袁連玉 陳應(yīng)娟 魏 旭 童華榮

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茶樹金屬耐受蛋白基因的克隆及功能分析

袁連玉 陳應(yīng)娟 魏 旭 童華榮*

西南大學食品科學學院, 重慶 400715

金屬耐受蛋白MTP (metal tolerance protein)是陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(CDF)家族的重要成員, 在植物重金屬轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究以中茶108茶樹為試驗材料, 通過RT-PCR和RACE方法克隆到茶樹重金屬耐受蛋白基因(GenBank登錄號為KX450265), 其全長cDNA為1197 bp, 編碼398個氨基酸殘基, 其編碼蛋白分子量為44.85 kD, 等電點為5.34。在線軟件分析表明, CsMTP11蛋白具有5個跨膜結(jié)構(gòu)域, 且含有CDF家族的其他保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明, 茶樹CsMTP11與葡萄VvMTP11進化同源性最近, 其氨基酸序列相似度高達90%。基因表達模式分析表明,基因在茶樹老葉中的表達量最高, 根中的表達量最低, 另外,基因受重金屬Mn和Co離子脅迫誘導表達。CsMTP11-YFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體共定位試驗表明, CsMTP11-YFP融合蛋白定位于質(zhì)膜。CsMTP11在釀酒酵母及其突變株中的異源表達可以提高其對重金屬Mn和Co離子的耐受性。綜上所述, 茶樹CsMTP11屬于Mn-CDF亞家族, 可能參與茶樹對重金屬錳和鈷的轉(zhuǎn)運過程。

茶樹; 重金屬耐受蛋白; 基因克隆; 錳

茶是世界公認的三大天然飲料之一, 具有多項保健及藥理功能。除了富含茶氨酸、茶多酚、咖啡堿等重要功能化合物外, 茶還含有硒、鋅、錳等人體所必需的微量元素, 因此適量飲茶對人體健康是有非常有益的[1-2]。人體內(nèi)的錳元素可以參與許多酶的合成與激活, 能夠加速脂肪氧化過程, 有利于保護心腦血管。但如果長期飲用含過量錳元素的茶也會導致慢性神經(jīng)中毒[3-4]。近年來, 工業(yè)“三廢”的超標排放、汽車尾氣等有毒氣體的排放、農(nóng)藥和化肥等的不合理施用等都嚴重地影響了土壤環(huán)境, 使土壤中重金屬含量超標, 直接威脅到了茶葉的安全生產(chǎn)。也有研究表明部分茶園存在本身成土母質(zhì)的重金屬超標問題[5]。目前, 越來越多的研究開始關(guān)注茶葉的重金屬含量及其對人類健康的影響。

茶樹是一種“聚錳植物”, 其體內(nèi)錳含量可高達1000 mg kg–1以上, 是其他植物的10倍左右[6]。對植物、動物和人來說, 錳均為必需的微量元素, 成年人一般一天需要通過飲食等攝入2.5~7.0 mg錳元素來滿足身體新陳代謝的需要[7], 茶葉中30%的活性錳可以浸入到茶水中, 所以人們可以通過每天飲用一定數(shù)量的茶來補充Mn的攝入量[8-9]。

錳是影響茶葉品質(zhì)的重要微量元素, 是茶樹呼吸作用和光合作用關(guān)鍵酶和激活劑的組成部分, 缺錳會嚴重影響茶樹的光合作用, 進而影響茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。適量施加錳肥可以提高茶葉中賴氨酸、組氨酸等氨基酸的含量, 影響茶多酚和總氨基酸含量及比值, 提高綠茶的品質(zhì)[6-10]。但土壤中錳元素過量也會對茶樹造成毒害, 如日本茶園中錳元素過量導致茶樹“黃化網(wǎng)斑病”, 呈現(xiàn)嫩葉焦尖、焦邊, 葉片失綠變薄, 葉綠素含量降低等癥狀[10-11]; 土壤中錳元素過量也會影響茶樹對鐵等其他礦質(zhì)元素的吸收,出現(xiàn)相應(yīng)元素缺失的表型, 進而可能造成茶樹礦質(zhì)元素吸收利用的代謝紊亂[8-12]。

