郭文捷, 趙 瑾, 齊宏濤, 姜 鵬, 李富超, 李榮貴

?

南海冷泉區(qū)貽貝()附生菌的分離培養(yǎng)與多樣性分析

郭文捷1, 2, 3, 趙 瑾2, 3, 齊宏濤1, 姜 鵬2, 3, 李富超2, 3, 李榮貴1

(1. 青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071)

以采集后適應(yīng)培養(yǎng)0~24 h 以及添加甲烷和硫化鈉培養(yǎng)24~240 h的南海冷泉區(qū)深海貽貝()為材料, 取其鰓部, 分析附生菌的多樣性與適應(yīng)性變化狀況。共分離鑒定出貽貝附生菌270 株, 對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行聚類(lèi)分析, 結(jié)果表明所分離菌株主要分布在4個(gè)門(mén), 21個(gè)屬, 其中變形菌的數(shù)量最多且多樣性高。分析發(fā)現(xiàn)原位新采集的貽貝鰓部附生菌的多樣性較高, 6 h后附生菌的多樣性明顯降低。分別添加甲烷和硫化鈉對(duì)深海貽貝進(jìn)行培養(yǎng), 甲烷組與碳代謝有關(guān)的假單胞菌的數(shù)量逐漸增多, 且在甲烷組240 h中發(fā)現(xiàn)2株食烷菌屬菌株。硫化鈉組的芽孢桿菌屬所占比例升高。此外還發(fā)現(xiàn)4株潛在的新種。本研究實(shí)現(xiàn)了深海冷泉區(qū)貽貝的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng), 并對(duì)貽貝鰓部附生菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析, 豐富了海洋極端環(huán)境微生物資源庫(kù), 并為深入解析貽貝與其附生菌之間的相互作用關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

南海; 冷泉區(qū); 貽貝; 附生菌; 多樣性

冷泉(cold seep)是由于海底天然氣滲漏, 富含水、碳?xì)浠衔?甲烷和石油)、硫化氫等化合物的流體在大陸邊緣海底噴溢形成[1], 海底冷泉的溫度與周邊海水溫度相近。對(duì)深海冷泉生態(tài)系統(tǒng)的研究是繼20世紀(jì)末對(duì)熱液生態(tài)系統(tǒng)研究熱潮以來(lái)的又一個(gè)重要領(lǐng)域[2]。冷泉區(qū)繁衍著管狀蠕蟲(chóng)、蛤類(lèi)、貽貝類(lèi)、海星、海膽、海蝦、珊瑚等生物[3]。這些生物的體內(nèi)和體表存在大量的微生物, 微生物與宿主之間具有高度相互依賴(lài)的共附生關(guān)系[4]。共附生微生物參與宿主的物質(zhì)吸收和能量代謝過(guò)程, 可為宿主提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或清除宿主體內(nèi)的有害代謝產(chǎn)物[5], 具有多種特殊的功能基因和酶, 是一種很有潛力的生物資源。

貽貝是深海冷泉區(qū)廣泛分布的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物, 屬于軟體動(dòng)物門(mén), 雙殼綱。目前已有人對(duì)貽貝內(nèi)共生菌進(jìn)行了研究。Duperron等[6]利用16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析以及FISH的方法對(duì)墨西哥灣冷泉區(qū)貽貝內(nèi)共生菌進(jìn)行多樣性分析, 結(jié)果表明貽貝內(nèi)共生菌主要包括硫氧化菌和甲烷氧化菌。這些共生菌可以將環(huán)境中的硫化物和甲烷轉(zhuǎn)化為貽貝所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-9]。但目前對(duì)貽貝附生菌的研究尚為空白, 對(duì)于共生菌群落結(jié)構(gòu)與化學(xué)環(huán)境之間的關(guān)系以及響應(yīng)機(jī)制也缺乏針對(duì)性的研究。

本研究首先實(shí)現(xiàn)了深海冷泉貽貝的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng), 并對(duì)其鰓部附生菌進(jìn)行了分離純化, 通過(guò)16S rDNA 序列分析, 對(duì)分離得到的附生菌進(jìn)行了多樣性分析。進(jìn)一步將所采集的貽貝置于不同的化學(xué)刺激條件下, 分析附生菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。為深入解析貽貝與其附生菌之間的相互作用關(guān)系, 以及對(duì)深海新基因、新化合物的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

樣品于2014年4月“科學(xué)”號(hào)冷泉調(diào)查航次獲得, 由“發(fā)現(xiàn)”號(hào)ROV采集。采樣點(diǎn)位于臺(tái)灣西南的南海冷泉區(qū)(22°06′57.144″N, 119°17′6.580″E), 水深1 113 m(圖1[10])。貽貝取回甲板后, 放入過(guò)濾海水中, 適應(yīng)0、6、12、24 h后分別取貽貝的鰓。適應(yīng)24 h 后開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分為甲烷組和硫化鈉組。其中甲烷實(shí)驗(yàn)組每天充甲烷0.5 h, 用過(guò)濾海水培養(yǎng); 硫化鈉實(shí)驗(yàn)組母液質(zhì)量濃度為25 g/L,蠕動(dòng)泵按50 μL/min添加。對(duì)照組直接用過(guò)濾海水培養(yǎng)?，F(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)24、72和240 h分別取貽貝的鰓。本研究中深海冷泉區(qū)貽貝為深海偏頂蛤()[10]。

