袁 文，張 鈺，黃碧洪，羅銀珠，王 靜，潘金春，吳瑞可，郭鵬舉，黃 韌

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510663)

研究報(bào)告

小鼠腦脊髓炎病毒自然感染調(diào)查以及人工感染小鼠試驗(yàn)

袁 文，張 鈺，黃碧洪，羅銀珠，王 靜，潘金春，吳瑞可，郭鵬舉，黃 韌

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510663)

目的 了解小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)自然感染情況，探究人工感染TMEV小鼠體內(nèi)各臟器組織中病毒分布及血清抗體變化。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)方法對(duì)2010年～2015年廣東地區(qū)采集的SPF級(jí)小鼠、開放環(huán)境飼養(yǎng)的小鼠以及野生褐家鼠臨床樣本進(jìn)行TMEV檢測(cè)。36只ICR小鼠經(jīng)腦內(nèi)接種TMEV BeAn病毒，每天觀察動(dòng)物的臨床癥狀，在接種第0、3、7、10、17、21、31、39、46 天每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)3只動(dòng)物安樂(lè)死，剖檢并取血清和組織臟器樣本進(jìn)行TMEV檢測(cè)。結(jié)果 SPF級(jí)小鼠TMEV抗體陽(yáng)性率為5.29%(n=2834)，核酸陽(yáng)性率為27.27%(n=457)；開放環(huán)境飼養(yǎng)的小鼠的抗體和核酸陽(yáng)性率分別為71.95%(n=82)和53.66%(n=82)；野生褐家鼠中核酸陽(yáng)性率為25.93%(n=27)。TMEV陽(yáng)性小鼠中僅有兩只小鼠表現(xiàn)有明顯的臨床癥狀。盲腸內(nèi)容物、糞便和腦是qRT-PCR檢測(cè)的最佳選擇樣本。ICR小鼠腦內(nèi)接種TMEV BeAn病毒后第3 d可在腦、心臟、肝臟、肺臟和胃中檢測(cè)到病毒核酸，脾臟、腎臟和盲腸中未檢測(cè)到病毒核酸。肝臟、心臟、肺臟和胃中的病毒在接種后第10天已完全清除，腦中的病毒一直持續(xù)存在到第46天試驗(yàn)結(jié)束。小鼠感染后第7天可以檢測(cè)到抗體，隨后抗體水平逐漸升高，接種后17 d抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，并一直到46 d都可以維持較高的抗體水平。人工感染小鼠呈隱性感染，臨床上并未表現(xiàn)明顯癥狀和眼觀病理變化。結(jié)論 廣東地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠和野生褐家鼠均存在TMEV感染，且感染率較高。小鼠接種TMEV BeAn毒株后呈隱性感染，感染小鼠第7天可以產(chǎn)生抗體且持續(xù)存在。病毒在感染小鼠肝臟、心臟、肺臟和胃中短時(shí)間存在，而在腦中長(zhǎng)期存在。qRT-PCR與ELISA兩種檢測(cè)方法具有較好的一致性，qRT-PCR檢測(cè)方法可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充。

小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)；感染；檢測(cè)

小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV)屬于微RNA病毒科，心病毒屬，核酸為負(fù)鏈單股RNA。該病毒主要侵害小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，多數(shù)呈隱性感染，感染小鼠不表現(xiàn)臨床癥狀，有時(shí)表現(xiàn)腦脊髓炎和后肢麻痹等癥狀[1]。根據(jù)神經(jīng)毒力不同TMEV分為兩個(gè)亞群：第一亞群由高毒力毒株組成，以GDVII 株和FA 株為代表，可引起急性致命性腦炎；第二亞群為低毒力毒株，如BeAn株和DA株，可引起持續(xù)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，導(dǎo)致單核細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘[2，3]。TMEV感染小鼠引起的脫髓鞘疾病與人多發(fā)性硬化癥(MS)在免疫學(xué)和組織病理學(xué)方面類似，是研究MS的理想動(dòng)物感染模型[4]。

