鐘靜+胡穎+陳亞波+宋群星

摘要：類成束阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan proteins，簡(jiǎn)稱FLAs）是一類廣泛分布于植物體內(nèi)的富含羥脯氨酸的糖蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)構(gòu)建中發(fā)揮著重要作用?；谝压嫉挠衩椎鞍讛?shù)據(jù)庫(kù)確定了26個(gè)FLA蛋白，并對(duì)其理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)、蛋白結(jié)構(gòu)和功能域等進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，F(xiàn)LA蛋白氨基酸長(zhǎng)度在249～682個(gè)之間，理論等電點(diǎn)在4.99～10.76之間，主要定位在質(zhì)膜上，多數(shù)為疏水性蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等元件組成；部分蛋白空間結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)保守性。

關(guān)鍵詞：玉米；FLA；蛋白家族；基因家族；生物信息學(xué)；理化性質(zhì)；結(jié)構(gòu)特征

中圖分類號(hào)： Q943.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0023-05

阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan proteins，簡(jiǎn)稱AGPs）是一類富含羥脯氨酸的糖蛋白[1]。根據(jù)核心蛋白骨架差異，AGPs被分為經(jīng)典AGPs（classical AGPs）、非經(jīng)典AGPs（non-classical AGPs）、賴氨酸富集AGPs（lysine-rich AGPs）、AG多肽（AG peptides）、類成束蛋白AGPs（fasciclin-like arabinogalactan proteins，簡(jiǎn)稱FLAs）、類木質(zhì)形成素AGPs（xylogen-like AGPs，簡(jiǎn)稱XLAs）和類植物藍(lán)素AGPs（phytocyanin-like AGPs，簡(jiǎn)稱PLAs）等7類[2-4]。AGPs的蛋白骨架一般包括N端信號(hào)肽和1段長(zhǎng)度可變且富含脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）的區(qū)域（PAST）[1]。經(jīng)典AGPs還包含1個(gè)C端GPI錨定信號(hào)。FLAs作為AGPs的1個(gè)亞類，除具有AGPs的典型結(jié)構(gòu)之外，還含有1～2個(gè)成束蛋白結(jié)構(gòu)域（fasciclin domains，簡(jiǎn)稱FAS）[5]。

FLAs在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，F(xiàn)LAs參與了莖、側(cè)根、花粉小孢子發(fā)育，以及棉花纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)等過(guò)程[6-8]，此外還可影響植株莖的強(qiáng)度和彈性[9]。對(duì)其作用機(jī)制的研究表明，F(xiàn)LAs可能是通過(guò)影響細(xì)胞壁的形成從而發(fā)揮其生物學(xué)功能[10-13]。目前已經(jīng)在擬南芥、油菜、水稻、小麥中分別鑒定出了21、33、27、34個(gè)FLAs[3，5，14-15]，但是在重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物玉米中還未見(jiàn)關(guān)于FLAs的報(bào)道。因此，本研究采用生物信息學(xué)方法，對(duì)玉米FLAs蛋白家族成員進(jìn)行全面的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，并進(jìn)一步分析其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和功能域等特點(diǎn)，以期為進(jìn)一步揭示植物FLAs的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1序列來(lái)源

分別從Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）、Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載玉米中含有FAS結(jié)構(gòu)域的蛋白序列[16-17]。將獲得的序列提交到maizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列。從擬南芥官方數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）中下載獲得擬南芥FLAs基因和蛋白序列數(shù)據(jù)。

1.2序列分析

利用Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算相對(duì)分子量及理論等電點(diǎn)。利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、Plant- mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）分析蛋白信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位[18]。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析蛋白親水性/疏水性。利用NPS（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_hnn.html）分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3模體識(shí)別

利用MEME program3（http：//meme-suite.org/）模體搜索工具識(shí)別FLAs家族相關(guān)蛋白質(zhì)所共有的模體，并對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行修改，將可找到的模體數(shù)最大值調(diào)整為15個(gè)，每個(gè)模體的最大寬度調(diào)整為100，其他均為默認(rèn)值[19]。

1.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

應(yīng)用多序列比對(duì)工具ClustalX 1.83對(duì)玉米、擬南芥FLAs氨基酸全序列進(jìn)行比對(duì)[20]。采用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，簡(jiǎn)稱NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21]。通過(guò)隨機(jī)逐步比較的方法搜索最佳系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)生成的系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行Bootstrap校正。

2結(jié)果與分析

2.1玉米FLAs家族成員的鑒定和理化性質(zhì)分析

分別從Pfam、Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)下載玉米中含有FAS結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，并將獲得的序列分別提交到maizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得其全長(zhǎng)序列。對(duì)來(lái)源于2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)全長(zhǎng)進(jìn)行交叉比對(duì)，去除重復(fù)序列。進(jìn)一步將獲得的蛋白序列提交到SignalP 4.1檢測(cè)N端信號(hào)肽，不含有信號(hào)肽的不屬于AGPs家族。對(duì)含有信號(hào)肽的序列手動(dòng)查找其中富含PAST的區(qū)域，并將蛋白序列提交到PSORT檢測(cè)C端糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定信號(hào)，最終獲得了26個(gè)玉米FLAs并分別命名為 ZmFLA1～ZmFLA26（表1）。