植物體細胞內(nèi)重金屬離子濃度的平衡主要由4類蛋白參與調(diào)控, 分別為ZIP蛋白(ZRT-IRT-like protein)、Nramp蛋白(natural resistance-associated macrophage protein)、HMA蛋白(P1B-ATPase or CPx-type ATPase)和CDF蛋白(cation diffusion facilitator)[13-14]。其中CDF家族由400多個成員組成, 這類蛋白可將細胞內(nèi)的重金屬元素轉(zhuǎn)到細胞外, 也可將細胞質(zhì)中的重金屬離子轉(zhuǎn)入細胞器, 使之區(qū)室化, 從而降低重金屬對細胞的毒害。這類蛋白的結(jié)構(gòu)中具有高度保守的CDF序列, 包含4~6個跨膜結(jié)構(gòu)域, 其N端和C端通常位于細胞質(zhì)內(nèi); 這類蛋白通常還包含一個組氨酸富集區(qū), 位于第4或第5個跨膜區(qū)或N端和C端[15-16]。目前, 多種生物的CDF家族成員被克隆。系統(tǒng)進化和功能分析表明, 該類蛋白可分為Zn-CDF、Fe/Zn-CDF和Mn-CDF亞家族[17]。在植物中, CDF蛋白又被稱為金屬耐受蛋白(metal tolerance protein, MTP)。全基因組研究表明, 擬南芥基因組中包含12個編碼MTP蛋白的基因, 其中對、、、、和研究得比較多[18-19]; 水稻OsMTP1和OsMTP8、楊樹PtMTP1、黃瓜CuMTP8等也被報道與重金屬離子的轉(zhuǎn)運相關(guān)[13, 20-23]。擬南芥AtMTP1和AtMTP3分別被定位于質(zhì)膜和液泡膜, 均參與鋅離子的轉(zhuǎn)運機調(diào)控過程[24-25]; AtMTP11被定位于液泡膜前體組分, 與重金屬錳的轉(zhuǎn)運有關(guān)[26]; ShMTP1被定位于液泡膜, 可以將細胞中的錳離子轉(zhuǎn)運入液泡, 從而降低細胞質(zhì)中的重金屬濃度, 達到耐受的效果[27]。

目前關(guān)于茶樹重金屬的研究主要關(guān)注于成品茶重金屬含量及重金屬對茶樹生長發(fā)育等代謝過程的影響, 均為生化和生理方面的研究, 基本沒有涉及分子水平的調(diào)控。本研究成功克隆茶樹的重金屬耐受蛋白基因, 并初步分析和驗證了該基因的功能, 推測其在茶樹重金屬錳的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用2年生中茶108扦插苗, 種植于西南大學試驗基地。試劑主要有EASYspin Plus多糖多酚植物RNA提取試劑盒, 購自北京艾德萊生物科技有限公司; EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStartDNA Polymerase, 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司; SMARTer RACE 5′/3′ Kit、克隆載體pMD18-T和大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞, 購自TaKaRa公司(大連); DNA切膠回收試劑盒、Golden Easy PCR System、DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司; SsoFastEvaGreen超混液購自Bio-Rad公司。YNB培養(yǎng)基及氨基酸購自Sigma公司; 引物合成和基因測序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

分別取茶樹的芽、莖、嫩葉、老葉、根、花、果等器官組織2 g, 錫箔紙包好, 液氮速凍后用于總RNA的提取, 提取參照艾德萊EASYspin Plus多糖多酚植物RNA提取試劑盒說明書步驟, DNase I(RNase free)消化所提取的總RNA中的基因組DNA, 純化后的總RNA分別用于基因的克隆和表達分析。用于基因片段擴增和表達分析的總RNA參照全式金公司EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書建立反轉(zhuǎn)錄體系, 利用42℃ 1 h; 85℃ 5 s的程序反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板。