TMEV呈世界范圍流行，是目前實(shí)驗(yàn)小鼠中最常見的一種病毒之一。我國(guó)小鼠群的TMEV感染率較高，上世紀(jì)90年代報(bào)道普通小鼠群中感染率達(dá)8～35%[1]， 2014年王翠娥等報(bào)道實(shí)驗(yàn)小鼠中抗體陽(yáng)性率為15.1%(n=325)[5]。TMEV感染不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身造成危害，對(duì)科研工作也造成潛在干擾，因此，TMEV是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》(GB14922.2-2011)中SPF級(jí)小鼠需要排除的病原[6]。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)兩種檢測(cè)方法對(duì)2010年～2015年廣東地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠TMEV流行情況進(jìn)行調(diào)查，并通過(guò)腦內(nèi)接種TMEV感染實(shí)驗(yàn)小鼠，對(duì)病毒和抗體在人工感染小鼠體內(nèi)消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行研究，為該病毒的監(jiān)測(cè)、防控及檢測(cè)方法的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞

TMEV BeAn毒株(ATCC VR-995)和BHK-21細(xì)胞(ATCC CCL-10)購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心。復(fù)蘇BHK-21細(xì)胞，細(xì)胞在含10%胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco公司，美國(guó))培養(yǎng)3 d～5 d，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，傳代分瓶，分瓶后待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密度，棄去生長(zhǎng)液，加入500 μL TMEV病毒液于75 cm2細(xì)胞瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附l h，棄去瓶中的病毒液加入無(wú)血清的DMEM細(xì)胞維持液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d～5 d，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)“+++ ～ ++++”時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，-80℃凍存，反復(fù)凍融3次后，3 500 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片，留上清即為收獲的TMEV病毒液，傳代3次，收獲的病毒液用qRT-PCR對(duì)病毒拷貝數(shù)進(jìn)行定量。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只，雌性，3周齡，SPF級(jí)ICR小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001)，(質(zhì)量合格證號(hào)：11400700121383)，動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所二級(jí)生物安全感染實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2012-0122)，實(shí)行光照/黑暗各12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食及飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展通過(guò)廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所動(dòng)物使用和管理委員會(huì)審批(I-IACUC2015003)。所有小鼠經(jīng)ELISA檢測(cè)確定為TMEV抗體陰性。

1.3 臨床樣本

臨床樣本來(lái)源包括：(1)2010年～2015年廣東地區(qū)監(jiān)督檢測(cè)抽檢和委托送檢的SPF級(jí)活體小鼠、小鼠血清或小鼠糞便，共計(jì)2834份。(2)2014年廣州市兩個(gè)開放環(huán)境中飼養(yǎng)的小鼠82只。(3)在其中一家開放設(shè)施附近捕獲的野生褐家鼠27只。無(wú)菌采集活體小鼠和野生褐家鼠的血清和盲腸內(nèi)容物，-20℃保存，血清用于抗體檢測(cè)，盲腸內(nèi)容物和糞便用于核酸檢測(cè)。

1.4 人工感染試驗(yàn)

27只ICR小鼠接種前禁食不禁水過(guò)夜，取濃度為1.0×108copies/μL的病毒液，腦內(nèi)注射病毒液20 μL/只。動(dòng)物接種病毒后，連續(xù)觀察46 d，每天觀察動(dòng)物的外觀、行為活動(dòng)、飲食和精神狀態(tài)等。在接種的第0天取3只動(dòng)物，以及感染后第3、7、10、17、21、31、39、46天時(shí)，隨機(jī)各取3只動(dòng)物，每只小鼠腹腔注射0.1 mL 0.1%戊巴比妥鈉麻醉，然后摘眼球采血并制備血清，置-20℃冰箱待測(cè)抗體。隨后，小鼠脫頸椎安樂(lè)死，剖檢，快速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胃和盲腸及內(nèi)容物等樣本，置-20℃冰箱待測(cè)病毒核酸。9只ICR小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)作為哨兵鼠，在第10、21和31天各取3只哨兵鼠進(jìn)行抗體和核酸檢測(cè)。

