李建勛， 巴 蕾， 于 歡， 于 敏， 劉 冰， 吳榮哲

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

秋水仙素浸泡法對(duì)黑果腺肋花楸多倍體的誘導(dǎo)及初步鑒定

李建勛， 巴 蕾， 于 歡， 于 敏， 劉 冰， 吳榮哲*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

以黑果腺肋花楸組培苗莖尖、葉片和繼代愈傷組織為材料，探索秋水仙素不同濃度和不同處理時(shí)間對(duì)不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織的存活率、再生芽數(shù)、增殖系數(shù)和多倍體發(fā)生的影響；并對(duì)秋水仙素處理后不同外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生植株，經(jīng)3次繼代培養(yǎng)后生長(zhǎng)30 d的植株的染色體倍性進(jìn)行鏡檢。結(jié)果表明：不同外植體的存活率和出芽率隨秋水仙素濃度的增高和處理時(shí)間延長(zhǎng)而降低；其中，黑果腺肋花楸愈傷組織的存活率高于莖尖和葉片。經(jīng)秋水仙素處理后，3種外植體均能誘導(dǎo)多倍體發(fā)生；處理濃度和時(shí)間的增加有利于提高染色體加倍率，但外植體的死亡率隨之增加。當(dāng)愈傷組織在秋水仙素濃度為2 000 mg/L,處理24 h時(shí)，葉片愈傷組織增殖系數(shù)為2.4，存活率為52%。以植株矮化和莖稈粗壯為依據(jù)篩選的再生植株中鑒定出47株假定多倍體，但大多為混倍體(嵌合體)。葉片誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)1 500 mg/L秋水仙素浸泡處理24 h后，誘導(dǎo)再生的生根植株中獲得1株整株均一加倍的四倍體植株。

黑果腺肋花楸；多倍體；秋水仙素；浸泡法

黑果腺肋花楸(AroniamelanocarpaElliot)系薔薇科腺肋花楸屬多年生落葉灌木[1]；該樹種在食用、藥用、園林和生態(tài)等領(lǐng)域均有普遍應(yīng)用。其果實(shí)含有1%～2%的花青素、0.25%～0.35%的黃酮類物質(zhì)、1%～2%的多酚，各種功能性物質(zhì)含量豐富，對(duì)人體的各個(gè)器官都有良好的保護(hù)作用，具有多種保健功效[2-3]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)黑果腺肋花楸認(rèn)識(shí)的增加，需求量也逐年增加。然而，由于黑果腺肋花楸果實(shí)小且有籽，僅依靠常規(guī)栽培手段很難滿足市場(chǎng)需求。

人工誘導(dǎo)多倍體的研究開始于20世紀(jì)初[4]。開始時(shí)，多數(shù)采用物理方法，誘變率低。直到1937年，Blakes和Avery發(fā)現(xiàn)秋水仙素能夠誘導(dǎo)曼佗羅染色體加倍，在技術(shù)上解決了細(xì)胞染色體加倍的問題，大大推動(dòng)了人工誘導(dǎo)多倍體的研究，使之成為植物育種的重要手段[5]。目前，多倍體誘導(dǎo)的難點(diǎn)在于多倍體鑒定，關(guān)于多倍體鑒定主要有染色體鑒定法，包括染色體制片法、流式細(xì)胞儀鑒定、染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目鑒定法。其中,染色體制片法是進(jìn)行細(xì)胞倍性鑒定最直接、最可靠的方法，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，而且不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)儀器，是目前應(yīng)用最多的鑒定方法[6]。

由于多倍體不僅使植株器官和細(xì)胞體積增大，而且基因劑量和細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)也隨染色體倍性的增加而提高，各種代謝產(chǎn)物的含量也增加。若能育出黑果腺肋花楸多倍體品種，不僅有利于改善其果實(shí)的品質(zhì)，而且將有利于大幅度提高其果實(shí)花青素等活性物質(zhì)的含量。本試驗(yàn)采用化學(xué)方法結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行黑果腺肋花楸多倍體誘導(dǎo)，以期獲得產(chǎn)量高、藥用活性物質(zhì)增加的多倍體植株，盡而探究誘導(dǎo)過程中黑果腺肋花楸倍性調(diào)控機(jī)制，為我國(guó)培育優(yōu)良品種提供種質(zhì)資源，這對(duì)擴(kuò)大黑果腺肋花楸種植面積、滿足市場(chǎng)需求具有一定的意義和價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