1.3 茶樹基因的克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已知植物的基因序列, 并進行多序列比對, 獲得該類基因的保守序列, 并據(jù)此設(shè)計簡并引物MTP11-280-L: TYCCYGGAA TGTCARAGGARGA和MTP11-1150-R: TCRTAATC DAGATGVACAAARGC, 用茶樹不同組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板, 克隆基因的保守片段, 并據(jù)此設(shè)計擴增5′和3′端的基因特異性引物GSP1- MTP11: CCAATGGCTGCATGCGTTTCTTTCC和GSP2-MTP11: GTTGGCTAGAAGTGAAACAACAG CC; 按照SMARTer RACE 5′ /3′ Kit試劑盒說明書, 分別合成5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA第一鏈作為模板, 分別用通用引物UPM和基因特異性引物MTP11-GSP1和MTP11-GSP2分別擴增基因5′和3′端序列, 所使用的擴增程序為94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃, 2 min; 34個循環(huán)后, 72℃再保溫5 min, 瓊脂糖電泳, 切膠回收, 連接pMD18-T載體測序, 分析測序結(jié)果, 獲得該基因的5′和3′端序列, 并用Seqman軟件拼接基因全長, 獲得基因cDNA全長, 并據(jù)此設(shè)計引物MTP11- F: ATGGTGGAGCCGGTGGAGGGTACGA和MTP11- R: CTAAGAGTGTGACTGTGCGTGCTC, 進行PCR擴增驗證基因cDNA全長。將PCR產(chǎn)物切膠回收后, 連接pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109, 進行菌落PCR鑒定后選3個陽性克隆測序。

1.4 生物信息學分析

利用Seqman軟件對基因全長進行拼接, 用Editseq軟件進行ORF查詢; 在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別用Blast N和Blast X對核酸序列和氨基酸序列進行同源性分析; 用ClustalX1.8、DNAMAN和MEGA4.0進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用TMHMMServer v.2.0進行蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5基因表達模式分析

在茶樹開花的季節(jié)(2015年10月), 從茶園中選大小和長勢基本一致的二年生中茶108扦插苗, 分別取茶樹一芽二葉、根、莖、老葉、花等, 立即用鋁箔紙包好, 液氮速凍后, –80℃冰箱保存, 用于qRT-PCR試驗。重金屬逆境脅迫處理時, 選取大小和生長勢基本一致的二年生中茶108扦插苗, MS培養(yǎng)基水培1周后, 分別加入10 mmol L–1MnSO4(T1處理)和1 mmol L–1CoCl2(T2處理), 與對照組(CK)一起繼續(xù)培養(yǎng)3 d后, 取相同部位的葉片1 g作為qRT-PCR材料, 液氮速凍后, –80℃冰箱保存。熒光定量反應(yīng)體系為SYBR Premix 10 μL、上下游引物(10 μmol L–1)各1 μL、cDNA 2 μL, 加水至終體積20 μL, 充分混勻離心, 于Bio-Rad CFX96實時定量PCR儀上擴增, 反應(yīng)程序為95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 56℃ 5 s進行40個循環(huán)后增加熔解曲線。每個樣品進行3次生物學重復和試驗重復, 采用2–ΔΔCT法分析結(jié)果, 用SigmaPlot軟件分析差異顯著性并繪圖。

1.6 CsMTP11亞細胞定位分析

將基因序列去掉終止子后, 克隆到pSAT6-EYFP載體上(酶切位點為R I和H I), 形成CsMTP11-pSAT6-EYFP重組質(zhì)粒, 用PEG法轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體并融合表達, 共定位Maker為質(zhì)膜定位蛋白OsMCA1, 用激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光來確定CsMTP11-YFP融合蛋白的定位。

