電針對不同月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)的影響

王鑫,許安萍,曹瑾,盧夢晗,呂威,景泉凱,高揚,高譽姍,薛衛(wèi)國,李志剛

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電針對不同月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)的影響

王鑫,許安萍,曹瑾,盧夢晗,呂威,景泉凱,高揚,高譽姍,薛衛(wèi)國,李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

目的 研究電針對不同月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)的影響,探討電針治療阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)的最佳干預(yù)時間。方法 選擇4、6、9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠各20只,隨機分為模型組、電針組,以相同月齡C57BL/6野生鼠各10只作為對照組;電針治療6星期后,采用Morris水迷宮進行空間記憶行為學(xué)測試,觀察各月齡各組行為學(xué)的變化。結(jié)果 5月齡各組組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05),時間因素(day)具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01);7月齡各組組間、時間因素及交互作用比較均具有顯著性差異 (＜0.01);10月齡各組組間、時間因素、交互作用比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。各月齡各組空間探索實驗穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳距離比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。結(jié)論 電針可以改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,6～7月齡可能是電針早期干預(yù)AD的最佳治療接入點,但仍需進一步實驗機制研究討論。

電針;阿爾茨海默病;行為學(xué)測試;Morris水迷宮;APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠

阿爾茲海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆,是老年人常見的一種慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,伴有認知記憶能力損傷、智力減退和行為人格退化[1]。AD作為不可逆轉(zhuǎn)的記憶損傷性病變,目前還沒有一種有效的治療方法,臨床上針灸對AD患者的認知功能有一定改善,因此針灸對AD的作用機制值得深入研究。

Morris(morris water maze, MWM)水迷宮是英國心理學(xué)家Morris于20世紀80年代初設(shè)計,主要用于研究大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[2],是判斷實驗動物學(xué)習(xí)記憶能力的重要儀器之一。因其操作簡單、使用方便,目前廣泛應(yīng)用于藥物劑量篩選、療效初步評價等實驗研究中[3-5]。Morris水迷宮實驗是一種強迫實驗動物(大鼠、小鼠)游泳,使其學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實驗,主要用于測試實驗動物對空間位置覺和方向覺(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力。

近10年報道均證明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在6個月已經(jīng)出現(xiàn)認知障礙[6-8],而針刺能改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[9-10],本課題組對4、6、9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行電針治療后用Morris水迷宮進行行為學(xué)檢測,本文主要對比電針干預(yù)不同月齡AD模型的差異,以尋求針刺治療AD的最佳時機,為臨床治療做出指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

以4、6、9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠為AD動物模型,以同背景同月齡同性別的C57BL/6野生鼠為正常對照組。動物購自南京大學(xué)模式動物研究所[(動物批號SCXK(寧)2010-000)],清潔級,于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心屏障系統(tǒng)單籠飼養(yǎng),溫度(25±2)℃,濕度(50±20)%,自然光照,自由進食、進水。本實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 動物分組及處理

選擇各個月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠20只,隨機分為模型組10只,電針組10只,以同背景野生鼠C57BL/6野生鼠10只為對照組。

電針組電針百會及雙側(cè)涌泉,平刺2～3 mm。電針正負極分別接左右側(cè)涌泉,采用疏密波,頻率1/50 Hz,強度0.3 mA,以針柄震顫,動物保持安靜不掙扎嘶叫為度。每次電針持續(xù)15 min。

對照組、模型組以相同方法用鼠袋束縛15 min。

3組均隔日1次,連續(xù)治療6星期。

1.3 主要儀器

韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司, HANs LH202H型);0.25 mm×13 mm中研太和一次性使用無菌針灸針;Morris水迷宮(北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門中醫(yī)院中藥藥理學(xué)實驗室提供);BS-124S Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海移動信息科技有限公司生產(chǎn))。