1.5 血清抗體檢測(cè)

小鼠血清采用TMEV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(美國(guó)XpressBio公司)進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 病毒核酸檢測(cè)

1.6.1 樣本處理和總RNA抽提：每個(gè)組織和糞便樣本取0.2 g，加入600 μL的PBS緩沖液，再加入6～8粒氧化鋯研磨珠，于HerosBio TL2020高通量組織研磨儀(北京鼎昊源科技有限公司)上研磨3 min～5 min，將研磨后勻漿液10 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液用核酸抽提試劑盒(TIANamp Viral RNA Kit，天根公司)抽提總RNA，使用DEPC水將總RNA的濃度調(diào)整到10 ng/μL。

1.6.2 qRT-PCR：qRT-PCR檢測(cè)參照本實(shí)驗(yàn)室建立檢測(cè)方法進(jìn)行操作[7]，略有改動(dòng)。使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)(Takara公司，大連)將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA采用PremixExTaqTM(Probe qPCR)(Takara公司，大連)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×PremixExTaq10 μL、TMEV檢測(cè)上下游引物終濃度均為0.5 μmol/L，探針終濃度0.4 μmol/L， cDNA 模板2 μL，加RNase Free dH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，一個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)，60℃延伸結(jié)束后收集熒光。采用TMEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為參照對(duì)樣本中的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prim 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料McNemar法進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，用Kappa值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠自然感染調(diào)查結(jié)果

2.1.1 抗體檢測(cè)結(jié)果：抗體檢測(cè)結(jié)果見表1，從表中可知2010年～2015年廣東地區(qū)SPF級(jí)小鼠TMEV抗體陽(yáng)性率為5.29%(n=2834)，而開放環(huán)境中飼養(yǎng)小鼠的陽(yáng)性率為71.95%(n=82)。

2.1.2 核酸檢測(cè)結(jié)果：核酸檢測(cè)結(jié)果見表2，從表中可知2010年～2015年廣東地區(qū)SPF級(jí)小鼠TMEV核酸陽(yáng)性率為27.35%(n=457)，開放環(huán)境飼養(yǎng)小鼠的陽(yáng)性率為53.66%(n=82)，而開放設(shè)施A附近捕獲的野生褐家鼠陽(yáng)性率為25.93%(n=27)。用檢測(cè)的上下游引物對(duì)其中三份陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示三個(gè)樣本擴(kuò)增的基因序列相同，均為84 bp。通過(guò) Genebank上的Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)，陽(yáng)性樣本的序列與Genebank上的TMEV毒株(登錄號(hào)EU718732)的同源性為100%，證明臨床樣本為TMEV陽(yáng)性樣本。

表1 小鼠TMEV抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

表2 小鼠TMEV核酸陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

2.1.3 ELISA和qRT-PCR方法比較：采用ELISA和qRT-PCR兩種方法對(duì)其中一個(gè)設(shè)施的小鼠進(jìn)行6年的跟蹤檢測(cè)，該設(shè)施 TMEV抗體陽(yáng)性率和核酸陽(yáng)性率分別為34.33%和35.32%(n=201)，結(jié)果見圖1。采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料McNemar法進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，用Kappa值進(jìn)行評(píng)價(jià)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：以ELISA檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光定量PCR結(jié)果與其比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.868)，說(shuō)明兩種方法診斷TMEV感染結(jié)果一致。兩種檢測(cè)方法吻合系數(shù)Kappa=0.605(P=0.000)，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法具有較好的一致性(表3)。此外，回顧調(diào)查發(fā)現(xiàn)該設(shè)施檢出的TMEV陽(yáng)性鼠中有2只小鼠有明顯的臨床癥狀，其中一只表現(xiàn)為后肢癱瘓，另一只表現(xiàn)為頭歪向一側(cè)，并伴有轉(zhuǎn)圈行為，兩只小鼠均排除其他病原感染。

