牛皮杜鵑組織培養(yǎng)初步研究

丁洪玲， 宮 宇， 李美善， 許明子， 劉憲虎*

(1.延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所，吉林 龍井 133400；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

丁洪玲1， 宮 宇2， 李美善2， 許明子2， 劉憲虎2*

(1.延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所，吉林 龍井 133400；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

以牛皮杜鵑無菌苗為材料，分別對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、生根壯苗培養(yǎng)基和移栽基質(zhì)進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明：愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的培養(yǎng)基為WPM +3 mg/L IBA+8 mg/L ZT(pH值5.2)，白糖20 g/L；最佳生根壯苗培養(yǎng)基為WPM +0.1 mg/L NAA+1 g/L AC +0.4 mg/L IBA；篩選出的最好移栽基質(zhì)為苔蘚土，成活率達(dá)94%。

牛皮杜鵑；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基；誘導(dǎo)

牛皮杜鵑(RhododendronchrysanthumPall.)別名黃花杜鵑、牛皮茶，屬常綠無鱗杜鵑花亞屬、常綠無鱗杜鵑花組、長(zhǎng)序杜鵑花亞組[1-2]。它是常綠小灌木，花冠漏斗狀，花淡黃色或白色，在我國分布狹窄，主要生于長(zhǎng)白山岳樺林下和高山苔原上，遼寧桓仁老禿頂山、吉林大禿頂山、黑龍江尚志縣、俄羅斯的西伯利亞、朝鮮北部和日本也有一些分布[3]，是水土保持的好植物，對(duì)維持生態(tài)平衡起重要作用。牛皮杜鵑的野生資源極其有限，且近年來人為破壞較嚴(yán)重，現(xiàn)已被列為國家三級(jí)保護(hù)漸危種。牛皮杜鵑通過種子有性繁殖，但出苗率低，植株生長(zhǎng)較慢，而通過組培快繁方法則應(yīng)能如同杜鵑迅速大量的獲得再生植株。我國從20世紀(jì)80年代開始進(jìn)行杜鵑組織培養(yǎng)的研究，1982年首先報(bào)道了杜鵑的組織培養(yǎng)繁殖[4]，隨后多人發(fā)表了一些學(xué)術(shù)價(jià)值較高的研究報(bào)告[5-10]。但目前對(duì)牛皮杜鵑組織培養(yǎng)的研究鮮有報(bào)道。

該試驗(yàn)在參考前人對(duì)杜鵑花組織培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探究牛皮杜鵑的組織培養(yǎng)技術(shù)，為今后能夠快速繁殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用長(zhǎng)白山北坡采集的野生牛皮杜鵑種子經(jīng)無菌培養(yǎng)長(zhǎng)成的無菌苗的葉片和莖段做為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 牛皮杜鵑種子發(fā)芽最適溫度的篩選

將牛皮杜鵑種子用紗布包好(流水沖洗4 h后)，均勻平鋪在培養(yǎng)皿基床上(雙層紗布鋪成)，分別置于4個(gè)不同溫度(15、20、25、30 ℃)恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每個(gè)處理500粒種子，重復(fù)3次，試驗(yàn)過程中保持種子濕潤，并觀察和記錄發(fā)芽情況。

1.2.2 GA3對(duì)牛皮杜鵑種子發(fā)芽的影響

將用蒸餾水浸濕的牛皮杜鵑種子浸泡在5種不同濃度(0、200、400、600、800 mg/L)的赤霉素溶液中，經(jīng)過24 h浸泡后，均勻平鋪在培養(yǎng)皿基床中(20 ℃下恒溫培養(yǎng))。每個(gè)處理300粒種子，3次重復(fù)。試驗(yàn)過程中保持種子濕潤，并觀察和記錄發(fā)芽情況。

1.2.3 無菌苗的培養(yǎng)

將牛皮杜鵑種子用600 mg/L GA3浸泡24 h后，進(jìn)行無菌發(fā)芽。1) 種子消毒：用3層紗布將牛皮杜鵑種子包好，在無菌條件下用70%酒精漂洗20 s之后，用無菌水沖洗2次，再用0.1%HgCl2溶液消毒5 min，用無菌水沖洗5次，每次沖洗3 min并不斷攪拌，沖洗后置于無菌培養(yǎng)皿中準(zhǔn)備播種；2) 播種用培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值5.4)；3) 培養(yǎng)條件：溫度(25±2) ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間恒定12 h/d。播種后30～50 d，小苗生長(zhǎng)到2 cm時(shí)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.4 最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

