孫雯鄭峰

（1. 揚州科技學(xué)院，揚州 225000；2. 中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002）

S. suis 2 中國強毒株烯醇化酶 Enolase 基因的分子克隆及蛋白生物功能研究

孫雯1鄭峰2

（1. 揚州科技學(xué)院，揚州 225000；2. 中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002）

對中國強毒株 S. suis 2 烯醇化酶 Enolase 進行克隆表達、定位分析、酶活性檢測及免疫相關(guān)功能研究，探討 Enolase在 S.suis 2 致病中的作用。基于 S. suis 2 05ZYH33 全基因組測序，對 Enolase 編碼基因進行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建 pET32a∷eno 重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入 E. coli BL21 中誘導(dǎo)表達，利用 His-Beads 和 FPLC 純化后獲得 Enolase 重組蛋白。對純化后的 Enolase 進行酶活性檢測，鑒定其糖代謝功能。然后利用 FCM 分析 Enolase 在 S. suis 2 的定位情況，最后通過外周血單核細胞 MTT 實驗檢測 Enolase對 PBMCs 活性的影響。同源性分析發(fā)現(xiàn) S. suis 2 eno 與多種細菌中 eno 高度同源。SignalP 和 TMHMM 分析發(fā)現(xiàn) Enolase 沒有信號肽也沒有跨膜區(qū)。eno 分子克隆并測序顯示長度為 1 308 bp。重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達并純化后，獲得 75 kD 的 Enolase 蛋白。純化的重組 Enolase 有將 2-PEG 轉(zhuǎn)化成 PEP 的能力。FCM 分析表明 Enolase 也存在于細菌表面。MTT 測試表明 Enolase 能夠引發(fā) PBMCs 活性的下降。Enolase 不僅在 S.suis 2 體內(nèi)參與基礎(chǔ)代謝活動，同時也存在于 S.suis 2 表面，可能通過破壞單核細胞參與感染過程。

豬鏈球菌2型（S. suis 2）；烯醇化酶；酶活性；流式細胞術(shù)；外周血單核細胞

豬鏈球菌2型（S. suis 2）是豬鏈球菌35種血清型中致病性最強、分布最廣的烈性人畜共患病原菌。近幾十年，S. suis 2 已在歐洲、美洲、亞洲的幾十個國家陸續(xù)引發(fā)了200多例散發(fā)的人群惡性感染事件［1］。尤其在2005年的中國四川省人群中暴發(fā)了規(guī)模巨大的 S. suis 2 疫情，大量患者出現(xiàn)了鏈球菌高侵襲、深部組織感染的罕見毒性休克綜合征（STSS），病死率高達 62%-82%［2］。北京中科院通過流行病學(xué)調(diào)查、動物模型、多重 PCR 及基因生物信息學(xué)分析等方法，確認了 S. suis 2 是四川省豬鏈疫情暴發(fā)和 STSS 出現(xiàn)的原因［3］。

