李占濤 賈孟輝 蘇 丹 左艷麗 于凌志 黑曉英 李宏偉

( 1． 寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004； 2． 寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750001； 3． 回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

回藥“失荅剌知丸”對大鼠腦缺血再灌注后Delta樣配體4表達(dá)的影響△

李占濤1，3賈孟輝2，3*蘇 丹1左艷麗1于凌志1黑曉英1李宏偉1

( 1． 寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004； 2． 寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750001； 3． 回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

目的：探討失荅刺知丸對大鼠腦缺血再灌注后Delta樣配體4表達(dá)的影響。方法：將102只SD大鼠隨機分為17組，每組6只，分別為：空白組、假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、失荅剌知丸低劑量組、失荅剌知丸中劑量組、失荅剌知丸高劑量組，其中模型組和給藥組又根據(jù)再灌注時間分為1d、3d、7d組。 以上各組除空白、假手術(shù)組外，均采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)。各組在觀察飼養(yǎng)相應(yīng)天數(shù)后取材，采用蛋白免疫印跡法(Western blot)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，測定腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Delta樣配體4的相對表達(dá)情況。結(jié)果： Western blot、PCR結(jié)果顯示，與模型組相比，失荅剌知丸各組Delta樣配體4表達(dá)顯著升高，與尼莫地平組比較，失荅剌知丸高劑量組Delta樣配體4的表達(dá)顯著增高(P<0.05)。結(jié)論：失荅剌知丸對腦缺血大鼠再灌注后損傷腦組織中的Delta樣配體4表達(dá)有促進作用，可能是失荅剌知丸治療腦缺血再灌注的重要機制之一。

失荅剌知丸；腦缺血再灌注；Delta樣配體4；回回藥方

腦卒中(stroke)，又被稱為中風(fēng)或腦血管意外(cerebrovascularaccident)，是世界三大致死疾病之一。[1]20年來,隨著人口增長和老齡化沖擊，我國腦卒中發(fā)病率正以每年9%的速度上升，其中以缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)居多，約占85%以上。因其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點，給個人和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重威脅我國人民健康及社會發(fā)展。研究表明，缺血性腦卒中的病因復(fù)雜。治療以恢復(fù)神經(jīng)功能；減少腦缺血再灌注損傷所引起的細(xì)胞凋亡；促進缺血后血管修復(fù)為原則。其中促進受損血管修復(fù)，恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)，尤為關(guān)鍵。本研究是在回藥經(jīng)典方 “失荅刺知丸”能夠有效治療缺血性腦血管病的基礎(chǔ)上，應(yīng)用線栓法制備大鼠MCAO模型，予以失荅剌知丸治療后，檢測大鼠腦缺血再灌注后損傷腦組織內(nèi)Delta樣配體4 的表達(dá)，對該方發(fā)揮治療作用的機制進行初步的探討。

1 材料

1.1 實驗動物及分組:SD雄性大鼠102只，鼠齡3～4個月，體重為230±20g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠于同一動物房中飼養(yǎng)，溫度25±l℃，濕度50±10 %，光暗周期12h/12h，自由進食與飲水；適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后進行實驗。隨機將6只大鼠歸為一組，分為：空白組，假手術(shù)組，模型1d、3d、7d組，尼莫地平1d、3d、7d組，失荅剌知丸高劑量1d、3d、7d組，失荅剌知丸中劑量1d、3d、7d組和失荅剌知丸低劑量1d、3d、7d組。

1.2 實驗藥物及試劑1.2.1 實驗藥物：失荅剌知丸：柴胡31g、黑訶子31g、撒額冰(阿魏)9g、蘆薈 62g 、白芥子9g、失荅剌知(血根草)6g、沙哈木罕荅里(藥西瓜)9g、胡椒3g 、安息香9g、巴豆霜9g、菖蒲6g、番鹽6g、阿里公(松蕈)9g、干姜9g 、蓽茇9g 、蕓香9g；藥物由寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。參照大鼠體表面積劑量換算系數(shù)公式，計算給藥劑量；將生藥材去除雜質(zhì)，切制后，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量的水，浸泡60 min后用TC—15套式恒溫器250V電壓加熱煎煮；安息香、阿魏后下，沸騰后將電壓調(diào)低至150V，保持微沸狀態(tài)煎煮30 min，濾取煎液；藥渣再加入生藥材8倍量的水，浸泡30 min后煎煮，保持微沸狀態(tài)煎煮30 min，濾取煎液；合并2次煎液，將藥液用恒溫水浴鍋(100℃)濃縮至每1mL水煎劑中分別含生藥4.5g、3.0g、1.5g，即失荅剌知丸方高劑量為4.5g/mL、中劑量為3.0g/mL、低劑量為1.5g/mL，相當(dāng)于臨床等效劑量的3倍、2倍、1倍。置冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尼莫地平片：由拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供(規(guī)格：20mg×50片，批號：H23021402)。將尼莫地平研碎加水配成濃度為1.08g/L的混懸液備用。