無菌苗的葉片作外植體，采用WPM培養(yǎng)基，附加不同濃度的ZT和IBA，確定最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合。

1.2.5 pH值對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和叢生苗分化的影響

本試驗(yàn)設(shè)定6個(gè)pH值梯度(pH=4.8、5.0、5.2、5.4、5.6和5.8)，取無菌苗上端展開的1～3片葉,長(zhǎng)度在5 mm左右的莖段為培養(yǎng)材料。每組接種10個(gè)外植體，重復(fù)3次。40 d后調(diào)查記錄愈傷組織誘導(dǎo)率和叢生苗分化率。

1.2.6 不同碳源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

無菌苗的葉片作外植體，用1.2.4篩選確定的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別設(shè)置蔗糖、白糖、葡萄糖濃度 20, 30, 40 g/L 9個(gè)處理。每組接種10個(gè)外植體，重復(fù)3次。40 d后調(diào)查記錄愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.7 最佳生根壯苗培養(yǎng)基的篩選

當(dāng)繼代培養(yǎng)所獲得的幼苗苗高達(dá)到2 cm以上時(shí)，將幼苗從基部切下，接種到不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的生根壯苗培養(yǎng)基中(表1)，進(jìn)行生根培養(yǎng)，每個(gè)處理接種5個(gè)幼苗，重復(fù)3次。

表1 生根壯苗培養(yǎng)基試驗(yàn)方案

1.2.8 煉苗移栽

牛皮杜鵑組培苗株高達(dá)3 cm以上時(shí)，進(jìn)行煉苗移栽。煉苗過程在恒溫培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，第1天將培養(yǎng)瓶口的鋁箔紙打開1/4，第2天打開1/2，第3天全部打開，第4天進(jìn)行移栽。從培養(yǎng)瓶中取出組培苗，洗掉根部的瓊脂，移栽到不同的基質(zhì)中。澆足水后用塑料薄膜覆蓋，保持其相對(duì)濕度。7 d后逐漸揭去塑料薄膜，并做遮陰處理。煉苗期間每3 d施用0.1%的WPM培養(yǎng)液。30 d后調(diào)查記錄成活苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛皮杜鵑種子發(fā)芽的最適溫度

發(fā)芽開始的第2～4天絕大部分種子明顯吸水膨脹，從第11天開始萌發(fā)，17～22 d發(fā)芽的種子最多。20 ℃的發(fā)芽率最高，15和30 ℃的發(fā)芽率顯著下降，且發(fā)芽時(shí)間推后(表2,結(jié)果為3次重復(fù)的平均值)。15 ℃時(shí)芽(苗)生長(zhǎng)細(xì)長(zhǎng)；20和25 ℃時(shí)發(fā)芽速度快，且子葉平展，芽(苗)生長(zhǎng)量大；30 ℃時(shí)的芽(苗)生長(zhǎng)受抑制。因此，20 ℃是牛皮杜鵑種子萌發(fā)的最佳溫度。

表2 不同溫度對(duì)牛皮杜鵑種子發(fā)芽的影響

2.2 GA3對(duì)牛皮杜鵑種子發(fā)芽率的影響

用GA3處理過的牛皮杜鵑種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，6 d 后發(fā)現(xiàn)部分種子開始發(fā)芽，露出白色胚根，14 d時(shí)部分種子2片子葉已展開。到持續(xù)觀測(cè)連續(xù)5 d 不再有種子萌發(fā)為止，計(jì)算發(fā)芽率(表3,結(jié)果為3次重復(fù)的平均值)。

表3 不同濃度GA3處理對(duì)牛皮杜鵑種子發(fā)芽的影響

不使用GA3處理的牛皮杜鵑種子發(fā)芽率低，使用適宜濃度的GA3作前處理能明顯的促進(jìn)發(fā)芽。GA3濃度增加時(shí)發(fā)芽率也升高，當(dāng)GA3濃度達(dá)到600 ppm時(shí),牛皮杜鵑種子的發(fā)芽率最高，且發(fā)芽整齊，800 ppm時(shí),發(fā)芽率則下降。