大量研究表明暴露在病原菌細胞壁外的蛋白不僅參與細菌的免疫防御機制，也涉及細菌侵染宿主過程中一系列環(huán)節(jié)，如黏附、侵襲、定植及穿梭等［4，5］。近年報道一些在細菌體內(nèi)參與基礎(chǔ)代謝的蛋白，大都缺乏信號肽序列和細胞壁錨定結(jié)構(gòu)，但也能出現(xiàn)在細胞表面［6，7］。烯醇化酶（Enolase，ENO）似乎就是如此，在細菌細胞質(zhì)中是一個參與糖代謝的金屬酶，也能在許多病原菌胞壁外參與感染過程［10］。本研究在前期已完成 S. suis 2 05ZYH33（四川省資陽2005年疫區(qū)分離菌株）全基因組的測定，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了 CDS SSU1503 基因序列與多種細菌 Enolase 編碼基因高度同源，故推斷為Enolase 疑似編碼序列（eno），進而本研究對 eno 基因進行序列信息分析和克隆表達，檢測 eno 基因編碼蛋白 Enolase 在菌內(nèi)的酶活性和菌外的定位，并對蛋白引發(fā)的免疫抑制作用進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用實驗材料及其來源如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 eno基因生物信息學(xué)分析 利用 BLAST（ExPASy提供）進行 Enolase 蛋白質(zhì)序列相似度比對，在蛋白序列數(shù)據(jù)庫中利用 PSIBLAST 程序搜索序列顯著相似的 Enolase 同源序列。再利用 Clustal X 軟件開展多重序列比對以及分子遺傳分析軟件生成 Enolase 的系統(tǒng)進化樹。利用軟件 SignalP 4.1 和TMHMM 2.0 分別預(yù)測 S. suis 2 05ZYH33 中 Enolase的信號肽及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 Enolase 分子克隆 根據(jù) S. suis 2 05ZYH33 Enolase 序列設(shè)計合成引物（DNAStar 軟件設(shè)計，上海芃碩生物科技有限公司合成），進行 PCR 擴增。上游引物為 5'-GCGGATCC ATGTCAATTATTACTG-3'（前端帶有 BamH I 切割位點）；下游引物為 5'-GC CTCGA GTATGGATTTACCTGTTA G-3'（前端帶有Xho I 切割位點）。PCR程序：95℃ 預(yù)變性 2 min；循環(huán)30次：94℃ 變性 40 s，55℃ 復(fù)性 35 s，72℃延伸 1 min；72℃ 延伸 7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳和試劑盒回收回收后與 pMD-18T 載體連接，并轉(zhuǎn)化進入感受態(tài) E. coli DH5α。菌液 PCR 陽性者提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。用 BamH I 和 Xho I 分別對 pMD-18T∷eno 和 pET32a 進行雙酶切，用 T4 DNA 連接酶連接酶切后的目的片段，構(gòu)建成表達質(zhì)粒 pET32a∷eno，再次轉(zhuǎn)化進入感受態(tài) E. coli DH5α，菌液 PCR 陽性者提取重組質(zhì)粒，單酶切（BamH I）和雙酶切（BamH I 和 Xho I）處理后，瓊脂糖電泳后經(jīng)凝膠成像儀鑒定陽性者由上海伯豪生物技術(shù)公司測序。

表1 實驗材料

1.2.3 Enolase 表達和純化 提取重組表達載體pET32a∷eno 轉(zhuǎn)化進入感受態(tài) E. coli BL21，IPTG（異丙基-β-D-半乳糖苷）誘導(dǎo)后，用無菌 PBS 重懸離心后菌體沉淀，進行超聲裂解細菌，離心收集上清，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳、染色和脫色后，鑒定Enolase是否表達。大量培養(yǎng)重組菌 E. coli BL21（含pET32a∷eno）并誘導(dǎo)表達，超聲破碎菌液離心取上清與 His 標簽純化樹脂孵育過夜。次日將孵育物裝進層析柱中，PBS 平衡后，用5 mmol/L 咪唑洗脫非特異性蛋白，用 100 mmol/L 咪唑洗脫 Enolase 目的蛋白。目的蛋白經(jīng)快速蛋白液相層析（FPLC）法進一步得到純化，再次用 SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.4 Enolase 酶活性測定 酶催化體系為：重組Enolase（5 μg），2-PGE（2-磷酸甘油酸鹽，以 0.25-12 mmol/L 的濃度逐漸增加），HEPES（100 mmol/L，pH 7.0），MgCl2（10 mmol/L），KCl（7.7 mmol/L）。每個濃度 37℃ 條件下反應(yīng) 5 min，測定 OD240nm。以 2-PGE濃度為橫坐標，以 OD 值為縱坐標，繪出米氏方程曲線，再根據(jù) Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法計算 Enolase的米氏常數(shù) Km。

1.2.5 流式細胞術(shù)定位分析 將培養(yǎng)的 05ZYH33 菌液調(diào)整到 108CFU/mL，取 1 mL 菌液離心后用 0.01 mol/L PBS 洗沉淀3次，并重懸于 100 μL PBS 中，細菌總數(shù)約為108個。設(shè)實驗組和對照組，實驗組加入100倍稀釋的大鼠抗 Enolase 蛋白多抗血清（對照組只加入大鼠陰性血清），4℃ 孵育 1 h，離心后用0.01 mol/L PBS 洗沉淀3次再重懸于 100 μL PBS 中，加入50倍稀釋的 FITC-兔抗大鼠 IgG，4℃ 孵育 1 h，離心后用 PBS 洗滌沉淀4次并重懸，最后用 4% 多聚甲醛進行固定。用熒光激活細胞分選（FACS）技術(shù)檢測。