1.2.2 試劑：造模：10%水合氯醛、酒精等。Western blot:全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒、WesternBlotting 檢測試劑盒、ECL 檢測試劑盒、Braford 蛋白含量檢測試劑盒、預(yù)染蛋白分子量、麗春紅染色液、顯色液、定影液、 Dll4兔多抗等。 RT-PCR:超純RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR 試劑盒、5x RNA Loading Buffer等。以上試劑均購自興慶區(qū)西寶生物科技有限公司。

1.3 造模及給藥

1.3.1 造模：參照改良的Longa[2]法用線栓阻塞大鼠左側(cè)大腦中動脈制備局灶性腦缺血動物模型。術(shù)前大鼠稱重，按0.3mL/100g劑量以10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，60W白熾燈照射，保持大鼠肛溫在37℃。大鼠仰臥位固定，頸部常規(guī)消毒，切開皮膚，鈍性分離組織、肌肉，暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)，分離頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，電凝甲狀腺上動脈、枕動脈等小動脈。頸總、頸內(nèi)動脈掛粗線，結(jié)扎ECA近心端、遠(yuǎn)心端，從中間剪斷。于頸外動脈近分叉處用眼科剪開一小口，牽拉頸外動脈殘端與頸內(nèi)動脈成一直線，將線栓從頸外動脈上的小口插入，放松頸內(nèi)動脈，將線栓插至有阻塞感，插入深度18±2mm。結(jié)扎線栓與頸外動脈殘端以固定線栓，防止其脫落或插入過深。松開CCA，線栓隨頸總動脈搏動，表示頸內(nèi)動脈未完全阻塞，示插線成功?？p合皮膚，移至籠中待自然蘇醒。再灌注：在置入栓線2h后再次麻醉，剪開創(chuàng)口，由露出的栓線尾部將栓線柔和地抽出，當(dāng)栓線球面前端退至ECA結(jié)扎線時遇到阻力，此時停止拔線，剪除栓線的殘端，縫合皮膚，消毒創(chuàng)面。大鼠清醒后自由進食、飲水。

1.3.2 給藥：空白組、假手術(shù)組及模型組以生理鹽水灌胃2次/d；尼莫地平組給予1.08g/L尼莫地平混懸液灌胃；失荅剌知丸低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予濃度1.5g/mL、3.0g/m、4.5g/mL的失荅剌知丸水煎劑。大鼠灌胃劑量為1mL/100g。給藥組分別在制作腦缺血再灌注模型前30 min予以第1次灌胃，造模成功后每天灌胃2次。

1.4 動物模型評價及取材：再灌注2h后對模型進行評價：右側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；倒懸時左上肢向胸前屈曲；行走時身體向右側(cè)傾倒或向右轉(zhuǎn)圈；右側(cè)出現(xiàn)Honer’s癥為造模成功。排除無神經(jīng)損傷癥狀；蛛網(wǎng)膜下腔出血；鏡下觀察無缺血病理改變；未到觀察時間點死亡的動物模型。

于各組指定飼養(yǎng)時間后斷頭剝?nèi)∧X組織：大鼠麻醉后放于冰袋上打開胸腔，暴露心臟，經(jīng)心尖搏動處插管，用0.9%的生理鹽水300mL快速沖洗，肝臟變白后迅速在冰上斷頭，剝?nèi)⊥暾X，濾紙吸去表面水分，去除嗅球、小腦和低位腦干，取5mm厚的腦組織置于凍存管內(nèi)，液氮保存?zhèn)溆肳estern blot和RT-PCR檢測。