2.1.4 TMEV病毒在自然感染小鼠主要臟器中的分布：應(yīng)用qRT-PCR方法對(duì)16只自然感染小鼠糞便、盲腸內(nèi)容物、腦、脾臟、肝臟、心臟、肺臟、腎臟和胃等主要臟器進(jìn)行檢測(cè)，查看TMEV病毒在小鼠體內(nèi)的分布情況，分析哪些樣本是該方法的最佳檢測(cè)樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞便和盲腸內(nèi)容物中檢出率最高，其次是腦和肝臟，小鼠脾臟、心臟、肺臟、腎臟和胃也可檢出TMEV核酸，結(jié)果見表4。因此在使用qRT-PCR方法進(jìn)行TMEV檢測(cè)時(shí)，糞便、盲腸內(nèi)容物和腦是最佳的待檢樣本。

表3 ELISA與qRT-PCR檢測(cè)小鼠臨床樣本結(jié)果比較

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

Note. “+” represents positive result，“-” represents negative result.

2.2 小鼠人工感染試驗(yàn)

2.2.1 臨床觀察：ICR小鼠接種TMEV后，外觀、行為、飲食和精神狀態(tài)等都無(wú)明顯變化，病理剖檢無(wú)明顯眼觀病理學(xué)變化，小鼠呈現(xiàn)隱性感染狀態(tài)。

2.2.2 血清抗體滴度變化：小鼠接種TMEV后第7 天開始產(chǎn)生抗體(A值≥0.3為陽(yáng)性)，17 d后抗體陽(yáng)性率達(dá)100%(n=3)，抗體水平隨著感染時(shí)間增加逐漸升高，抗體水平在39 d達(dá)到高峰，此后至46 d可一直維持高水平(圖2)。

表4 TMEV病毒在自然感染小鼠臟器中的分布

圖1 2010～2015年某設(shè)施TMEV感染情況Fig.1 The infection of TMEV detected by ELISA and qRT-PCR in one facility from 2010 to 2015

圖2 ICR小鼠接種TMEV后血清抗體測(cè)定(n=3)Fig.2 Determination of antibody against TMEV in infected mice (n=3)

圖3 各組織臟器病毒載量(n=3)Fig.3 Viral loads of TMEV in organs and tissues (n=3)