1.2.6 外周血單核細胞 MTT 測試 通過密度梯度離心法從健康人的全血中分離出外周血單核細胞（PBMCs），洗滌后，用細胞培養(yǎng)液 RPMI 1640（添加抗生素和 10% 胎牛血清）將 PBMCs 濃度調(diào)整到105/ mL，并鋪于96孔圓底組織培養(yǎng)板中（每孔 200 μL），細胞培養(yǎng)箱 37℃ 孵育，至細胞長滿單層。設(shè)實驗組和陰性對照組，實驗組設(shè)3個濃度，每孔加入重組 Enolase 10 μg、5 μg和0.25 μg（100 μL，各10個復(fù)孔），陰性對照組只加入 RPMI 1640（100 μL，10個復(fù)孔），細胞培養(yǎng)箱 37℃ 孵育 72 h，實驗組和對照組每孔分別加入 5 mg/mL噻唑藍溶液（MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，酶標儀 570 nm 處測定 OD值（計算復(fù)孔平均值）。

2 結(jié)果

圖1 S. suis 2 05ZYH33 Enolase蛋白進化樹

2.1 eno基因生物信息學(xué)分析

圖2 S. suis 05ZYH33 Enolase與其他相似序列的比對

BLAST 比對分析發(fā)現(xiàn)，S. suis 2 05ZYH33 CDSSSU1503基因編碼序列與 S. pyogene、S. pneumoniae、S. sobrinu、S. agalactiae、S.mutans核酸序列相似性分別都達到 88% 以上，氨基酸序列則更加保守，相似性達到 91%-96% 之間，故將S.suis 2 05ZYH33中CDSSSU1503 基因序列推斷為 Enolase 基因疑似序列。分子遺傳軟件生成 S. suis 2 05ZYH33 Enolase 蛋白進化樹（圖1，圖2）。

2.2 Enolase信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測

SignalP 4.1 和 TMHMM 2.0 分析發(fā)現(xiàn) 05ZYH33 Enolase 既沒有信號肽序列（圖3-A），也沒有跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)（圖3-B）。

圖3 SignalP 4.1和TMHMM 2.0對Enolase信號肽（A）和跨膜區(qū)（B）的預(yù)測

2.3 eno基因分子克隆

重組載體 pMD18T∷eno 和 pET32a∷eno 經(jīng)單酶切（BamH I）和雙酶切（BamH I 和 Xho I）后，核酸凝膠電泳顯示（圖4） eno 疑似片段，生物公司測序后確定 eno 長 1 308 bp。

2.4 Enolase表達及純化

重組菌 E. coli BL21（含 pET32a∷eno）誘導(dǎo)表達，進行 SDS-PAGE 電泳，與蛋白標記比對后顯示在 75 kD 處有一條明顯增多的蛋白條帶（圖5-A）。目的蛋白通過 Expasy 估算的分子量為54 kD，加上融合標簽（Trx Tag+S Tag+His Tag）分子量約為21 kD，故認為融合蛋白的分子量與預(yù)測一致。利用 FPLC 技術(shù)進行蛋白純化，每個收集管經(jīng)電泳后顯示出特異條帶（圖5-B，5-C）。

圖4 質(zhì)粒pMD-18T∷eno（A）和質(zhì)粒pET32a∷eno（B）的酶切鑒定

2.5 Enolase酶活性測定

米氏方程曲線可以看出，在 Enolase 催化下，隨著底物 2-PEG 的增加，產(chǎn)物磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）含量隨之增加（圖6-A），表明 Enolase 的確能夠?qū)?-PEG 轉(zhuǎn)化為 PEP。雙倒數(shù)作圖法得出，橫坐標軸截距為-1/Km（1.4308），縱坐標軸截距為1/Vmax（0.405 2）（圖6-B）。由此算出，Vmax=1/0.405 2，Km=1/1.430 8（即 0.7 mmol/L）。

2.6 Enolase在S. suis 2的表面分布

流式細胞術(shù)采集圖中，F(xiàn)ACS 前向角（FCS）表示 S. suis 2 05ZYH33 體積大小，側(cè)向角（SSC）表示 S. suis 2 05ZYH33 數(shù)量多少（圖7-A）。大鼠陰性血清標記 FITC 峰圖顯示對照組熒光含量較低，為1.06%（圖7-B），大鼠抗 Enolase 血清標記 FITC峰圖顯示實驗組熒光含量較高，峰圖明顯右移，為4.33%（圖7-C）。表明本室制備的鼠抗 Enolase 能夠與 05ZYH33細菌表面的 Enolase 結(jié)合，驗證了 S. suis 2 05ZYH33細菌表面確實存在 Enolase。