1.5 Western blot：常規(guī)方法提取缺血腦組織蛋白，用BCA法進行蛋白定量，再行SDS- PAGE電泳分離蛋白,取25μg樣品，以12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，5% BSA封閉，兔抗大鼠Delta4單克隆抗體稀釋比例1∶1000，4℃下?lián)u床孵育2h。山羊抗兔二抗1∶3000比例稀釋，β-actin稀釋比例1: 1000，4℃下?lián)u床孵育1h。洗膜后以目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參β-actin條帶灰度的比值表示蛋白的表達(dá)水平。顯色后，對圖像進行分析。

1.6 RT-PCR實驗步驟 ：用TRIzol一步法提取 RNA，超純RNA提取試劑(TaKaRa Code D9108B)提取組織樣本中總RNA。取5μLRNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser (TaKaRa code DRRO47A)對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa code DRRO47A)進行反轉(zhuǎn)錄，Delta4引物序列上游5'- ATGCTCGCCAAGTACCCATC -3',下游5'- TAGGCCCAAAACAGCAACCA -3'，擴增片段長度為146bp。進行擴增：取0.5mLPCR管，依次加入第一鏈cDNA-2μL、上游引物(10pM)-2μL、下游引物(10pM)-2μL、dNTP(2mM)-4μL、10×PCR buffer-5μL、Taq酶(2u/μL)-1μL等試劑。加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50μL，輕輕混勻，離心。設(shè)定PCR程序:95°30秒，(95℃ 5sec，60℃ 34sec)×40個循環(huán)。用凝膠分析軟件Quantity one 進行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料以(±s) 表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，多組間比較方差齊時用LSD法進行均數(shù)間兩兩比較，p<0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

失荅剌知丸對大鼠腦缺血再灌注后Delta樣配體4表達(dá)的影響： Western blot結(jié)果提示：模型組與各藥物組Delta樣配體4表達(dá)均有不同程度的提高；與空白組和假手術(shù)組比較，模型組Delta樣配體4的表達(dá)增強(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組Delta樣配體4的表達(dá)顯著提高 (P<0.05)；尼莫地平組與失荅剌知丸中劑量組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，尼莫地平組與失荅剌知丸組比較，失荅剌知丸高劑量7d組Delta樣配體4的表達(dá)顯著增高(P<0.05)；失荅剌知丸同劑量組1d、3d、7d比較，Delta樣配體4的表達(dá)隨治療時間增加而增強 (P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示Delta樣配體4 mRNA的表達(dá)同蛋白表達(dá)趨勢相一致。

表1 Western blot檢測相對定量結(jié)果

表2 Real-Time PCR檢測相對定量結(jié)果

3 討論

Notch/Delta 通路是廣泛存在于脊椎和非脊椎動物中的重要信號傳導(dǎo)通路，Delta樣配體4是5種Notch配體(DLL1、 DLL3、 DLL4、 Jagged1、Jagged2)中的一種[3]。Notch信號參與缺血后損傷血管的修復(fù)，低氧使其表達(dá)上調(diào)，與臨近細(xì)胞上相應(yīng)受體notch1、4相互作用啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，激活下游Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)血管的生成和分支過程。[4]Delta樣配體4活性的表達(dá)是缺血性腦卒中的一個重要治療目標(biāo)，因此尋找有效的促進Delta樣配體4表達(dá)的方法及藥物已成為治療腦缺血損傷的一個重要方向。

中國回族醫(yī)學(xué)對腦生理、病理認(rèn)識獨到：認(rèn)為腦統(tǒng)百脈、主情志思維活動；認(rèn)為濕濁太重是該病夙根，強調(diào)以芳香論治。[5]失荅剌知丸出自《回回藥方》，是治療腦病的經(jīng)典方之一。原方謂“專治骨節(jié)疼痛，左癱右瘓，口眼歪斜，半身不遂，能開纏腸肚風(fēng)病，最通經(jīng)絡(luò)?！盵6]方中諸藥合璧，標(biāo)本兼治，能通利腦經(jīng)、開竅醒腦、又逐瘀消痰。既往研究[7-10]已證明“失荅剌知丸”對于腦缺血再灌注損傷具有顯著的的治療作用，已從神經(jīng)保護和抑制細(xì)胞凋亡等方面進行了研究。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進一步闡述失荅剌知丸治療腦缺血疾病的作用機制。研究結(jié)果提示Delta樣配體4表達(dá)上調(diào)，說明激活Notch/Delta 信號通路可能是失荅剌知丸治療腦缺血再灌注的重要機制之一。