2.2.3 病毒核酸檢測(cè)結(jié)果:由圖3可知，小鼠接種病毒后第3天，在腦、心臟、肝臟、肺臟和胃中可檢測(cè)到病毒核酸，脾臟、腎臟、盲腸中未檢測(cè)到病毒核酸。接種后第7 天，肝臟中病毒消失，接種后第10天，心臟、肺臟和胃中的病毒消失。腦中的病毒一直持續(xù)到第46 天試驗(yàn)結(jié)束，病毒載量呈遞減趨勢(shì)。接種后第3 天，各組織臟器的病毒載量高低依次為腦、心臟、肺臟、胃和肝臟。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)2010年～2015年廣東地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠TMEV感染狀況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPF級(jí)小鼠TMEV抗體陽(yáng)性率為5.29%(n=2834)，核酸陽(yáng)性率為27.27%(n=457)，各年度均有檢出，說(shuō)明廣東地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠存在TMEV感染，且感染率較高。需要說(shuō)明的是，本次檢測(cè)試驗(yàn)中SPF級(jí)小鼠核酸檢測(cè)一般在某一批次的動(dòng)物抗體檢測(cè)為陽(yáng)性之后進(jìn)行，大部分批次中抗體陰性小鼠未再進(jìn)行核酸檢測(cè)，因此，雖然核酸陽(yáng)性數(shù)量(n=125)與抗體陽(yáng)性數(shù)量(n=150)差距不大，但是由于核酸檢測(cè)的樣本總數(shù)(n=457)小于抗體檢測(cè)的樣本總數(shù)(n=2834)，得出的結(jié)果是SPF級(jí)小鼠TMEV核酸陽(yáng)性率遠(yuǎn)大于抗體陽(yáng)性率。通過(guò)回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)TMEV感染主要存在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用設(shè)施，而且發(fā)生感染的設(shè)施主要又來(lái)源于飼養(yǎng)基因工程小鼠的設(shè)施，這些設(shè)施由于頻繁引進(jìn)基因工程小鼠，又未進(jìn)行有效的檢驗(yàn)檢疫，因此將病毒帶入設(shè)施。有兩家實(shí)驗(yàn)小鼠生產(chǎn)單位在2010年曾檢測(cè)出TMEV感染，但通過(guò)淘汰感染小鼠、凈化環(huán)境設(shè)施和重新引種后清除了TMEV感染。此外，開放環(huán)境飼養(yǎng)的小鼠的抗體和核酸陽(yáng)性率分別為71.95%和53.66%，遠(yuǎn)高于屏障環(huán)境下飼養(yǎng)的小鼠。已有的研究證明野生小家鼠是TMEV的自然宿主[8]，本實(shí)驗(yàn)從其中一個(gè)開放環(huán)境設(shè)施附近捕獲的野生褐家鼠檢出TMEV核酸，證明野生褐家鼠也可以攜帶TMEV并將病毒傳染給實(shí)驗(yàn)小鼠。目前，TMEV只是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中SPF級(jí)小鼠“必要時(shí)”需排除的病原，一些單位可能忽略了TMEV檢測(cè)，鑒于上述調(diào)查結(jié)果，我們建議各小鼠生產(chǎn)單位和使用單位應(yīng)該重視TMEV的監(jiān)測(cè)。

TMEV屬于腸道病毒，通過(guò)糞-口途徑傳播，本研究原計(jì)劃采用低毒力的TMEV BeAn毒株經(jīng)口接種方式模擬自然感染，但接種多次實(shí)驗(yàn)均未獲成功，后采用腦內(nèi)接種方式才獲成功。人工感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ICR小鼠在感染低毒力TMEV毒株后呈隱性感染，臨床上并未表現(xiàn)明顯癥狀和眼觀病理變化。已有的研究認(rèn)為通過(guò)細(xì)胞適應(yīng)的病毒經(jīng)腦接種后，病毒可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入外周血循環(huán)，最終引起病毒血癥和內(nèi)臟器官感染，其中腸道中的病毒可以長(zhǎng)期復(fù)制，而外神經(jīng)系統(tǒng)器官中的病毒在接種后7～14 d即被清除[9]。本實(shí)驗(yàn)中小鼠接種病毒后只在腦、心臟、肝臟、肺臟和胃中檢測(cè)到病毒核酸，脾臟、腎臟和盲腸中未檢測(cè)到病毒核酸。肝臟、心臟、肺臟和胃中的病毒在接種后第10天已完全清除。病毒在感染小鼠體內(nèi)的分布與文獻(xiàn)報(bào)道有一定差異，造成這種差異的原因可能與接種的毒株有關(guān)。由于本次人工感染試驗(yàn)研究中病毒不在腸道中復(fù)制增殖，小鼠沒(méi)有通過(guò)糞便排毒，進(jìn)而感染哨兵鼠，因此哨兵鼠的抗體和核酸檢測(cè)均為陰性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腦內(nèi)接種方式進(jìn)行TMEV人工感染試驗(yàn)，獲得了TMEV在小鼠體內(nèi)各臟器組織中病毒分布及血清抗體變化情況，為TMEV動(dòng)物感染模型制作和評(píng)價(jià)提供了參考。

