王曉慧+張明+任雪麗+黃雅楠+王占誠(chéng)+時(shí)朝輝

摘 要：抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，簡(jiǎn)寫(xiě)為ARGs）是一種新興的環(huán)境污染物[1]，在我國(guó)禽畜養(yǎng)殖業(yè)中由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致禽畜糞便中ARGs廣泛存在，但其在環(huán)境中歸趨的研究還較少。四環(huán)素是我國(guó)禽畜養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用的抗生素，本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，研究了豬糞便中四環(huán)素耐藥基因（antibiotic resistance genes，TRGs）的分布以及遷移變化。通過(guò)普通PCR定性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)豬場(chǎng)各樣品中均檢測(cè)出TRGs。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)豬糞堆肥中tet（A）和tet（C）基因的含量相比于土壤中的tet（A）和tet（C）的含量均高0～1個(gè)數(shù)量級(jí)，而比新鮮豬糞中的分別低0～3和1～4個(gè)數(shù)量級(jí)。據(jù)此推測(cè)TRGs在新鮮豬糞、堆肥和土壤中總體呈逐級(jí)降低的趨勢(shì)，堆肥處理有利于TRGs含量的消減。

關(guān)鍵詞：四環(huán)素耐藥基因；豬糞便；堆肥；土壤；PCR；定量PCR

中圖分類號(hào) X713；X53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）09-0022-03

Abstract：Antibiotic resistance genes（ARGs）is an emerging environmental pollutants，a large amount of tetracycline in livestock breeding in China，but the migration and fate of drug resistence genes in the environment is still far more enough. This study by using modern molecular biological technology，tetracycline resistance genes（TRGs）in pig manure was studied distribution and migration of change. Through ordinary PCR detection，find TRGs were detected in all samples of pig farms. qPCR detection results showed thatthe tet（A）and tet（C）in pig manure compost are lower 0～3，1～4 logs than in fresh pig manure ，the tet（A）and tet（C）in the soil are lower 0～1 logs than pig manure composting. Presumably TRGs in manure，compost and soil is gradually decreasing trend，composting may be good for decreasing of TRGs.

Key words：TRGs；Pig manure；Compost；Soil；PCR and qPCR

1 前言

由于禽畜養(yǎng)殖中大量抗生素的濫用致使糞便中的ARGs不斷增加，當(dāng)這些糞便作為有機(jī)肥施用到土壤中是否會(huì)將ARGs傳播到土壤環(huán)境中，加重土壤環(huán)境的污染負(fù)荷，進(jìn)而危害人類健康，這是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。因此，本研究以TRGs為代表，對(duì)豬糞便、堆肥和土壤中TRGs進(jìn)行分子生物學(xué)研究，探究TRGs隨著豬糞便在環(huán)境中的遷移歸趨，為環(huán)境中TRGs的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 樣品采集 本研究的采樣地點(diǎn)是在上海市松江區(qū)某大型養(yǎng)豬場(chǎng)。

采樣時(shí)間分別為2015年3月22日，6月28日，9月18日和12月6日，分別記為3月、6月、9月和12月，每次將樣品采集后放入冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即放入-80 ℃冰箱內(nèi)低溫保存。

每次采集的樣品分為四組，分別為幼豬糞、成豬糞、豬糞堆肥和土壤。其中體重小于75kg的豬糞便作為幼豬糞；體重超過(guò)75kg的糞便作為成豬糞；新鮮豬糞發(fā)酵1～2個(gè)月的作為豬堆肥；長(zhǎng)期施用該養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)豬糞的農(nóng)田土壤為土壤。

2.2 DNA的提取 本研究糞便、堆肥和土壤樣品中總DNA提取采用DNA快速提取試劑盒（Fast DNA kit for soil，MP），具體提取方法參見(jiàn)本課題組先前研究[2]。

2.3 PCR反應(yīng) 以DNA快速提取試劑盒提取的各樣品的總DNA作為模板，進(jìn)行普通PCR定性檢測(cè)，檢測(cè)TRGs基因是否在各樣品中總DNA中含有，本研究共選取10種TRGs基因，分別為tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（E）、tet（G）、tet（M）、tet（O）、tet（S）、tet（X）。具體的定性PCR檢測(cè)操作步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[2]。

2.4 凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 利用溴化乙錠染色濃度為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有目的基因。吸取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL Loading Buffer混合均勻，點(diǎn)入已做好的瓊脂糖凝膠中，用DL2000 DNA Marer作標(biāo)尺，然后于140V電壓下，用電泳儀運(yùn)行25min左右，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶結(jié)果。