圖5 Enolase蛋白的SDS-PAG電泳和FPLC鑒定

2.7 外周血單核細胞MTT測試

電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不加 Enolase 的陰性對照組中 PBMCs 圓形、飽滿、透明、貼壁生長（圖8-A），而加 Enolase 孵育的實驗組中 PBMCs 數(shù)量明顯減少，脫落漂浮、透光性差（圖8-B）。酶標儀 OD570nm結(jié)果顯示，實驗組 OD 值明顯低于對照組（圖8-C），P＜0.05（實驗組中Enolase不同濃度的OD值變化不大，未圖示），暗示 Enolase 與 PBMCs 活性之間存在聯(lián)系。

圖6 純化Enolase酶活測定

3 討論

本研究通過 BLAST 蛋白序列相似度比對、Clustal 多重序列比對及分子遺傳分析發(fā)現(xiàn)，S. suis 2 05ZYH33 CDS SSU1503基因序列及氨基酸序列與多種細菌中 Enolase 序列存在高同源性，故將S.suis 2 05ZYH33中 CDSSSU1503 基因序列推斷為 Enolase基因疑似序列，同時暗示 Enolase 基因編碼序列在進化中十分保守［8］。本研究對2005年四川疫區(qū)分離獲得的強毒株 S. suis 2 05ZYH33 中 Enolase 編碼基因進行分子克隆和蛋白表達，發(fā)現(xiàn) Enolase 以可溶形式存在于重組菌中，經(jīng) His 標簽親和層析法和快速蛋白液相層析技術(shù)純化后，獲得了75 kD 的 Enolase重組蛋白，與預(yù)測相一致。酶催化實驗顯示純化的重組 Enolase 具有酶活性，能將底物 2-PEG 轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物 PEP，說明 Enolase 在 S. suis 2 體內(nèi)確實能參與基礎(chǔ)糖分解代謝。研究資料顯示，Enolase 同時也能催化糖生成逆向反應(yīng)［9］。Enolase 有兩個 Mg2+離子結(jié)合位點，當(dāng)結(jié)合一個 Mg2+后能引起 Enolase 活性位點構(gòu)型變化從而有利于結(jié)合第2個 Mg2+和底物［10，11］。生物信息學(xué)分析顯示，S. suis 2 Enolase 既沒有信號肽序列，也沒有細胞膜錨定結(jié)構(gòu)。然而，熒光激活細胞分選（FACS）技術(shù)檢測結(jié)果卻顯示Enolase 確實在 S. suis 2 細胞壁表面存在。關(guān)于細胞質(zhì)中的 Enolase 是如何穿過細胞膜在細胞壁表面存在的機制尚未明確，可能 Enolase 是通過非共價鍵結(jié)合了其他細菌表面蛋白。細菌吸附宿主細胞是侵染致病的第一步，推測 Enolase 確實可能參與了感染過程。

圖7 熒光激活細胞分揀器對S. suis 2 Enolase的胞外定位檢測

圖8 Enolase引起PBMCs凋亡

在金黃色葡萄球菌、鏈球菌（A、C、G 群）、淋病奈瑟菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌及伯氏疏螺旋體等多種病原菌細胞壁表面都發(fā)現(xiàn)存在 Enolase，促進細菌穿越基底膜，參與感染過程［12-14］。研究發(fā)現(xiàn)，S. pyogenes 胞外的 Enolase 依靠 C 末端的賴氨酸殘基結(jié)合血纖溶酶原，賴氨酸基因敲除株明顯表現(xiàn)出侵襲細胞外基質(zhì)屏障能力的減弱［15］。S. mutans 胞外的 Enolase 能結(jié)合宿主口腔中的唾液粘液素 MG2，有助于細菌定植于口腔組織，并進一步發(fā)生遷移［16］。近年來發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物的神經(jīng)組織、肌肉組織及腫瘤細胞和某些免疫細胞表面也存在 Enolase。當(dāng) S. suis 2 感染宿主時，宿主產(chǎn)生的抗細菌 Enolase 抗體也能夠結(jié)合自身的 Enolase，從而引發(fā)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致很多自身免疫性疾病的發(fā)生［17］。如急性風(fēng)濕性發(fā)熱、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、子宮內(nèi)膜異位及免疫紊亂患者血清中都檢測出升高Enolase 抗體［18］。