1.4 實驗方法

采用Morris水迷宮進行學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測。電針干預(yù)6星期后的第2～6天進行水迷宮訓(xùn)練,水溫(22±2)℃,按邊緣及方向等距離將水池依次分為4個象限。水池第三象限內(nèi)放有圓形站臺,實驗前將水桶灌以清水至預(yù)定高度(水面高出平臺1 cm)。實驗前1 d將各組小鼠置于站臺上10 s適應(yīng)環(huán)境。之后實驗第1 d到第4天,各組小鼠予定位航行實驗,先將小鼠置于站臺上適應(yīng)10 s,隨后依次4個象限將小鼠面壁放入水中,分別記錄動物在水中逃避潛伏期,小鼠登上平臺5 s后終止記錄時間,最長記錄時間為60 s。第5天行空間探索實驗,撤除平臺,直接將小鼠按象限依次放入。以定位航行實驗第四象限為入水點的逃避潛伏期、空間探索實驗穿越平臺位置次數(shù)及平臺象限游泳路程為評判小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。逃避潛伏期采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,空間探索實驗中組間比較采用單因素方差分析。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮定位航行實驗

2.1.1 5月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較

5月齡重復(fù)測量方差分析顯示組間(group)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(＞0.05),時間因素(day)有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢。

第3天對照組和模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);電針組和模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。對照組在第2天開始,與第1天比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01);模型組在第3天開始與

第1天比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01);電針組在第3天開始與第1天比較出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.05);各組第4天與第1天比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01)。詳見表1。

表1 5月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表1 5月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

組別n第1天第2天第3天第4天 對照組1059.40±1.8844.63±11.892)39.21±16.822)3)43.16±7.882) 模型組1059.32±2.1247.00±14.0942.38±10.742)48.22±10.482) 電針組1058.49±3.8358.95±3.3052.17±8.691)3)41.43±16.662)

注 :與同組第1天比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型組比較3)＜0.05

4 d的逃避潛伏期的趨勢圖顯示,3組逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)都有所下降,第4天模型組和對照組稍有回增。詳見圖1。

7月齡重復(fù)測量方差分析顯示組間(group)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),時間因素(day)有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢;時間和分組的交互作用(day×group)有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同。

隨著訓(xùn)練天數(shù)增加,逃避潛伏期都有所縮短;第2天和第4天對照組和模型組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01);電針組和模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。對照組第4天與第1天比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01)。詳見表2。

表2 7月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表2 7月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

組別n第1天第2天第3天第4天 對照組1054.32±6.0647.40±10.223)42.21±17.6832.45±12.821)3) 模型組1055.30±2.2160.00±0.0053.64±11.1957.76±7.06 電針組1055.36±7.8856.17±5.632)47.09±11.9346.99±12.032)

注 :與同組第1天比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

4 d天數(shù)都有所下降,第4天模型組和電針組稍有回增。詳見圖2。

圖2 7月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

2.1.3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較

10月齡重復(fù)測量方差分析顯示組間(group)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),時間因素(day)有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢;時間和分組的交互作用(day×group)有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同。

隨著訓(xùn)練天數(shù)增加,逃避潛伏期都有所縮短;第3天和第4天對照組和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (＜0.01,＜0.05);電針組和模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.05)。對照組、電針組第4天逃避潛伏期與第1天比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01)。詳見表3。

表3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

組別n第1天第2天第3天第4天 對照組1057.37±6.8648.21±14.7841.44±15.231)3)43.44±12.531)2) 模型組1059.77±0.8457.61±5.2456.27±10.4355.40±6.74 電針組1057.46±5.5555.74±7.5442.07±17.262)41.24±12.891)2)

注 :與同組第1天比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

4 d的逃避潛伏期的趨勢圖顯示,3組逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)都有所下降,第4天對照組和電針組稍有回增。詳見圖3。