以取自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院有機(jī)型無(wú)土栽培實(shí)驗(yàn)室的黑果腺肋花楸組培苗莖尖、葉片、愈傷組織為材料，誘導(dǎo)多倍體發(fā)生和植株再生。

1.2 方法

1.2.1 黑果腺肋花楸多倍體誘導(dǎo)

1) 以組培苗莖尖為外植體誘導(dǎo) 無(wú)菌條件下，選取長(zhǎng)勢(shì)相同的幼嫩植株莖尖1 cm,浸泡于不同濃度、經(jīng)高壓滅菌的秋水仙素溶液中；濃度梯度設(shè)置為500、1 000、1 500和2 000 mg/L，并加入二甲基亞砜1 mL/L；浸泡時(shí)間分別為12、24、36和48 h。每個(gè)處理分別編號(hào)。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)平均再生芽數(shù)和存活率。

2) 以組培苗葉片為外植體誘導(dǎo) 選取黑果腺肋花楸組培苗頂端葉片，浸泡于添加有二甲基亞砜1 mL/L的500、1 000、1 500和2 000 mg/L的秋水仙素溶液中；浸泡時(shí)間分別為12、24、36和48 h。處理樣品同1)。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率、平均再生芽數(shù)和存活率。

3) 以愈傷組織為外植體誘導(dǎo) 將材料切成4 mm×4 mm大小,放入不同濃度遮光處理的秋水仙素溶液中；濃度分別為500、1 000、1 500、2 000 mg/L，并添加二甲基亞砜1 mL/L；處理時(shí)間為12、24、36和48 h；在恒速震蕩培養(yǎng)箱中，以100 r/min速度震蕩；處理樣品同1)。30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)以及存活率。

1.2.2 黑果腺肋花楸多倍體初步鑒定

1) 再生植株形態(tài)鑒定法 將黑果腺肋花楸莖尖處理所誘導(dǎo)的再生植株接種于MS + BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L[7]的培養(yǎng)基中，經(jīng)過3次繼代生長(zhǎng)30 d后測(cè)量株高、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)度，葉長(zhǎng)和葉寬則采用掃描儀LC 2400P掃描，經(jīng)winfolia 2012a for leaf anailsis分析，初步確定變異植株的出現(xiàn)范圍。

2) 再生植株細(xì)胞學(xué)鑒定法 在顯微鏡16×10(mm)的視野下記錄氣孔數(shù)目并鑒定葉片氣孔的密度；用目鏡測(cè)微尺測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞的大小(包括長(zhǎng)度和寬度)；在16×10(mm)的視野下記錄保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目，并計(jì)算變異率。

變異率(%)=(保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)12個(gè)以上的細(xì)胞個(gè)數(shù)/保衛(wèi)細(xì)胞總觀測(cè)個(gè)數(shù))×100%

3) 根尖染色體計(jì)數(shù)法 將變異體接種于1/2MS+IBA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L[8]培養(yǎng)基，待 2 周后生長(zhǎng)到3 cm時(shí)，早晨9:30 取根尖、編號(hào)，浸泡于冰水中。用劉迎春[9]方法進(jìn)行鏡檢染色體數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法，數(shù)據(jù)采用 Excel 2007和 SPSS 16.0軟件的Duncan檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，顯著水平P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸多倍體的誘導(dǎo)

2.1.1 黑果腺肋花楸組培苗莖尖多倍體誘導(dǎo)

從秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸組培苗莖尖生長(zhǎng)的影響來(lái)看，不同的處理濃度和處理時(shí)間對(duì)組培苗的存活率具有一定影響，外植體的存活率隨秋水仙素濃度的增高和處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低(表1)。

表1 秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸組培苗莖尖生長(zhǎng)的影響

注：表中數(shù)字后面的小寫字母表示在0.05水平下差異顯著性，下同。

當(dāng)處理濃度為500 mg/L時(shí)，組培苗存活率均大于80%；當(dāng)濃度上升到 2 000 mg/L時(shí)，組培苗莖尖有部分變?yōu)楹稚掖婊盥拭黠@降低。秋水仙素處理的時(shí)間超過30 h時(shí)，組培苗莖尖長(zhǎng)勢(shì)普遍降低，且當(dāng)時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，外植體處于停止生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)秋水仙素濃度為1 500 mg/L、處理時(shí)間為36 h時(shí)，平均再生芽數(shù)為8.5個(gè)，存活率為51.3%，接近于半致死劑量。

2.1.2 黑果腺肋花楸組培苗幼嫩葉片多倍體誘導(dǎo)