1.7 CsMTP11蛋白酵母突變株互補試驗分析

構(gòu)建CsMTP11-pYES2重組質(zhì)粒, 并采用PEG轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY4741及其突變體(Y01613)和(Y04534)(由中國科學院華南植物園植物表觀遺傳學實驗室張美副研究員提供)中進行金屬耐受性分析。獲得陽性克隆后, 用液體SD培養(yǎng)基培養(yǎng), 當菌液濃度均達到OD660=1.0時, 取出菌液, 分別稀釋10、100和1000倍, 吸取2mL的原液及各稀釋液點在空白及含重金屬(200 μmolL–1Co和3 mmolL–1Mn)的SD培養(yǎng)基上, 30℃培養(yǎng)6 d后, 記錄其生長狀況。接種相同濃度的菌株到新液體SD培養(yǎng)基及含有相應(yīng)重金屬(200 μmolL–1Co和1 mmolL–1Mn)的液體SD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng), 每隔10 h測量一次菌液的吸光度值, 記錄數(shù)據(jù)并繪制生長曲線圖, 每個試驗重復3次以上。

1.8 茶樹葉片中錳元素含量的測定

取不同品種的茶樹相同位置的葉片, 沖洗去粘附泥土、塵土等雜質(zhì), 再用蒸餾水沖洗1~2次, 在室溫下晾干并在90℃環(huán)境下30 min至烘干狀態(tài), 用粉碎機將樣品粉碎至20~40目, 硝酸-H2O2(5∶1)消解法分解, 火焰原子吸收光譜法測定茶樹葉片中的錳元素含量。每個樣品進行3次生物學重復和試驗重復, 采用2–ΔΔCT法分析結(jié)果, SigmaPlot軟件分析差異顯著性并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1基因全長序列的克隆及生物信息學分析

根據(jù)GenBank已登錄植物的MTP11核苷酸序列進行多序列比對, 發(fā)現(xiàn)該類基因在不同植物中高度保守, 且含有多個保守序列及結(jié)構(gòu)域, 根據(jù)距離3′端約280 bp和距離5′端約100 bp的保守序列設(shè)計簡并引物, 擴增茶樹基因。利用不同組合的簡并引物擴增, 獲得長度為870 bp的單一片段, 與預(yù)期基本相符。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對, 發(fā)現(xiàn)該片段的序列與葡萄、柑橘和棉花基因的序列高度保守, 同源性90%以上, 將其初步命名為。根據(jù)該保守片段設(shè)計擴增其全長cDNA的引物。如圖1所示, 克隆到基因的3′端和5′端序列, 大小分別為780 bp和1100 bp; 利用Seqman軟件進行全長拼接, Editseq進行ORF查詢, 并設(shè)計引物進行克隆驗證(圖2), 獲得基因cDNA全長為1197 bp, 編碼398個氨基酸殘基, 且其序列已提交GenBank, 登錄號為KX450265, 其編碼蛋白分子量為44.85 kD, 等電點為5.34。

2.2 茶樹CsMTP11蛋白系統(tǒng)進化分析

將推導的CsMTP11蛋白的氨基酸序列與16種已知植物MTP11進行多序列比對, 并采用NJ法進行CsMTP11氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析。如圖3所示, 在已知的16種植物金屬耐受蛋白中, 茶樹CsMTP11與葡萄VvMTP11的進化同源性最近, 其序列相似度高達90%。將與茶樹進化同源性近的葡萄、甜橙及模式植物擬南芥的MTP11與CsMTP11 進行多序列比對, 如圖4所示, 4種植物的MTP11蛋白質(zhì)序列中均含有5個跨膜結(jié)構(gòu)域和保守序列ASGLNTI-(X)20-G-XX-KNQRSY-X-DEGLNPQRST (第120~第172位氨基酸), 且第123位L, 第153位G, 第167、第168位的NP等位置的氨基酸高度保守。

1:基因5′端RACE擴增產(chǎn)物; 2:基因3′端RACE擴增產(chǎn)物; M: DL2000。

1: 5′-RACE amplificationproducts ofgene; 2: 3′-RACE amplificationproducts ofgene; M: DL2000.

1:基因cDNA全長擴增條帶; M: DL2000。

1: products ofgene cDNA; M: DL2000.