[1]Perju - Dumbrava L，Muntean ML and Muresanu DF． Ce-rebrovascu - lar Profile Assessment in Parkinson＇s DiseasePatients[J]． CNS Neurol Disord Drug Targets，2013.

[2] Longa EZ. Weinsten PR, Carlsom S. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke.1989,20(1)84-91.

[3] 郎志強，曲桂梅．DLL4與血管生成的關(guān)系[J]．臨床與實驗病理學(xué)雜志，2011，27(9):974-975．

[4] 郭曉強，郭振清． Delta樣配體4與血管生成[J].生命的化學(xué)，2007,27(3):195-196.

[5] 甘佳樂.回族醫(yī)學(xué)對中風(fēng)的認(rèn)識及治療研究進展[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志,2016,1(1):22.

[6] 宋峴．回回藥方考釋[M]．北京: 中華書局，2007.

[7] 劉麗.荅刺知丸對腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和 Caspase-3、Caspase -9 表達(dá)的影響 [J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42(1):184-189.

[8] 劉麗.荅刺知丸對大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積及海馬區(qū)神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響 [J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 ，2011，36(11):1185-1188.

[9] 王佩佩.失荅剌知丸對腦缺血大鼠再灌注后神經(jīng)功能缺損及腦組織 PI3 -K和 AKT表達(dá)的影響[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2014， 36(5):473-477.

[10] 于凌志.核轉(zhuǎn)錄因子 NF-KB 對腦缺血再灌注干預(yù)機制的研究進展[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2015(7):42-44.

2016年12月29日收稿

Effect of "Shida Lazhi Wan" on Expressions of Delta-like Ligand 4 in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

LI Zhantao1,3JIA Menghui2,3Su Dan1ZUO Yanli1YU Linghi1HE Xiaoying1LI Hongwei1

(1. College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, ,Ningxia 750004, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750001, Ningxia, China; 3. Ministry of Education Key Laboratory of Modernization of Ministry of Education, Yinchuan 750004, China)

Objective:To investigate the effects of Shida Lazhi Wan on the expression of Delta-like ligand 4 after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods: 102 SD rats were randomLy divided into 17 groups (6 rats in each group): blank group, sham operation group, model group, nimodipine group, low dose group, The middle dose group and the high dose group. The model group and the administration group were divided into 1d, 3d and 7d groups according to the reperfusion time. The rats in each group were divided into sham operation group and sham operation group. The focal cerebral ischemia-reperfusion model (MCAO) was made by the method of thread embolization. The expression of Delta-like ligand 4 in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury was detected by Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Relative expression. Results: Compared with the model group, the expression of Delta-like Ligand 4 was significantly increased in the group treated by Western blot and PCR. Compared with the nimodipine group, the Delta-like (P<0.01). Conclusion: Shida Lazhi Wan can promote the expression of Delta-like Ligand 4 in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury, which may be one of the important mechanisms of Shida Lazhi Wan in treating cerebral ischemia-reperfusion.

Shida Lazhi Wan; Cerebral ischemia reperfusion; Delta-like ligand 4;

國家自然科學(xué)基金( 81560816)

李占濤( 1990 - ) ，男，在讀碩士研究生。研究方向: 中回醫(yī)學(xué)防治心腦血管疾病的理論和臨床研究。E-mail:360224483@ qq.com

* 通訊作者: 賈孟輝( 1962 - ) ，男( 漢族) ，陜西咸陽人，現(xiàn)任寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，“國家十二五臨床重點?？啤薄?“回醫(yī)藥腦病?？啤表椖控?fù)責(zé)人，國家自然基金課題項目評議專家，研究方向: 中醫(yī)藥、回醫(yī)藥防治心腦血管疾病的理論和臨床研究。

R291.3

A

1006-6810(2017)02-0058-04