當(dāng)誘導(dǎo)材料為植株頂端幼嫩葉片時(shí)，秋水仙素浸泡對(duì)葉片的生長(zhǎng)有一定影響(表 2)。隨著秋水仙素濃度和處理時(shí)間的增加，黑果腺肋花楸葉片存活率呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，經(jīng)處理的存活葉片較大一部分會(huì)形成愈傷組織，且能分化出芽。當(dāng)濃度為2 000 mg/L,浸泡48 h時(shí)，葉片愈傷組織形成率、存活率均最低。經(jīng)秋水仙素浸泡處理后的葉片誘導(dǎo)的愈傷組織均呈褐化。當(dāng)濃度1 000 mg/L,浸泡36 h時(shí)，愈傷組織形成率為53.3%，平均再生芽數(shù)為1.1，存活率為50.4%，達(dá)到了半致死劑量。

表2 秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸組培苗葉片誘導(dǎo)的愈傷組織及再生芽生長(zhǎng)的影響

2.1.3 黑果腺肋花楸愈傷組織多倍體誘導(dǎo)

秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸愈傷組織生長(zhǎng)的影響見表3。

表3 秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸愈傷組織生長(zhǎng)的影響

由表3可知，用秋水仙素浸泡誘導(dǎo)愈傷組織，當(dāng)浸泡濃度為500和1 000 mg/L時(shí)，愈傷組織的存活率均高于50%。當(dāng)浸泡濃度為1 500 mg/L、處理時(shí)間為48 h和浸泡濃度為2 000 mg/L、處理時(shí)間為36、48 h時(shí)，才小于50%。當(dāng)浸泡濃度為2 000 mg/L、時(shí)間24 h時(shí)，葉片愈傷組織增殖系數(shù)為2.4，存活率為52%，達(dá)到半致死劑量。

2.2 黑果腺肋花楸誘導(dǎo)植株初步鑒定

2.2.1 再生植株的形態(tài)學(xué)鑒定鑒定

用秋水仙素浸泡處理黑果腺肋花楸莖尖后誘導(dǎo)再生的植株(表4，圖1)，株高均低于正常植株。對(duì)于莖粗來(lái)講，處理濃度為500、1 000和1 500 mg/L、處理時(shí)間少于24 h時(shí)，莖粗大于正常植株。由表4可以看出，處理時(shí)間越長(zhǎng)，株高越矮、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)度、葉長(zhǎng)、葉寬越??；且秋水仙素濃度越高，株高越矮，莖粗、節(jié)間長(zhǎng)度、葉長(zhǎng)、葉寬越小。當(dāng)濃度為2 000 mg/L，處理時(shí)間為48 h時(shí)，植株處于死亡狀態(tài)。

表4 秋水仙素浸泡誘導(dǎo)再生植株外部形態(tài)的測(cè)定

圖1 不同秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間對(duì)

2.2.2 再生植株的細(xì)胞學(xué)鑒定法

通常經(jīng)染色體加倍后獲得的多倍體植株，株高變矮、節(jié)間長(zhǎng)度變小。故本試驗(yàn)中將株高和節(jié)間長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照組的再生植株作為假定的多倍體，再經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)之后，對(duì)再生植株葉片的保衛(wèi)細(xì)胞及保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目進(jìn)行鏡檢。結(jié)果表明，經(jīng)秋水仙素浸泡法處理的再生植株葉片的氣孔密度均顯著低于對(duì)照組，變異植株葉片鏡檢單位視野中氣孔數(shù)量小于對(duì)照植株。變異株葉片保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度和寬度均與對(duì)照植株差異顯著(表5)。為確保能夠獲得真實(shí)的染色體加倍體，試驗(yàn)將保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)量大于12的個(gè)體假定為多倍體(圖2)，并將葉綠體數(shù)多于12的細(xì)胞個(gè)數(shù)與觀測(cè)的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較從而獲得葉綠體變異率。結(jié)果表明，所得再生植株葉片中葉綠體變異率最高的處理為浸泡濃度 1 500 mg/L、處理時(shí)間36 h時(shí)，其葉綠體變異率達(dá)到33.3%(表5)。

表5 秋水仙素浸泡誘導(dǎo)再生植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和葉綠體數(shù)的測(cè)定

注：-表示未測(cè)定。

A：秋水仙素濃度1 000 mg/L,處理36 h；B：秋水仙素濃度1 500 mg/L,處理24 h；C：秋水仙素濃度1500 mg/L,處理36 h。

圖2 不同秋水仙素浸泡濃度和時(shí)間誘導(dǎo)再生植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體(16×40)