2.3 CsMTP11蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)

圖5所示, 在線TMHMM Server v. 2.0軟件分析CsMTP11氨基酸序列發(fā)現(xiàn), 該蛋白含5個跨膜結(jié)構(gòu)域, 即TMD1 (第112~第132位氨基酸, 長度為21個氨基酸殘基)、TMD2 (第139~第159位氨基酸, 長度為21個氨基酸殘基)、TMD3 (第174~第202位氨基酸殘基, 長度為29個氨基酸殘基)、TMD4 (第218~第239位氨基酸, 長度為22個氨基酸殘基)和TMD5 (第258~第286位氨基酸, 長度為29個氨基酸殘基)。如圖4所示, 擬南芥、甜橙、葡萄的MTP11蛋白也含有相同的跨膜結(jié)構(gòu)域, 這也是Mn-CDF亞家族蛋白的特有屬性之一。

2.4基因組織表達特異性分析

用熒光定量PCR方法檢測基因組織表達特異性, 結(jié)果表明,基因在不同茶樹品種和茶樹不同組織中的表達均存在較明顯差異。如圖6所示, 黃山苦茶葉片中基因的表達量高于中茶108、碧香早、黃山苦茶、蜀永1號和福鼎大白茶。

如圖7所示, 黃山苦茶葉片中錳元素的含量低于中茶108、碧香早、黃山苦茶、蜀永1號和福鼎大白茶, 且不同茶樹品種片葉中錳元素的含量與其基因的表達量成正比。如圖8所示,基因在茶樹老葉中的表達量最高, 是表達量最低的根部該基因表達量的10倍。

● 代表基因編碼的氨基酸序列。

● stands for amino acid sequence coded bygene.

黑色: 氨基酸一致性為100%; 深灰色: 氨基酸一致性為75%; 淺灰色: 氨基酸一致性為50%; 參與同源比對的蛋白為: VvMTP11(XP_002282508.1), AtMTP11(818530), CisMTP11(XM_006485959.2); ? : 跨膜結(jié)構(gòu)域; □: 保守結(jié)構(gòu)域; ▼: 高度保守的氨基酸。

Black: amino acid identity is 100%; Dark grey: amino acid identity is 75%; Light grey: amino acid identity is 50%. The homologous sequences include VvMTP11 (XP_002282508.1), AtMTP11 (818530), CisMTP11 (XM_006485959.2). ? indicates predicted transmenbranedomainsTMD1-TMD5;□ indicates conserved region; ▼ indicates conserved amino acid.

茶樹品種為ZH108 (中茶108)、BXZ (碧香早)、HK (黃山苦茶)、SY (蜀永1號)、FD (福鼎大白茶); “*”表示差異顯著水平(< 0.05)。

Tea varieties are ZH108 (Zhongcha 108), BXZ (Bixiangzao), HK (Huangshankucha), SY (Shuyong 1), FD (Fudingdabaicha). “*” represents the significant difference (< 0.05).

圖中用到的茶樹品種為ZH108 (中茶108)、BXZ (碧香早)、HK (黃山苦茶)、SY (蜀永1號)、FD (福鼎大白茶); “*”表示差異顯著水平(< 0.05)。

Tea varieties are ZH108 (Zhongcha108), BXZ (Bixiangzao), HK (Huangshankucha), SY (Shuyong 1), FD (Fudingdabaicha). “*” represents the significant difference (< 0.05).

R: 根; St: 莖; OL: 老葉; YL: 嫩葉; B: 芽; Fl: 花; Fr: 茶果。“*”表示差異顯著水平(< 0.05), “**”表示差異極顯著水平(< 0.01)。

R: root; St: stem; OL: old leaf; YL: young leaf; B: bud; Fl: flower; Fr: fruit. “*” represents significant difference (< 0.05), “**” represents significant difference (< 0.01).