對(duì)這26個(gè)ZmFLAs進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)分析表明，氨基酸序列長(zhǎng)度在249～682個(gè)之間，分子量在25 175.47～72 410.16 u 之間，理論等電點(diǎn)在4.99～10.76之間（表1）。亞細(xì)胞定位分析顯示，絕大多數(shù)ZmFLAs都定位在質(zhì)膜上，其中 ZmFLA8、ZmFLA14除定位在質(zhì)膜上外，還可能定位在核中，而ZmFLA5則僅定位在核上（表1）。親水性/疏水性分析顯示，ZmFLA2/6/24 親水區(qū)域明顯大于疏水區(qū)域，說(shuō)明這3個(gè) ZmFLA 蛋白親水性較強(qiáng)，為親水性蛋白；其余23個(gè) ZmFLA 蛋白為疏水性蛋白（表1）。N-糖基化位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有 ZmFLAs 都至少含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，ZmFLA22 甚至包含7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（表1），說(shuō)明ZmFLAs蛋白骨架可能具有較高的糖基化修飾率。

2.2ZmFLAs系統(tǒng)進(jìn)化和序列特異性分析

對(duì)玉米、擬南芥中的FLAs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，26個(gè)ZmFLAs、21個(gè)AtFLAs被聚類在8個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支中（圖1-A）。分支Ⅷ僅含有2個(gè)AtFLAs，其余7個(gè)分支都同時(shí)有ZmFLAs、AtFLAs的分布。但是在同一分支中的ZmFLAs、AtFLAs 并無(wú)明顯交叉分布，來(lái)源于不同物種的FLAs通常分別聚類在小的分支中。例如分支Ⅱ含有2個(gè)擬南芥FLAs、5個(gè)玉米FLAs，其中AtFLA1、AtFLA2聚類在1個(gè)小分支中，而ZmFLA4/10/19聚類在另1個(gè)小分支中。進(jìn)一步的序列特異性分析顯示，盡管玉米、擬南芥的FLAs都含有模體1，但是不同的FLAs含有其他不同的模體。同時(shí)，處于同一個(gè)進(jìn)化分支中的FLAs往往具有類似的模體。例如進(jìn)化分支Ⅰ中，AtFLA3/5/14、ZmFLA14都含有模體1、模體7、模體8、模體11，ZmFLA12/16/25則含有模體1、模體8、模體11；模體10僅出現(xiàn)在分支Ⅱ、Ⅲ的蛋白質(zhì)序列中，而模體4、模體5、模體9僅出現(xiàn)在分支Ⅴ中（圖1-B）。

2.3ZmFLAs蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)NPS程序?qū)@26個(gè)ZmFLAs蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，蛋白質(zhì)均由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件組成，但是這3種元件的比例和分布存在差異。其中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，在38.05%～58.97%之間；其次為 α-螺旋，在25.93%～46.83%之間；延伸鏈所占比例最低，在8.86%～21.63%之間（表2）。進(jìn)一步利用Swiss-Model同源建模的方法預(yù)測(cè)這26個(gè)ZmFLAs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。從圖2可以看出，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等元件組成，其中ZmFLA1/2/3/7/13/17/22/23/24空間結(jié)構(gòu)較為保守；ZmFLA8/12/14/16/18/19/25與這些蛋白類似，但是空間結(jié)構(gòu)明顯較為松散；其余ZmFLAs的結(jié)構(gòu)則與上述蛋白存在明顯差異，其中ZmFLA5/10/11/20結(jié)構(gòu)較類似。

3結(jié)論與討論

本研究通過(guò)多種數(shù)據(jù)庫(kù)和在線軟件，對(duì)玉米FLA蛋白基因家族進(jìn)行了全面的鑒定和分析。結(jié)果顯示，從玉米全基因組中共鑒定出了26個(gè)FLAs，對(duì)其理化性質(zhì)的研究顯示，大多數(shù)ZmFLAs都是疏水性氨基酸。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)ZmFLAs定位在質(zhì)膜上，這可能與FLAs參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[13]。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，玉米、擬南芥FLAs被聚類在8個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支中，每個(gè)進(jìn)化分支中都有玉米、擬南芥FLAs蛋白的分布，暗示在單子葉、雙子葉植物中，該家族成員可能擁有共同的祖先。但是，在每個(gè)進(jìn)化分支中，不同物種來(lái)源的FLAs蛋白并沒(méi)有呈現(xiàn)交叉分布，這說(shuō)明該蛋白基因家族的擴(kuò)張可能是發(fā)生在單子葉、雙子葉植物進(jìn)化之后，并且其擴(kuò)張?jiān)趩巫尤~、雙子葉植物中是獨(dú)立進(jìn)行的。