單核細胞具有吞噬、清除損傷或衰老細胞、產(chǎn)生抗體等作用，能夠有效抵御或清除入侵的病原生物，是機體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分［19］。本研究發(fā)現(xiàn)外周血單核細胞在 Enolase作用下，出現(xiàn)數(shù)量減少、脫落漂浮、透光性差等現(xiàn)象，表明細胞受到了損傷或發(fā)生了凋亡。MTT 比色法，是檢測細胞活性的常用技術(shù)，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶（SDH）能將 MTT 還原成藍紫色結(jié)晶沉淀，死細胞則不能［20］，因此 MTT 結(jié)晶量越大，則 OD 值越大，表明細胞活性越強。外周血單核細胞 MTT 測試顯示 PBMCs 在 Enolase 作用下，OD 值明顯下降，表明 PBMCs 活細胞數(shù)量的減少。前期溶血空斑試驗發(fā)現(xiàn) Enolase 能夠引發(fā)小鼠體內(nèi)免疫抑制狀態(tài)出現(xiàn)［21］，此結(jié)果與溶血空斑實驗結(jié)果相符。推測細菌表面Enolase 可能通過直接或間接損傷單核細胞或誘發(fā)單核細胞凋亡，從而影響單核細胞的免疫防御機制。

4 結(jié)論

同源性分析發(fā)現(xiàn) S. suis 2 05ZYH33 CDSSSU1503基因序列及氨基酸序列與多種細菌中 Enolase 序列高度同源，故推斷此序列為S. suis 2 05ZYH33 Enolase基因疑似序列。SignalP 和 TMHMM 分析發(fā)現(xiàn) Enolase沒有信號肽也沒有跨膜區(qū)。eno 分子克隆并測序顯示長度為 1 308 bp，pET32a∷eno 重組表達質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達并純化后，獲得 75 kD 的 Enolase 蛋白。FCM定位分析顯示 Enolase 也存在于細菌表面。MTT 試驗檢測表明 Enolase能夠引發(fā) PBMCs 活性的下降。

致謝：

本課題的實施得到了中國科學(xué)院微生物研究所高福實驗室豬鏈球菌課題組的支持和幫助，在此表示衷心的感謝。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning of Gene for Enolase in Highly Virulent Strains from Streptococcus suis serotype 2 and Its Protein Biological Function

SUN Wen1ZHENG Feng2
（1. Yangzhou College of Science and Technology，Yangzhou 225000；2. Institute of Military Medical Sciences，Nanjing Command，Chinese People’s Liberation Aarmy，Nanjing 210002）

To investigate the role of enolase in the pathogenesis of highly virulent strains from Streptococcus suis serotype 2，its molecular cloning，protein location analysis，enzymatic activity assay，and immune related function were studied. Based on the whole genome sequencing of S. suis 2 05ZYH33，bioinformatics of gene eno encoding enolase was analyzed. The recombinant expression plasmid pET30a∷eno was transformed into Escherichia coli BL21 competent cells，and the expression was induced. Recombinant protein enolase was obtained by the purification with His-Beads and FPLC. Then the enzyme activity of enolase was detected，and its basal metabolic function was identified. Further，F(xiàn)CM was used to analyze the localization of enolase in S. suis 2. Finally，the effect of enolase on the activity of peripheral blood monouclear cells（PBMCs）was detected by MTT test. Homology analysis showed a highly homologous of eno with that in many others. SignalP and TMHMM analysis revealed that enolase had neither signal peptide sequence nor transmembrane domain structure. Molecular cloning and sequencing illustrated that the eno fragment length was 1 308 bp. The 75 kD protein was acquired after the recombinant plasmid was induced to express and purification. Enzyme activity assay showed that the purified recombinant enolase had the ability to convert 2-PEG into PEP. FCM analysis demonstrated that enolase also existed on the surface of bacteria. The results of MTT test showed that enolase resulted in the decrease of PBMCs activity. In conclusion，enolase is not only involved in the activities of glucose metabolism in S. suis 2，but also exists on its surface，probably involving in the infection process by destroying the mononuclear cells.

Streptococcus suis serotype 2（S. suis 2）；enolase；hemolytic activity；flow cytometry；peripheral blood monouclear cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.029

2016-09-22

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31300119）

孫雯，碩士研究生， 研究方向：流行病學(xué)；E-mail：wen-sun@163.com

鄭峰，博士研究生，研究方向：流行病學(xué)；E-mail：zhengf82@gmail.com