Fig.2 Chloroplasts in leaf stomatal guard cells of regenerated plantlets induced by treatments with different concentrations and soaking time of colchicine(16×40)

2.2.3 多倍體植株染色體數(shù)目的鑒定

經(jīng)秋水仙素浸泡法誘導(dǎo)的黑果腺肋花楸多倍體初步鑒定出47株假定多倍體；經(jīng)生根培養(yǎng)，成功生根7株，占總數(shù)約14.9%。檢測(cè)生根變異植株的染色體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)所得的7株生根變異植株均為二倍體(2n=2x=34±2)與四倍體(2n=4x=68±4)的混倍體，即嵌合體，其四倍體細(xì)胞所占比例最高可達(dá)12.5%(表6，圖3)。將所得嵌合體再進(jìn)行秋水仙素施入處理后，嵌合體細(xì)胞數(shù)量最高達(dá)到45.8%。未成功生根的植株進(jìn)行加大生根激素處理后，再檢測(cè)染色體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)1 500 mg/L秋水仙素浸泡處理24 h后誘導(dǎo)并獲得生根的再生植株中，出現(xiàn)1株為四倍體。試驗(yàn)中，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)六倍體及以上的細(xì)胞。

表6 不同處理再生植株的染色體倍性

注：誘變率=多倍體數(shù)/變異數(shù)。

A：二倍體細(xì)胞；B：四倍體細(xì)胞。

2.2.4 多倍體植株與對(duì)照植株外觀形態(tài)的比較

初步鑒定的植株經(jīng)3次繼代培養(yǎng)后，所得再生植株經(jīng)培養(yǎng)30 d后檢測(cè)植株形態(tài)(表7，圖4)。結(jié)果表明，多倍體植株平均株高為3.7 cm，比對(duì)照植株矮1.4 cm；多倍體植株莖粗大于對(duì)照植株、莖段長(zhǎng)度小于對(duì)照植株，而多倍體植株的葉長(zhǎng)和葉寬則明顯大于對(duì)照植株。

表7 多倍體植株與對(duì)照植株外觀形態(tài)的比較

3 討論與結(jié)論

多倍體植物在自然界中普遍存在，多倍化研究已經(jīng)成為當(dāng)前進(jìn)化生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。自然界中存在的多倍體均由自然加倍而來(lái)，但自然加倍的頻率低，而且許多自然加倍的多倍體在自然條件下不能正常生長(zhǎng)而死亡。1937年Blakeslee 等用秋水仙堿對(duì)曼陀羅等植物的染色體數(shù)進(jìn)行加倍獲得了成功[10]。之后，秋水仙素被廣泛應(yīng)用于培育植物新品種。

注：頂端第2片葉

圖4 多倍體植株與對(duì)照植株的生長(zhǎng)比較

Fig.4 Comparison of the polyploid plant with the normal diploid plant (CK) ofAroniamelanocarpaElliot

秋水仙素通過作用于有絲分裂中期使染色體加倍[11]；但不同植物品種、外植體類型和植物生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)秋水仙素的敏感度不同。一般認(rèn)為，誘變處理濃度為半致死率時(shí)，可獲得較高的誘導(dǎo)率；當(dāng)濃度一定時(shí)，植株的死亡率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高[12]。處理時(shí)間過短，分生組織的有絲分裂不能同步進(jìn)行，易得嵌合體[13]。通常，不同植物所選擇的誘導(dǎo)多倍體發(fā)生的外植體材料不同，如種子[14]、莖段[15]、離體組織[16]、叢生芽[17]、愈傷組織[18]等，以及秋水仙素處理濃度的不同，誘導(dǎo)效果均有所差異；一般來(lái)講，分裂越旺盛誘導(dǎo)的成功率越高。本試驗(yàn)中采用黑果腺肋花楸組培苗莖尖、組培苗葉片以及愈傷組織為外植體作為多倍體誘導(dǎo)材料，并通過設(shè)置4個(gè)濃度(500、1 000、1 500和2 000 mg/L)和5個(gè)處理時(shí)間(0、12、24、36和48 h)誘導(dǎo)黑果腺肋花楸多倍體發(fā)生。結(jié)果表明，黑果腺肋花楸多倍體發(fā)生，受限于不同處理下的外植體存活率；在各種處理中，愈傷組織的存活率高于莖尖、葉片。用2 000 mg/L秋水仙素處理愈傷組織24 h時(shí)，葉片愈傷組織增殖系數(shù)為2.4，存活率為52 %，接近于半致死劑量。