1.2 菌株的分離與培養(yǎng)

在厭氧培養(yǎng)箱中將凍存管中貽貝的鰓用滅菌海水200mL 洗滌5次, 然后分別取50mL 均勻涂布在2216E、HM、142-A、M1四種海水培養(yǎng)基上, 培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~7 d。挑取不同形態(tài)單菌落至對(duì)應(yīng)的固體平板, 劃線純化、保種。

1.3 DNA提取及16S rDNA序列聚類(lèi)分析

DNA提取采用的是CTAB法[11]進(jìn)行總DNA提取。16S rDNA的擴(kuò)增參照Li等[12]的方法, 所用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 反應(yīng)體系: Dream Taq Green PCR Master Mix(2x)(Thermo 公司), 20mL; 引物27F(10mmol/L)、1 492R(10mmol/L), 各2mL; 模板, 2mL; dd H2O補(bǔ)足40mL體系。PCR 反應(yīng)程序: 預(yù)變性 94℃ 10 min; 之后為30個(gè)循環(huán): 變性 94℃ 50 s, 退火55℃ 50 s, 延伸 72℃ 1 min 30 s,最后72℃, 5 min。

表 1 培養(yǎng)基的組成

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海桑尼進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定。將得到的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)。將GenBank中獲得的海洋來(lái)源的海水、沉積物以及魚(yú)、珊瑚等動(dòng)物的高同源性序列作為參考序列。然后利用Clustal X軟件[13]進(jìn)行比對(duì)分析, 截齊后應(yīng)用MEGA 4.0[14]軟件, 采用鄰位相接法[15](Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 進(jìn)行菌株的聚類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝附生菌多樣性的分析

本研究共分離得到270 株純培養(yǎng)的深海貽貝附生細(xì)菌(表2)。經(jīng)16S rDNA 序列聚類(lèi)分析, 如圖2所示, 所分離的菌株分屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)4個(gè)門(mén), 21個(gè)屬。

在門(mén)水平上, 變形菌門(mén)的菌株在分離菌株中占大部分(243株, 90%)。其次是厚壁菌門(mén)(21株, 8%), 放線菌門(mén)(3株, 1%), 擬桿菌門(mén)(3株, 1%)。Lampert等[16]對(duì)珊瑚可培養(yǎng)的共附生菌多樣性的研究中, 共分離得到24株細(xì)菌, 其中γ變形菌占35%, 是珊瑚共附生菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。Webster等[17]對(duì)海綿的34株相關(guān)共附生菌的研究中, 發(fā)現(xiàn)γ變形菌占41%。陳忠等[3]對(duì)海膽可培養(yǎng)的共附生微生物多樣性的研究中, 共分離到31個(gè)菌株, 其中γ變形菌占分離菌株的大部分(20株, 65%)。本研究結(jié)果也表明γ變形菌是貽貝附生菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群, 這與其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的共附生細(xì)菌具有相似之處。

表 2 深海貽貝附生菌的信息表

注: 菌種編號(hào)后的數(shù)字代表同一處理組同一培養(yǎng)基分離的菌株數(shù)目, 只分離到一株的, “1”省略

Note: The figure behind the strain ID indicates the number of bacteria strains isolated from the same sample by using the same medium. When there is only one strain isolated, “1” is omitted

在屬的水平上, 假交替單胞菌屬占比例最高。假交替單胞菌屬能夠生存在貧營(yíng)養(yǎng)的海洋環(huán)境中, 在多數(shù)情況下它們附生于海鞘、甲殼動(dòng)物、珊瑚、無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)等表面。這種附生關(guān)系有助于我們研究微生物與宿主之間相互作用的機(jī)制[18]。

在所分離的菌株中, 發(fā)現(xiàn)有4個(gè)菌株(CS083、CS395、CS578、CS650)的16S rDNA序列與GeneBank中已有序列比對(duì)的相似性低于97%, 可能是新種(圖2)。在這4個(gè)潛在新種中, CS083分離自適應(yīng)性培養(yǎng)0 h組, 屬于厚壁菌門(mén), 與分離自海洋細(xì)菌的sp. B20Ydz-xm的16S rDNA 部分序列相似度最高, 相似性為96%, 可能是芽孢桿菌屬的一個(gè)潛在新種。CS395、CS578和CS650均屬于變形菌門(mén)。其中CS395是分離自適應(yīng)性培養(yǎng)12 h 組, 與來(lái)自珊瑚中sp.PmeaMuc1的16S rDNA 部分序列相似度為96%; CS578是分離自現(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中硫化鈉24 h組, 與從海水中分離出的sp.anaA.si.2 的16S rDNA 部分序列相似度為93%; CS650菌株是分離自現(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中甲烷72 h組, 它與分離自海洋細(xì)菌中的sp. ERGCD 的16S rDNA 部分序列相似度為97%。后續(xù), 我們將參照Colwell提出的多相分類(lèi)學(xué)[19]方法對(duì)這4株潛在新種進(jìn)行物種鑒定, 并分析其生態(tài)功能及與貽貝之間的相互作用關(guān)系。