目前認(rèn)為，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定二級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)又決定著三級(jí)結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)的功能往往取決于其空間結(jié)構(gòu)。本研究對(duì)26個(gè)ZmFLAs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，ZmFLAs蛋白包含α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等元件。其中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，α-螺旋次之，延伸鏈比例最低。同時(shí)，各個(gè)ZmFLAs中不同元件的比例和分布也存在差異。進(jìn)一步的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，盡管部分 ZmFLAs 的空間結(jié)構(gòu)十分保守或者類似，但是其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和聚合角度也存在明顯差異，這暗示不同的ZmFLAs可能具有各自獨(dú)特的功能。

已有關(guān)于FLAs的報(bào)道主要集中在雙子葉模式植物擬南芥中，鮮見(jiàn)對(duì)單子葉經(jīng)濟(jì)作物中FLAs生物學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法鑒定了玉米FLAs蛋白家族成員，并對(duì)FLAs的基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了詳細(xì)分析，以期為深入探討ZmFLAs的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ellis M，Egelund J，Schultz C，et al. Arabinogalactan-proteins：key regulators at the cell surface？[J]. Plant Physiology，2010，153（2）：403-419.

[2]Schultz C，Johnson K，Currie G，et al. The classical arabinogalactan protein gene family of arabidopsis[J]. The Plant Cell，2000，12（9）：1751-1768.

[3]Ma H，Zhao J. Genome-wide identification，classification，and expression analysis of the arabinogalactan protein gene family in rice （Oryza sativa L.）[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（10）：2647-2668.

[4]馬浩力，余禮，梁榮洪，等. 高等植物阿拉伯半乳糖蛋白的功能研究[J]. 中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2015，45（2）：113-123.

[5]Johnson K L，Jones B J，Bacic A，et al. The fasciclin-like arabinogalactan proteins of Arabidopsis. A multigene family of putative cell adhesion molecules[J]. Plant Physiology，2003，133（4）：1911-1925.

[6]Li J，Yu M，Geng L，et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein gene，F(xiàn)LA3，is involved in microspore development of Arabidopsis[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2010，64（3）：482-497.

[7]Johnson K，Kibble N，Bacic A，et al. A fasciclin-like arabinogalactan-protein （FLA） mutant of Arabidopsis thaliana，fla1，shows defects in shoot regeneration[J]. PLoS One，2011，6（9）：e25154.

[8]Huang G，Gong S，Xu W，et al. A fasciclin-like arabinogalactan protein，GhFLA1，is involved in fiber initiation and elongation of cotton[J]. Plant Physiology，2013，161（3）：1278-1290.

[9]Macmillan C，Mansfield S，Stachurski Z，et al. Fasciclin-like arabinogalactan proteins：specialization for stem biomechanics and cell wall architecture in Arabidopsis and Eucalyptus[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2010，62（4）：689-703.

[10]Shi H，Kim Y，Guo Y，et al. The Arabidopsis SOS5 locus encodes a putative cell surface adhesion protein and is required for normal cell expansion[J]. The Plant Cell，2003，15（1）：19-32.

[11]Persson S，Wei H，Milne J，et al. Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（24）：8633-8638.

[12]Seifert G，Xue H，Acet T. The Arabidopsis thaliana fasciclin like arabinogalactan protein 4 gene acts synergistically with abscisic acid signalling to control root growth[J]. Annals of Botany，2014，114（6）：1125-1133.

[13]Wang H，Jiang C，Wang C，et al. Antisense expression of the fasciclin-like arabinogalactan protein FLA6 gene in Populus inhibits expression of its homologous genes and alters stem biomechanics and cell wall composition in transgenic trees[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（5）：1291-1302.

[14]Faik A，Abouzouhair J，Sarhan F. Putative fasciclin-like arabinogalactan-proteins （FLA） in wheat （Triticum aestivum） and rice （Oryza sativa）：identification and bioinformatic analyses[J]. Molecular Genetics and Genomics，2006，276（5）：478-494.

[15]Showalter A，Keppler B，Lichtenberg J，et al. A bioinformatics approach to the identification，classification，and analysis of hydroxyproline-rich glycoproteins[J]. Plant Physiology，2010，153（2）：485-513.

[16]Finn R，Mistry J，Schuster-Bckler B，et al. Pfam：clans，web tools and services[J]. Nucleic Acids Research，2006，34：D247-D251.

[17]Quevillon E，Silventoinen V，Pillai S，et al. InterProScan：protein domains identifier[J]. Nucleic Acids Research，2005，33：W116-W120.

[18]Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[19]Bailey T L，Williams N，Misleh C，et al. MEME：discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs[J]. Nucleic Acids Research，2006，34：W369-W373.

[20]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X Windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[21]Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.