如圖9所示, 與對照(MS培養(yǎng)液培養(yǎng))相比, 在對茶苗進行10 mmol L–1Mn離子脅迫處理條件下(T1處理),基因在茶樹葉片中的表達量上調(diào)10倍以上; 在對茶苗進行1 mmol L–1Co離子脅迫處理條件下(T2處理),基因在茶樹葉片中的表達量增加2倍左右。

2.5 CsMTP11亞細胞定位分析

在線軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell- PLoc/)預(yù)測CsMTP11定位于質(zhì)膜, 用CsMTP11-YFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的融合表達驗證了該預(yù)測結(jié)果。圖10所示, 與YFP空載體對照相比, CsMTP11-YFP融合蛋白的黃色熒光信號分布在質(zhì)膜中, 且與質(zhì)膜共定位陽性對照信號的位置完全吻合, 由此可見, 茶樹CsMTP11蛋白定位于細胞質(zhì)膜。

2.6 CsMTP11蛋白在釀酒酵母及其突變株中的功能互補

將基因異源表達于釀酒酵母及其突變體中, 來驗證其重金屬轉(zhuǎn)運功能及轉(zhuǎn)運的重金屬種類。如圖11所示, 在SD培養(yǎng)基上, 空載體菌株與異源表達CsMTP11的菌株的生長速度并無明顯差異。但在SD/3 mmolL–1Mn離子脅迫的培養(yǎng)基上, 與空載體對照pmr1DpYES2菌株相比, pmr1D- CsMTP11-pYES2菌株的生長狀態(tài)更好, 生長速度更快; 同樣, 與空載體對照菌株cot1D-pYES2相比, cot1D-CsMTP11-pYES2菌株在SD/200 μmolL–1Co離子的培養(yǎng)基上生長狀態(tài)更好, 生長速度更快。另外, 在野生型釀酒酵母中異源表達基因, 也可以顯著提高其對重金屬Co和Mn脅迫的耐受性。

CK: 對照MS培養(yǎng)基; T1: 10 mmol L–1Mn離子脅迫處理; T2: 1 mmol L–1Co離子脅迫處理。在同一處理時間內(nèi), “*”表示差異顯著水平(<0.05)。

CK: no metal contrast; T1: 10 mmol L–1Mn; T2: 1 mmol L–1Co. “*” represent significant difference at the same treatment (< 0.05).

為驗證酵母及其突變株的生長速度, 本研究分析了其在不同培養(yǎng)基中的生長曲線。如圖12所示, 在液體SD培養(yǎng)基培養(yǎng)時, 菌株WT-CsMTP11- pYES2與WT-pYES2菌株、cot1D-CsMTP11-pYES2與cot1D-pYES2菌株、pmr1D-CsMTP11-pYES2與pmr1D-pYES2菌株的生長速度均比較一致。但在含有重金屬元素的(200 μmolL–1Co和1 mmolL–1Mn)液體SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時, 在相同時間內(nèi), 異源表達CsMTP11蛋白的WT-CsMTP11-pYES2、cot1D- CsMTP11-pYES2、pmr1D-CsMTP11-pYES2菌株的生長速度也分別快于其空載體對照菌株, 結(jié)果與固體SD培養(yǎng)基上培養(yǎng)的結(jié)果一致。由此可知在酵母及其突變株中異源表達基因可以提高其對重金屬錳和鈷的耐受性。

3 討論

重金屬耐受蛋白MTP是植物中的CDF, 是植物中最早被報道的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白之一, 廣泛存在于細菌、真菌、植物、動物體內(nèi), 在植物細胞維持重金屬濃度平衡過程中發(fā)揮重要作用[28]。本研究克隆的茶樹基因cDNA, 全長為1197 bp, 編碼398個氨基酸殘基, 編碼蛋白的等電點為5.34, 分子量為44.85 kD。茶樹CsMTP11與葡萄VvMTP11具有高度的保守性, 其氨基酸序列相似度高達90%; 與擬南芥中AtMTP11的相似度也高達81%。雖然MTP蛋白通常具有4~6個跨膜結(jié)構(gòu)域, 但Mn-CDF亞家族成員只有4~5個, 一部分人類和酵母的CDF成員有12~15個[20, 27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)CsMTP11蛋白序列中具有5個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4和圖5), 且含有保守序列ASGLNTI-(X)20-G-XX-KNQRSY-X-DEGLNP QRST (第120~第172位氨基酸)和特定位點的保守氨基酸, 這些均為Mn-CDF亞家族的屬性。由此我們推測CsMTP11也屬于Mn-CDF亞家族, 可能與AtMTP11具有類似的轉(zhuǎn)運錳的功能。

Marker: 定位于細胞質(zhì)膜的共定位標記。Marker: that localized in the plasma membranes.