目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中建議的TMEV檢測(cè)方法主要為血清抗體檢測(cè)方法，如ELISA和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)方法等[10]。但血清學(xué)檢測(cè)不適合用于病毒早期感染和免疫缺陷小鼠的診斷，具有一定局限性。以PCR為代表的分子生物學(xué)檢測(cè)方法可以用于病原的直接檢測(cè)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，已成為病毒感染診斷的重要手段。本研究同時(shí)應(yīng)用ELISA和qRT-PCR兩種檢測(cè)方法對(duì)TMEV進(jìn)行檢測(cè)分析，自然感染試驗(yàn)中，對(duì)其中一設(shè)施中的自然感染樣本進(jìn)行了6年跟蹤比較檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法具有較好的一致性，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法均適用于TMEV感染的診斷。此外，從檢測(cè)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在對(duì)部分動(dòng)物個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)兩種檢測(cè)方法存在一定差異，其中一個(gè)主要原因與動(dòng)物個(gè)體的抗原和抗體消長(zhǎng)規(guī)律不一致有關(guān)，人工感染試驗(yàn)結(jié)果也證明這一點(diǎn)；另外一個(gè)原因可能與方法的靈敏度有關(guān)。然而，在對(duì)動(dòng)物群體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致性較高；而且，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果可以互為補(bǔ)充，防止陽(yáng)性動(dòng)物漏檢。因此，在對(duì)動(dòng)物群體進(jìn)行TMEV監(jiān)測(cè)時(shí)，建議綜合應(yīng)用抗體和核酸兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，更加有效地對(duì)動(dòng)物健康狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

應(yīng)用qRT-PCR方法對(duì)TMEV自然感染小鼠的盲腸內(nèi)容物、糞便和主要臟器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盲腸內(nèi)容物、糞便和腦中MNV陽(yáng)性檢出率高于其他器官組織。因此在使用qRT-PCR方法進(jìn)行TMEV檢測(cè)時(shí)，盲腸內(nèi)容物、糞便和腦是最佳的待檢樣本。人工感染試驗(yàn)中，小鼠接種TMEV后第7天就可以檢測(cè)到抗體，之后抗體水平逐漸升高，17 d后抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，并一直到46 d都可以維持較高的抗體水平，說(shuō)明7 d～17 d可作為早期抗體檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。而應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)方法可在接種后第3天從多個(gè)臟器檢出病毒核酸，證實(shí)qRT-PCR可以應(yīng)用于病毒早期感染診斷。國(guó)內(nèi)外研究人員建立了多種PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于TMEV檢測(cè)并取得了較好的結(jié)果[7，11-13]，本研究通過(guò)對(duì)TMEV自然感染和人工感染臨床樣本進(jìn)行綜合檢測(cè)分析，證實(shí)qRT-PCR可以有效地應(yīng)用于TMEV感染診斷，可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)補(bǔ)充檢測(cè)方法。

(致謝：感謝本所的何麗芳在動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)中所做的工作。)

[1] 田克恭. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒性疾病 [M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 1992: 76-83.

[2] Lehrich JR, Arnason BG, Hochberg FH, et al. Demyelinative myelopathy in mice induced by the DA virus [J]. J Neurol Sci, 1976, 29(2-4): 149-160.

[3] Lipton HL. Theiler’s virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination [J]. Infect Immunity,1975,11(5): 1147-1155.

[4] Oleszak EL, Chang JR, Friedman H, et al. Theiler’s virus infection: a model for multiple sclerosis [J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(1): 174-207.

[5] 王翠娥, 陳立超, 周倩, 等. 實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠多種病毒的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 2014, 31(2): 20-24.

[6] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局． 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及檢測(cè) [S]． GB 14922. 2-2011.

[7] 袁文, 張鈺, 王靜, 等. 小鼠腦脊髓炎病毒非編碼蛋白(UTR)片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2012, 32(1): 1-6.

[8] Lipton H, Kim BS, Yahikozawa H, et al. Serological evidence that Mus musculus is the natural host of Theiler’s murine encephalomyelitis virus [J]. Virus Res, 2001, 76(1): 79-86.

[9] Fox JG. The mouse in biomedical research, 2nd ed [M].. Elsevier, AP, Amsterdam; Boston. 2007: 311-323.