2.3 最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將葉片從無菌苗上切下接種到不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種2 d后可以觀察到切口開始萎蔫。接種5 d后，部分葉片出現(xiàn)彎曲膨大現(xiàn)象，14 d時(shí)部分葉片切口處開始長(zhǎng)出愈傷組織。40 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),3、4、5號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率較高(91.7%～95.8%)，2、3、4號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織平均質(zhì)量較高(16～18.2 mg)。處理3的誘導(dǎo)率(95.8%)和愈傷組織平均質(zhì)量(18.2 mg)均達(dá)到最高值，所以本試驗(yàn)認(rèn)為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為3號(hào)培養(yǎng)基(WPM+3 mg/L IBA +8 mg/L ZT)(表4)。

表4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 pH值對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和叢生苗分化的影響

莖段的出愈時(shí)間早于葉片，接種約15 d后長(zhǎng)出愈傷組織，而葉片在接種約20 d后長(zhǎng)出愈傷組織。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著pH值的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率總體趨勢(shì)是先升高后降低，當(dāng)pH值為5.2時(shí)，其誘導(dǎo)率最高(93.33%)，分化率達(dá)到100%；而當(dāng)pH值為5.8時(shí)，未見分化現(xiàn)象。pH值為5.2時(shí),葉或莖的誘導(dǎo)率和分化率都明顯高于其他處理。所以，該試驗(yàn)認(rèn)為pH值5.2是牛皮杜鵑組織培養(yǎng)的最適酸度值(表5)。

表5 pH值對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化的影響

2.5 不同碳源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

牛皮杜鵑葉片在添加了不同種類和劑量碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)的效果差別比較明顯(表6)。

目前,蔗糖是培養(yǎng)基中最常用的碳源，葡萄糖和果糖也可以促進(jìn)組織生長(zhǎng)[11]。3種碳源都可以使牛皮杜鵑誘導(dǎo)出愈傷組織(表6)，尤其是在30 g/L蔗糖和20 g/L白糖時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率較高，綜合考慮使用量和價(jià)格等方面，白糖是最佳碳源(濃度為20 g/L)。

表6 碳源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.6 牛皮杜鵑最佳生根壯苗培養(yǎng)基的篩選

小植株接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)60 d，待所有處理都長(zhǎng)成完整的植株且生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定后，調(diào)查小苗的根長(zhǎng)、根數(shù)和莖生長(zhǎng)量(表7)。

表7 牛皮杜鵑生根壯苗培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表7 牛皮杜鵑生根壯苗培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表7分別對(duì)根長(zhǎng)、根數(shù)和莖生長(zhǎng)量進(jìn)行方差分析。

對(duì)根長(zhǎng)的F檢驗(yàn)表明，A(AC)、B(IBA)、C(NAA)各因素達(dá)到極顯著水平，說明各因素各水平對(duì)根長(zhǎng)有極顯著影響，各因素各水平多重比較結(jié)果表明：A因素的3水平間差異顯著，且水平1和水平3之間差異極顯著，水平3(AC 1 g/L)根長(zhǎng)平均值最大；B因素內(nèi)水平2、3和水平1差異顯著，且水平2和水平3差異不顯著，水平3(IBA 0.4 mg/L)平均值最大；C因素內(nèi)水平2、3和水平1之間差異顯著，且水平2和水平3之間差異不顯著，水平1(NAA 0.1 mg/L)平均值大。

對(duì)根數(shù)的F檢驗(yàn)表明，只有B因素(IBA)水平間差異顯著，表明B因素對(duì)生根數(shù)有較大影響。對(duì)B因素(IBA)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明:B因素內(nèi)水平2和水平3差異不顯著，水平1和水平3差異極顯著，而水平3(IBA 0.4 mg/L)根數(shù)平均值最大。

對(duì)莖生長(zhǎng)量的F檢驗(yàn)表明，因素A和因素B水平間差異顯著，多重比較結(jié)果表明：A因素3水平間差異極顯著，而水平3(AC 1 g/L)的平均值最大；B因素內(nèi)水平2、1與水平3之間差異顯著，且水平1和水平2差異不顯著，而水平3(IBA 0.4 mg/L)的平均值最大。

綜合上述，認(rèn)為適合牛皮杜鵑生根壯苗培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為：WPM+0.1mg/L NAA+1 g/L AC+0.4 mg/L IBA。

2.7 牛皮杜鵑最佳煉苗移栽基質(zhì)