2.5 熒光定量PCR 本研究選取了2種具有代表性的四環(huán)素抗性基因（tet（A）和tet（C））進(jìn)行定量檢測(cè)。20μL的定量PCR反應(yīng)體系中包含10μL的SYBR，各0.4μL濃度為10μmol/L的上下游引物，2μL的DNA模板，7.2μL的滅過(guò)菌的超純水，將各試劑加入到PCR小管中[1]，將小管放入Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上運(yùn)行，運(yùn)行程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性600s，35個(gè)循環(huán)包括95℃變性10s，退火10s（退火溫度詳見(jiàn)文獻(xiàn)[2]），72℃延伸15s，用超純水代替樣品進(jìn)行陰性對(duì)照，每個(gè)樣品均做2次重復(fù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 普通PCR定性檢測(cè) 通過(guò)PCR定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，豬糞、堆肥和土壤中普遍存在TRGs基因。有研究發(fā)現(xiàn)在所有ARGs種類中TRGs檢出率較高，而且TRGs基因在養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水、土壤及其周圍地下水中檢出率為100%[3]。本研究所檢測(cè)的所有季節(jié)樣品中10種TRGs基因均被檢測(cè)到。tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（E）、tet（G）、tet（M）、tet（O）、tet（S）、tet（X）的檢出率分別為1、8/16、1、3/16、7/16、12/16、13/16、12/16、14/16、14/16。其檢出率大小順序?yàn)閠et（A）、tet（C）>tet（S）、tet（X）>tet（M）>tet（G）、tet（O）>tet（B）>tet（E）>tet（D）。其中tet（A）、tet（C）的檢出率最高，且在所有樣品中均檢測(cè)到，tet（E）的檢出率為7/16。張俊[4]等研究沭陽(yáng)市某養(yǎng)豬場(chǎng)周邊耕地土壤中四環(huán)素抗性基因tetA、tetC、tetE均檢測(cè)到，且豐度較高。郭怡雯[5]在研究污水處理廠中四環(huán)素耐藥基因中發(fā)現(xiàn)tet（E）的檢出率為3/8，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果較為接近，但是Zhang等[6]研究活性污泥中四環(huán)素耐藥基因，活性污泥中的tet（E）基因的檢出率為11/15，檢出率較高。本研究中tet（D）的檢出率最低，僅為3/16。同課題組的嚴(yán)劍芳等[2]先前研究結(jié)果表明tet（D）的檢出率也較低，只有1/14。Zhang等[6]研究活性污泥中四環(huán)素耐藥基因，結(jié)果活性污泥中tet（D）的檢出率為2/15；郭怡雯[5]研究污水處理廠中四環(huán)素耐藥基因發(fā)現(xiàn)tet（D）的檢出率為1/8；先前研究發(fā)現(xiàn)tet（D）在環(huán)境樣品中的檢出率較低，這與本研究結(jié)果基本一致。剩余的6種TRGs基因的檢出率范圍為8/16～14/16。嚴(yán)劍芳[2]研究發(fā)現(xiàn)這些TRGs基因的檢出率范圍為12/14～14/14；Zhang等[6]的研究表明這些TRGs基因的檢出率范圍為14/15～15/15。研究表明環(huán)境中是普遍存在這些TRGs基因。

本研究中的TRGs基因在不同環(huán)境樣品中的檢出率存在差異，檢出率從小到大依次為土壤<豬糞堆肥<幼豬糞<成豬糞測(cè)。新鮮豬糞（幼豬糞和成豬豬糞）樣品TRGs基因檢出率最高，分別為33/40～36/40；檢出率是最低的是土壤中TRGs基因，為17/40；豬糞堆肥介于兩者之間，檢出率為29/40，所有樣品中TRGs基因的檢出率相對(duì)較高，表明TRGs基因在豬糞、堆肥和土壤中廣泛存在；新鮮豬糞在經(jīng)過(guò)堆肥處理后TRGs基因的檢出率降低，TRGs基因在新鮮豬糞、堆肥和土壤中呈降低趨勢(shì)，由此表明堆肥過(guò)程對(duì)TRGs基因可能具有消減效果。

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)

3.2.1 養(yǎng)豬場(chǎng)各樣品中tet（A）的含量 由表1知，所有樣品中新鮮豬糞中tet（A）的含量均比豬糞堆肥和土壤中的高0～3個(gè)數(shù)量級(jí)，豬糞堆肥中tet（A）的含量除3月外均高于土壤，這說(shuō)明堆肥對(duì)tet（A）可能有一定的消減作用，也說(shuō)明土壤中微生物體內(nèi)含有可能通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的耐藥基因。有研究[7]發(fā)現(xiàn)在經(jīng)常施用豬糞的土壤中的TRGs中發(fā)現(xiàn)耐藥性的質(zhì)粒。分析表明耐藥基因的遷移轉(zhuǎn)化是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)的。

如圖1所示，3月和12月的不同樣品中tet（A）的含量整體變化趨勢(shì)大致相同，6月和9月的不同樣品中tet（A）的含量整體變化趨勢(shì)相同，其中6月、9月和12月與3月的不同之處在于豬糞堆肥中tet（A）的含量略微高于土壤中。