用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pYES2或pYES2-CsMTP11的酵母突變株和野生型酵母菌培養(yǎng)至OD660=0.8, 并進行稀釋。分別取2 μL原液和稀釋液滴加在SD和SD/metal固體培養(yǎng)基上, 30℃恒溫培養(yǎng)6 d后觀察。

wild type (WT) and mutant strains were transformed with pYES2 or pYES2-CsMTP11. Yeast cultures were adjusted to OD660= 0.8, and 2 μL serial dilutions were spotted on SD medium or SD with different heavy metals. Plates were incubated for six days at 30°C.

錳是比較難轉(zhuǎn)移的金屬元素, 在茶樹不同器官和組織中的含量存在明顯差異, 一般衰老組織中的含量高于幼嫩組織, 且葉片中的含量高于芽、莖和根[10]。本研究表明,基因在老葉中的表達量遠高于嫩葉, 且在葉片中的表達量高于芽、莖和根, 這與茶樹中的錳離子分布的部位也是吻合的; 黃山苦茶葉片中錳元素的含量低于中茶108、碧香早、黃山苦茶、蜀永1號及福鼎大白茶葉片中的錳含量, 且不同茶樹品種片葉中錳元素的含量與其基因的表達量成正比; 錳和鈷等重金屬逆境脅迫可以誘導基因的上調(diào)表達, 尤其是錳脅迫處理, 可以使基因的表達提高10倍以上(圖9)。綜上所述基因是參與重金屬錳的轉(zhuǎn)運過程的。

植物在進化中形成了多種耐受重金屬毒害的機制: (1)位于質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運蛋白將進入細胞的重金屬離子排出細胞; (2)位于液泡等細胞器膜的轉(zhuǎn)運蛋白將進入細胞內(nèi)的金屬離子轉(zhuǎn)入細胞器等結(jié)構(gòu), 使之區(qū)室化, 降低細胞質(zhì)中金屬離子濃度; (3)細胞質(zhì)內(nèi)的生物大分子等與金屬離子形成穩(wěn)定的螯合態(tài)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹CsMTP11定位于質(zhì)膜(圖10), 推測其功能是將進入茶樹細胞的重金屬離子轉(zhuǎn)運到細胞外, 降低茶樹細胞中重金屬離子的濃度, 從而達到“耐受”的效果, 與其他已知的Mn-CDF亞家族成員的定位和功能類似。

釀酒酵母一直是研究重金屬轉(zhuǎn)運功能的重要材料, 例如, 楊樹基因在釀酒酵母突變株中異源表達可以互補其對Zn離子的敏感性, 水稻基因的異源表達可以提高酵母突變株對Ni和Cd離子的耐受性[13]。植物體內(nèi)重金屬離子的轉(zhuǎn)運過程是個復雜的網(wǎng)絡(luò), 轉(zhuǎn)運時沒有嚴格的特異性, 轉(zhuǎn)運蛋白在轉(zhuǎn)運某一種重金屬離子時, 可能會提高結(jié)構(gòu)或密度等相似的離子的轉(zhuǎn)運效率。與此同時, 可能有多種轉(zhuǎn)運蛋白參與同一種金屬離子的轉(zhuǎn)運過程。例如, 擬南芥AtMTP1和AtMTP3都屬于Zn-CDF亞家族, 均定位于液泡膜, 且同時參與鋅和鈷的轉(zhuǎn)運過程[24, 31-32]。本研究表明,基因的異源表達雖然不能完全互補突變株對Mn離子的敏感性, 但可顯著提高其對Mn離子的耐受性; 且可提高突變株對Co離子的耐受性。與此同時,基因的異源表達也可以提高野生型釀酒酵母對Mn和Co離子的耐受性。據(jù)此, 我們推測茶樹CsMTP11蛋白參與Mn離子的轉(zhuǎn)運過程, 可以將進入細胞的錳離子轉(zhuǎn)運出細胞, 同時也提高了Co離子的轉(zhuǎn)運效率, 從而同時提高了釀酒酵母及其突變株對重金屬Mn和Co離子的耐受性。但茶樹中可能存在多個MTP蛋白, 其中有多個成員參與Mn和Co離子的轉(zhuǎn)運調(diào)控過程, 且不同成員之間是協(xié)同關(guān)系, 而不是冗余關(guān)系,所以基因的異源表達并不能完全互補酵母突變株對重金屬Mn和Co敏感的表型。也就是說茶樹體內(nèi)錳離子的轉(zhuǎn)運過程可能是由多個基因協(xié)同調(diào)控。