牛皮杜鵑組培幼苗在腐蝕土(100%)和腐蝕土∶珍珠巖=1∶1的2種移栽基質(zhì)上成活率僅為68%和58%，葉片發(fā)黃，植株不健壯。而在苔蘚(100%)和苔蘚∶腐殖土=1∶1的2種移栽基質(zhì)中牛皮杜鵑組培幼苗的成活率可達(dá)90%以上，苔蘚為移栽基質(zhì)時(shí)的成活率達(dá)到94%，比苔蘚∶腐殖土=1∶1的要高些，而且葉色綠，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。所以認(rèn)為最合適移栽煉苗的基質(zhì)為苔蘚土(表8)。

表8 不同基質(zhì)對(duì)移栽苗成活率的影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理與牛皮杜鵑種子發(fā)芽

牛皮杜鵑生長(zhǎng)在寒冷高山地帶，具有獨(dú)特的生理特性和強(qiáng)大的生存能力。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),野外采集的牛皮杜鵑種子雖不一定都能萌發(fā)，但均表現(xiàn)出吸脹現(xiàn)象，說明水分可以浸透種皮，但其發(fā)芽率較低，出芽不整齊，類似于黃毛杜鵑的發(fā)芽[12]。在恒溫15和30 ℃條件下發(fā)芽率很低，在恒溫20和25 ℃條件下發(fā)芽率有所提高，且20 ℃時(shí)更為明顯，說明適宜低溫可以促進(jìn)牛皮杜鵑種子發(fā)芽。另外，適宜濃度赤霉素處理可以有效提高牛皮杜鵑種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，似乎暗示牛皮杜鵑種子內(nèi)部或種皮上可能存在抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。

3.2 pH值與牛皮杜鵑組織培養(yǎng)

在組織培養(yǎng)中，pH值是影響杜鵑生長(zhǎng)的重要因素。資料表明,杜鵑適于生長(zhǎng)在偏酸性土壤中，pH值為5.0～5.4時(shí)生長(zhǎng)較好，pH值超過6.0后杜鵑的芽增殖、生根率和生根數(shù)量急劇下降[13]。Economou(1986年)等將培養(yǎng)基的pH值設(shè)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0作對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值為5.0時(shí)對(duì)莖尖的增殖與生長(zhǎng)效果較好。

本試驗(yàn)研究表明:當(dāng)pH值為5.2時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化效果較好，這與前人在培養(yǎng)其他杜鵑品種使用的pH值是較一致的。

3.3 活性炭在牛皮杜鵑組培中的作用

活性炭具有大量小孔、巨大的表面積、吸附能力強(qiáng)的特性[14]。在生根培養(yǎng)基中，活性炭起到促進(jìn)不定根發(fā)生、提高生根率、增加根長(zhǎng)和生根數(shù)的作用[15]，原因是活性炭一方面吸附了外植體在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[16-18]；另一方面為生根提供了一個(gè)黑暗的環(huán)境，促進(jìn)了生根[19]。

本試驗(yàn)研究表明：不同濃度的AC對(duì)牛皮杜鵑的生根數(shù)影響不明顯，但對(duì)根長(zhǎng)及苗的生長(zhǎng)有顯著影響。當(dāng)AC濃度提高時(shí)，生根苗的根長(zhǎng)顯著增加且幼苗生長(zhǎng)迅速，原因是AC吸附了培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，并提供了黑暗環(huán)境，對(duì)培養(yǎng)材料的生根壯苗起到促進(jìn)作用。

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A preliminary study on tissue culture ofRhododendronChrysanthumPall

DING Hongling1, GONG Yu2, LI Meishan2, XU Mingzi2, LIU Xianhu2*

(1.CropInstitute,AgriculturalSciencesAcademyofYanbian,LongjingJilin133400,China;2.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Sterile seedling ofRhodoendronchrysanthumpallwere used as explants to screen callus induction medium and strawberry propagation rooting and transplanting medium. The results showed that WPM+8 mg/L ZT+3 mg/L IBA+20g/L Sugar (pH=5.2)was best induction medium;WPM+0.4 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1g/L AC was best medium of strawberry propagation rooting;Bryophyta of soil was the best transplanting medium, transplanting survival rate was 94%.

RhododendronChrysanthumPall.; tissue culture; medium; induction

2016-11-07

丁洪玲(1982—)，女，吉林撫松人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹参镞z傳育種。劉憲虎為通信作者，E-mail：liuxh@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0049-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.008

S685.21

A