經(jīng)分析可知，新鮮豬糞中tet（A）的含量普遍高于豬糞堆肥和土壤，其可能原因是堆肥能有效降解糞便中的四環(huán)素類抗生素以及殺死攜帶抗性基因的微生物，耐藥基因進(jìn)一步消除使其含量降低。王等[8]研究了堆肥處理對(duì)豬糞便中TRGs含量變化，結(jié)果表明豬糞中TRGs含量經(jīng)過(guò)堆肥處理后顯著降低。韋蓓[9]研究了活性污泥堆肥處理對(duì)TRGs的影響，結(jié)果表明堆肥可以降解多種抗生素，包括中四環(huán)素、土霉素和金霉素。研究表明堆肥可能對(duì)tet（A）有一定的消減作用。

3.2.2 養(yǎng)豬場(chǎng)各樣品中tet（C）的含量 由表2可以看出，新鮮豬糞中的tet（C）含量在各季度中均比豬糞堆肥和土壤中的高0～3個(gè)數(shù)量級(jí)。豬糞堆肥中tet（C）含量除3月外均大于土壤中的。6月和9月幼豬糞小于成豬糞，而3月和12月則是成豬糞小于幼豬糞。其原因可能與氣溫、飼料等環(huán)境因素有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步研究。

如圖2所示，3月幼豬糞樣品中tet（C）含量最高，豬糞堆肥最低；6月成豬糞樣品中tet（C）的含量最高，土壤最低，這與9月的檢測(cè)結(jié)果一致，但是9月豬糞堆肥樣品中tet（C）的含量高于幼豬糞，這與6月的不同；12月各樣品中tet（C）的含量最高為幼豬糞，最低為土壤。不同月的各樣品中tet（C）的含量變化整體呈下降趨勢(shì)，這與tet（A）的變化趨勢(shì)大概一致。

4 結(jié)論

（1）不同季節(jié)采集的養(yǎng)豬場(chǎng)所有樣品中TRGs基因的檢出率由大到小的順序依次為成豬糞>幼豬糞>豬糞堆肥>土壤。

（2）本研究對(duì)豬糞、豬糞堆肥和土壤樣品中tet（A）和tet（C）基因含量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)，結(jié)果表明新鮮豬糞中的tet（A）和tet（C）基因的含量在各季度中均比豬糞堆肥和土壤中的高0～4個(gè)數(shù)量級(jí)，而豬糞堆肥中tet（A）和tet（C）基因的含量比土壤中的低0～1個(gè)數(shù)量級(jí)。研究結(jié)果表明，TRGs基因在豬糞、堆肥和土壤中的含量呈逐級(jí)降低的趨勢(shì)，新鮮豬糞經(jīng)過(guò)堆肥處理可能對(duì)TRGs具有消減作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Pruden A，Pei R，Storteboom H，et al.Antibiotic resistance genes as emerging contaminants：Studies in northern Colorado[J].ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY，2006，40（23）：7445-7450.

[2]嚴(yán)劍芳.四環(huán)素耐藥菌和耐藥基因在禽畜糞便、堆肥和土壤中的分布[D].上海：華東師范大學(xué)，2015.

[3]Zhang X，Zhang T，F(xiàn)ang H H P.Antibiotic resistance genes in water environment[J].APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，2009，82（3）：397-414.

[4]Zhang J，Yang X，Ge F，et al. Effects of Long-Term Application of Pig Manure Containing Residual Tetracycline on the Formation of Drug-Resistant Bacteria and Resistance Genes[J].Huanjing Kexue，2014，35（6）：2374-2380.

[5]郭怡雯.污水處理廠活性污泥中四環(huán)素耐藥基因和耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌研究[D].上海：華東師范大學(xué)，2009.

[6]Zhang T，Zhang M，Zhang X，et al. Tetracycline Resistance Genes and Tetracycline Resistant Lactose-Fermenting Enterobacteriaceae in Activated Sludge of Sewage Treatment Plants[J].ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY，2009，43（10）：3455-3460.

[7]Knapp C W，Dolfing J，Ehlert P A I，et al.Evidence of Increasing Antibiotic Resistance Gene Abundances in Archived Soils since 1940[J].ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY，2010，44（2）：580-587.

[8]Wang L，Oda Y，Grewal S，et al.Persistence of Resistance to Erythromycin and Tetracycline in Swine Manure During Simulated Composting and Lagoon Treatments[J].MICROBIAL ECOLOGY，2012，63（1）：32-40.

[9]韋蓓，黃福義，蘇建強(qiáng).堆肥對(duì)污泥中四環(huán)素類抗生素及抗性基因的影響[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014（12）：5431-5438.

（責(zé)編：張長(zhǎng)青）