zhong, JIANG Jing-Wei, GUAN Xiao-Yan, JIANG Bei, SUN Hong-Juan and ZHOU Zun-Chun
(Liaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China)

The technology of methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) was used to investigate the DNA methylation patterns at CCGG sites in the body wall of the healthy and diseased Apostichopus japonicus. The results showed that the methylation levels of body wall of the healthy A. japonicus, ulcered and normal body wall of the diseased ones were (18.60±5.61)%, (26.70±6.82)% and (19.53±3.34)%, among which the full methylations were (13.97±4.86)%, (20.08±5.26)% and (15.42±2.61)%, and the hemi-methylations were (4.63±3.59)%, (6.62±3.80)% and (4.11±2.08)%, respectively. The total methylation and full methylation levels in ulcer body wall of diseased A. japonicus were obviously higher than those of normal body wall in both healthy and diseased A. japonicas that have no difference in the total methylation level and full methylation level in the body wall. There were no significant differences in the hemi-methylations among three groups. These results suggest that the ulceration of body wall may be associated with DNA methylation.

Apostichopus japonicus; Body wall; Methylation; Methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP); Skin ulceration

S917

A

1000-3207(2017)03-0637-06

10.7541/2017.81

2016-06-06;

2016-11-18

國家自然科學(xué)基金(31672688); 遼寧省自然科學(xué)基金(2015020786); 遼寧省海洋與漁業(yè)廳科研項(xiàng)目(201503)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31672688); the Natural Science Foundation of Liaoning Province, China (2015020786); the Ocean & Fisheries Project of Liaoning Province (201503)]

高杉(1983—), 男, 遼寧沈陽人; 碩士, 助理研究員; 主要從事分子生物學(xué)的研究。E-mail: gs_7920@163.com

周遵春(1967—), 男, 博士, 研究員; 主要從事海洋生物技術(shù)的研究。E-mail: zunchunz@hotmail.com