[10] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠腦脊髓炎病毒檢測(cè)方法 [S]. GB 14926.26-2001.

[11] Bootz F, Sieber I, Popovic D, et al. Comparison of the sensitivity of in vivo antibody production tests with in vitro PCR-based methods to detect infectious contamination of biological materials [J]. Lab Anim, 2003, 37(4): 341-351.

[12] Trottier M, Schlitt BP, Lipton HL. Enhanced detection of Theiler’s virus RNA copy equivalents in the mouse central nervous system by real-time RT-PCR [J]. J Virol Methods, 2002, 103(1): 89-99.

[13] 李曉波, 付瑞, 王吉, 等. 小鼠腦脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(10): 17-20.

Investigation on the natural infection of Theiler’s murine encephalomyelitis virus and study on experimental infection of the virus in mice

YUAN Wen，ZHANG Yu，HUANG Bi-hong， LUO Yin-zhu，WANG Jing，PAN Jin-chun，WU Rui-ke，GUO Peng-ju，HUANG Ren

(Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663, China)

Objective To investigate the natural infection of Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) in mice, and to survey the distribution of virus in tissues and the changes of serum antibody in the experimentally TMEV-infected mice. Methods Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and fluorescence quantitative RT-PCR (qRT-PCR) assay were used to detect the antibody and nucleic acid of TMEV in clinical samples. These samples included SPF mice collected from Guangdong area in 2010-2015, mice obtained from a non-barrier laboratory rodent colony, and wildRattusnorvegicuslive-trapped around the non-barrier laboratory rodent colony. 36 ICR mice were intracerebrally inoculated with TMEV BeAn strain. The clinical signs of the animals were observed daily post-inoculation. Three mice were euthanatized at day 0, 3, 7, 10, 17, 21, 31, 39 and 46 post-inoculation (dpi), respectively. Tissue and serum samples were collected for TMEV detection. Results The TMEV antibody and nucleic acid positive rates of SPF mice collected from Guangdong area in 2010-2015 were 5.29% (n=2834) and 27.27% (n=457), respectively. The TMEV antibody and nucleic acid positive rates of the mice obtained from a non-barrier laboratory rodent colony were 71.95% (n=82) and 53.66% (n=82), respectively. The TMEV nucleic acid positive rate of wildRattusnorvegicuswas 25.93% (n=27). In the TMEV positive mice, only two mice showed obvious clinical symptoms. The cecal contents, feces and brain samples were the best candidates for qRT-PCR assay. The viral nucleic acid could be detected in the brain, heart, liver, lung and stomach of ICR mice at 3 dpi, but no viral nucleic acid was detected in the spleen, kidney, and cecum. The viruses in liver, heart, lungs and stomach were completely cleared at 10 dpi, and the viruses persisted in the brain throughout the experiment. The TMEV antibody could be detected at 7 dpi, and then the antibody positive rate reached 100% at 17 dpi. The antibody level increased gradually and maintained up to 46 days. ICR mice showed latent infection after TMEV inoculation, with no obvious symptoms and eye pathological changes. Conclusions The experimental mice and wildRattusnorvegicusin Guangdong area are both infected with TMEV, and the infection rate is high. The mice inoculated with TMEV BeAn strain show latent infection. The TMEV antibody produced in mice can be detected at 7 dpi and persisted until the end of the experiment. The viruses are found in the liver, heart, lung and stomach for a short time, but are persisted in the brain for a long time. There is a good consistency of TMEV detection between qRT-PCR and ELISA. The qRT-PCR assay can be used as a powerful complement method for the national standard of laboratory animals．

Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV)；Infection；Detection; PCR; ELISA; Mice; Rats

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B070706006，2013B060400028，2014A070705003)。

袁文(1979-)，男，助理研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E-mail：ywen010101@163.com。

黃韌(1959-)，男，研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的研究。E-mail：labking@sohu.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0075-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.013

2016-11-15