本研究初步分析了茶樹重金屬轉(zhuǎn)運蛋白CsMTP11的功能, 我們將做更多深入研究來解釋茶樹體內(nèi)重金屬轉(zhuǎn)運的機制, 為茶樹遺傳育種及茶園的科學施肥提供參考。

4 結(jié)論

從茶樹品種中茶108中克隆到一個全長cDNA, 為1197 bp, 編碼398個氨基酸殘基的重金屬耐受蛋白基因, 并命名為(metal tolrance protein 11 in), 該基因的表達存在組織特異性, 且受重金屬脅迫誘導, 其編碼的蛋白屬于CDF家族的Mn-CDF亞家族, 定位于質(zhì)膜, 具有重金屬錳的轉(zhuǎn)運功能。

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Cloning and Function Analysis of Metal Tolerance Gene (in Tea Plant (L. O. Kuntze)

YUAN Lian-Yu, CHEN Ying-Juan, WEI Xu, and TONG Hua-Rong*

College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

As a member of cation diffusion facilitator family, metal tolerance protein (MTP) is involved in the regulation of heavy metal stress process in plant. Here, we cloned a MTP gene, CsMTP11 (GenBank accession number: KX450265) from Zhongcha 108 tea plant. The full-length cDNA of CsMTP11 is 1197 bp, and the gene encodes a novel protein of 398 amino acids, which shares significant sequence similarity with VvMTP11 (90%). The molecular weight and theoretical pI of this protein are 44.85 kD and 5.34, respectively. The conserved domain analysis indicated that CsMTP11 contained five transmembrane domains and the conserved CDF domain. The phylogenetic tree indicated that CsMTP11 had sequence conservation among different species. The transcriptional level ofin old leaf was higher than that in root. Futher more, the heavy metal Mn and Co stresses induced the expression of. The subcellular localization assay using CsMTP11-YFP fusion gene expressed in theprotoplast showed that CsMTP11 was localized in the plasma membranes. CsMTP11 heterologous expression in wild-type yeast BY4741 and the mutants showed that it was able to increase tolerance to Mn and Co. Taken together , our results indicated that CsMTP11 is a member of the Mn-CDF family, and it may be involved in the regulation of heavy metal stress process in tea plant.

; Heavy metal tolerance;Gene clone; Mn

10.3724/SP.J.1006.2017.00708

本研究由國家自然科學基金項目(31400583), 重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃一般項目(cstc2014jcyjA80011)和中央高?；緲I(yè)務(wù)費專項(XDJK2014C070)資助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400583), the Basic and Frontier Research Program of Chongqing (cstc2014jcyjA80011), and Fundamental Research Funds for Central Universities (XDJK2014C070).

(Corresponding author): 童華榮, E-mail: huart@swu.edu.cn, Tel: 023-68251298

E-mail: yuanlianyu88@163.com, Tel: 18324183687

(收稿日期): 2016-08-23; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-02-17.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1009.020.html