圖3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

2.1.4 不同月齡模型組逃避潛伏期比較

由圖4可見,5月齡模型組隨訓(xùn)練時間增加,逃避潛伏期減少。相對于10月齡逃避潛伏期趨勢圖的波動,7月齡的逃避潛伏期趨勢圖相對平穩(wěn)。

2.1.5 不同月齡電針組逃避潛伏期比較

由圖5可見,5月齡電針組的逃避潛伏期隨時間增加,逃避潛伏期減少,趨勢最明顯;7月齡的逃避潛伏期后2 d相對持平;10月齡隨著訓(xùn)練時間增加,逃避潛伏期持續(xù)降低,但個體差異大。

圖4 不同月齡模型組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

圖5 不同月齡電針組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

表4 各月齡各組空間探索實驗穿越平臺位置次數(shù)、平臺象限游泳路程比較 (±s,s)

表4 各月齡各組空間探索實驗穿越平臺位置次數(shù)、平臺象限游泳路程比較 (±s,s)

組別月齡n穿越平臺位置次數(shù)平臺象限游泳路程 對照組5月齡101.32±0.881)312.88±134.21 模型組100.55±0.45210.10±118.71 電針組101.22±1.011)284.65±146.39 對照組7月齡102.00±0.662)349.42±70.702) 模型組100.73±0.46205.05±67.14 電針組100.87±0.59216.26±77.96 對照組10月齡101.36±0.621)276.26±38.59 模型組100.60±0.41219.10±70.95 電針組101.07±0.621)267.93±87.60

注 :與模型組比較1)＜0.05,2)＜0.01

2.2 空間探索實驗

各月齡各組空間探索實驗穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳距離比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。各月齡模型組穿越平臺次數(shù)均明顯低于對照組(＜0.05,＜0.01)。7月齡模型組平臺象限游泳路程低于對照組(＜0.01)。5月齡和10月齡電針組穿越平臺次數(shù)高于模型組(＜0.05)。詳見表4。

3 討論

Morris水迷宮行為學(xué)測試定位航行與空間搜索實驗成績分別反映動物的學(xué)習(xí)記憶能力和記憶保持能力[11]。在AD的臨床治療上,針刺可以起到改善患者記憶和學(xué)習(xí)能力的效果,但在AD發(fā)病過程中,針灸治療最佳的治療介入時間,是在AD的發(fā)病前,還是早期,是本研究最主要的研究目的。

中醫(yī)學(xué)認為AD病機是“腎虛、痰濁阻絡(luò)”,本課題組采用電針百會、涌泉配穴干預(yù)AD模型發(fā)病。該配穴處方來源于古代醫(yī)籍,《標幽賦》記載:“天地人三才也,涌泉同璇璣、百會?！币惶煲坏?一上一下,百會、涌泉穴能溝通上下之經(jīng)氣,開通人體上下兩部,可益智開竅,疏通經(jīng)脈,從而達到改善AD學(xué)習(xí)記憶功能的效果。

7月齡前可能是AD模型出現(xiàn)學(xué)習(xí)功能障礙早期。5月齡重復(fù)測量方差分析說明時間和分組之間不存在交互作用,且組間差異不隨時間變化而變化,模型組隨著學(xué)習(xí)時間的增長,逃避潛伏期與第1天有明顯的差異,說明模型組大鼠也學(xué)會了空間探索尋找平臺的能力,只是空間記憶能力下降,說明5月齡的APP/PS1小鼠并沒有喪失空間學(xué)習(xí)記憶能力,電針組和模型組沒有明顯的差異(＞0.05);7月齡,模型組和電針組第2、3、4天逃避潛伏期與第1天比較無明顯差異,模型組和電針組沒有學(xué)會空間認知,空間記憶能力喪失,而早期電針治療已有明顯的效果,電針組和模型組的逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);10月齡,模型組同樣沒有學(xué)會空間認知,空間記憶能力喪失,電針組逃避潛伏期較模型組也有明顯縮短(＜0.05)。綜上,電針可以改善AD模型的學(xué)習(xí)記憶能力。