前人的研究結(jié)果表明，多倍體植株的株高會(huì)下降，節(jié)間長(zhǎng)度會(huì)變小，可以作為判斷多倍體植株的依據(jù)[19]；這一點(diǎn)在本試驗(yàn)中進(jìn)一步得到了驗(yàn)證。在本試驗(yàn)過程中將節(jié)間長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照組的作為假定的多倍體，對(duì)其進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)后，再對(duì)其染色體倍性檢測(cè)。結(jié)果在各處理中誘導(dǎo)再生的黑果腺肋花楸再生植株中，有7株為多倍體植株。然而，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表明，試驗(yàn)中所獲得的多倍體植株，大多為不同倍性細(xì)胞的混倍體或倍性嵌合體；不同倍性植株中，四倍體細(xì)胞所占比例最高達(dá)到12.5%。僅在1 500 mg/L秋水仙素浸泡處理24 h后誘導(dǎo)產(chǎn)生的生根的再生植株中出現(xiàn)了1株完整的四倍體植株。可見，雖然不同濃度的秋水仙素結(jié)合不同的處理時(shí)間，均可誘導(dǎo)多倍體發(fā)生，但因染色體的多倍性發(fā)生于再生植株的不同的組織器官中，多倍體細(xì)胞混合存在。說明在多倍體的誘導(dǎo)中，還需通過進(jìn)一步繼代培養(yǎng)并通過染色體數(shù)目鏡檢以便分離整株均一加倍的多倍體植株。

另外，從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，雖然多倍體發(fā)生和獲得完整的多倍體植株的概率較低，但從假定的多倍體中經(jīng)3次繼代后篩選出的四倍體黑果腺肋花楸植株，呈現(xiàn)出“巨大性”，特征非常明顯；與正常二倍體植株相比較(表7，圖4)，多倍體植株矮小、節(jié)間變短、莖干粗壯、葉片長(zhǎng)寬變大(葉片更大)，明顯區(qū)別于正常二倍體植株。總之，黑果腺肋花楸多倍體的誘導(dǎo)以愈傷組織為最佳材料；當(dāng)秋水仙素濃度為2 000 mg/L,處理時(shí)間為24 h時(shí)，增殖系數(shù)最高，而且成功誘導(dǎo)并獲得了四倍體黑果腺肋花楸植株，這項(xiàng)工作將有利于黑果腺肋花楸倍性化植株的研究，為黑果腺肋花楸多倍體的誘導(dǎo)和鑒定奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

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Polypoid induction ofAroniamelanocarpaElliot by soaking with colchicine and its preliminary identification

LI Jianxun， BA Lei， YU Huan， YU Min， LIU Bing， WU Rongzhe*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002，China)

In this experiment, shoot tips, leaves and callus ofAroniamelanocarpaElliot tissue culture as materials, influences of different colchicine concentration and treatment times on callus survival rate, regenerated bud number, regeneration ratio and polypoid occurrence were determined. After 30 days of growth, chromosome ploidy of the plants subcultured 3 times was examined by microscope, which regenerated from different explants treated by colchicine. The results showed that the survival rate and budding rate of different explants decreased with the increase of colchicine concentration and treating time. Among these, the survival rate of Aronia melanocarpa Ellio callus was higher than shoot tip and leaves. After treatment with colchicine, all three explants were able to induce the occurrence of polyploidy. The increase of concentration and treating time was better for increasing of chromosome doubling, but the death rate of explants was increased. When the callus induced from leaves was treated for 24 h by 2 000 mg/L of colchicine, its regeneration index was 2.4, survival rate was 52%. Based on plant dwarfing height and stem stoutness, 47 putative polyploid plants were screened out, but most of the plants were mixoploids (chimeric ploidy). From rooting plants regenerated from the leaf callus soaking in 1 500 mg/L colchicine for 24 h, only one plant was identified as whole plant tetraploid.

AroniamelanocarpaElliot; polyploid; colchicine; soaking method

2016-09-27 基金項(xiàng)目：吉林省科技廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20140101218JC)

李建勛(1992—)，男，吉林吉林人，在讀碩士，研究方向?yàn)閳@藝植物生物技術(shù)及生理。吳榮哲為通信作者，E-mail：wurzh@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0001-08

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.001

S663.9

A