電針可以改善AD模型的空間探索能力,各月齡模型組穿越平臺次數(shù)均明顯低于對照組(＜0.05,＜0.01)。7月齡模型組平臺象限游泳路程低于對照組(＜0.01)。5月齡和10月齡電針組穿越平臺次數(shù)高于模型組(＜0.05)。

6～7月齡可能是針灸早期干預(yù)的最佳時期。老年斑是AD發(fā)病過程中的主要病理,其主要成分是Ab,本課題組前期研究證明,針刺對5月齡的Ab水平有下降的趨勢,但無明顯差異[12];7月齡時Ab40、42水平都急劇增多,模型組較對照組差異明顯,而針灸組治療后也較模型組有明顯的降低[13];本課題組Elisa檢測10月齡Ab含量,稀釋3600倍結(jié)果仍超出范圍;Ab有可溶性和不可溶性之分[14],針灸治療主要作用于可溶性Ab的代謝,在10月齡的AD模型內(nèi)已存在大量的老年斑斑塊[15],根據(jù)水迷宮結(jié)果顯示,各月齡模型組和電針組的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所下降;5月齡模型組和電針組隨訓(xùn)練時間增加,逃避潛伏期減少;7月齡模型組的逃避潛伏期變化相對平穩(wěn),電針組干預(yù)后,逃避潛伏期縮短;10月齡模型組逃避潛伏期趨勢圖的波動,說明模型組空間探索能力受到損害,電針組逃避潛伏期持續(xù)降低,但個體差異大。

AD發(fā)病機制復(fù)雜,不僅有老年斑的沉積、tau蛋白纏結(jié)、小膠質(zhì)細胞活化、神經(jīng)元丟失,學(xué)習(xí)記憶能力的減退與病理相聯(lián)系[16],本實驗結(jié)果顯示,電針可以改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,但相關(guān)機制還需要進一步的研究,未來可以擴大樣本量,并與病理指標做相關(guān)性分析,找出電針干預(yù)AD的最佳時機的機制,指導(dǎo)臨床AD的治療。

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Effect of Electroacupuncture on the Behavior of APP/PS1 Transgenic Mice of Different Age

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Objective To study the effect of electroacupuncture on the behavior of APP/PS1 transgenic mice of different age, and to explore the optimal intervention time of electroacupuncture in treating Alzheimer’s disease (AD). Method APP/PS1 double-transgenic mice of 4 months, 6 months and 9 months old, 20 in each age group, were randomized into a model group and an electroacupuncture group, and ten C57BL/6 wild-type mice were taken as a control group; after 6-week electroacupuncture treatment, the Morris water maze was adopted for spatial memory and behavioral test, and the changes of behavior in each group were observed. Result Of the 5-month-old mice, there were no significant between-group differences (＞0.05), while the time factor (day) produced a statistical significance (＜0.01); of the 7-month-old mice, there were significant differences considering the different groups, time factor and interaction (＜0.01); of the 10-month-old mice, there were significant differences considering the different groups, time factor and interaction (＜0.05). The spatial probe test showed that there were significant between-group differences in comparing the platform crossings and swimming distance in platform quadrant in each age group (＜0.05). Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory of APP/PS1 double-transgenic mice, the age of 6-7 months old is possibly the optimal intervention time of electroacupuncture for AD, but there still requires further mechanism studies.

Electroacupuncture; Alzheimer disease; Behavior rating scale; Morris water maze; APP/PS1 transgenic mice

1005-0957(2017)05-0614-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.05.0614

國家自然科學(xué)基金項目(81273826,81273825)

王鑫(1988—),女,博士生,Email:xinflare827@126.com

李志剛(1965—),男,教授,Email:lizhigang620@126.com 薛衛(wèi)國(1968—),男,教授,Email:snowmanxue@163.com

2016-11-03