2.2 適應(yīng)性培養(yǎng)過(guò)程中貽貝附生菌群落結(jié)構(gòu)的變化

將深海冷泉區(qū)采集的貽貝在實(shí)驗(yàn)室可控條件下進(jìn)行培養(yǎng)。原位新鮮采集的貽貝的鰓部附生菌多樣性較高, 所占比例最多的門(mén)為變形菌門(mén), 所占比例最多的屬為假交替單胞菌屬。適應(yīng)性培養(yǎng)6 h后, 貽貝的鰓部附生菌的多樣性明顯降低(圖3)。

現(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的甲烷組中, 隨著甲烷處理時(shí)間的延長(zhǎng), 假交替單胞菌屬所占比例逐漸減少, 而與碳分解過(guò)程相關(guān)的假單胞菌屬的比例逐漸增多[20-21]。在甲烷組240 h 中發(fā)現(xiàn)2株食烷菌屬的菌株, 該屬能夠以直鏈和支鏈的烷烴為唯一的碳源和能源, 該屬是海洋專(zhuān)性烷烴降解菌, 可以用于治理海洋中的石油污染[22]。在硫化鈉組24~240 h, ?？曝愄厥暇鷮?)和芽孢桿菌屬的數(shù)量逐漸增多, 而且芽孢桿菌屬在硫化鈉240 h組達(dá)到最多, 芽孢桿菌通過(guò)自養(yǎng)亞硝化和自養(yǎng)反硝化的脫氮作用, 將含氮有機(jī)物轉(zhuǎn)化成貽貝吸收利用的小分子物質(zhì), 從而促進(jìn)貽貝的生長(zhǎng)與繁殖[23](圖4)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)南海冷泉區(qū)貽貝鰓中附生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)與鑒定, 初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示貽貝附生菌包括4個(gè)門(mén)21個(gè)屬, 附生菌多樣性高。其中變形菌門(mén)在所有門(mén)類(lèi)中所占比例最高。在適應(yīng)培養(yǎng)過(guò)程中, 原位新鮮采集的貽貝的鰓部附生菌多樣性較高, 培養(yǎng)6 h后, 貽貝的鰓部附生菌的多樣性明顯降低?，F(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)過(guò)程中, 隨著甲烷處理時(shí)間的延長(zhǎng), 與碳分解過(guò)程相關(guān)的假單胞菌屬的比例增多。在硫化鈉處理組24~240 h, ?？曝愄厥暇鷮俸脱挎邨U菌屬的數(shù)量逐漸增多, 而且芽孢桿菌屬在硫化鈉240 h 組達(dá)到最多。另外, 本研究純化得到了2株可開(kāi)發(fā)用于治理海洋石油污染的食烷菌屬菌株, 并發(fā)現(xiàn)了4株潛在的深海微生物新種, 為深海極端環(huán)境微生物新資源的發(fā)掘和利用奠了基礎(chǔ)。

[1] 周琦, 陳建華, 張命橋, 等. 冷泉碳酸鹽巖研究進(jìn)展及成礦意義[J]. 貴州科學(xué), 2007(S1): 103-110. Zhou Qi, Chen Jianhua , Zhang Mingqiao, et al. The advances in study and metallogenic significance of cold seep carbonates[J]. GuiZhou Science, 2007(S1): 103-110.

[2] Zhang C, Li P , Jiang C, et al. Geomicrobiology and biogeo-chemistry of gas hydrates and cold seeps[J]. Chemical Geology, 2004, 205(3-4): 187-194.

[3] 陳忠, 楊華平, 黃奇瑜, 等. 海底甲烷冷泉特征與冷泉生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào), 2007, 26(6): 73-82. Chen Zhong, Yang Huaping, Huang Qiyu, et alCharacteristics of cold seeps and structures of chemoautosynthesis-based communities in seep sediments[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2007, 26(6): 73-82.

[4] 苗婷婷, 邢翔, 杜宗軍, 等. 柄海鞘共附生細(xì)菌的分離培養(yǎng)與系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2012, 30(1): 111-118. Miao Tingting, Xing Xiang, Du Zongjun, et al. Isolation and phylogenetic analysis of associated bacteria from the. [J]. Advances in Marine Science, 2012, 30(1): 111-118.

[5] Hentschel U, Schmid M. Isolation and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the Mediterranean spongesand[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 35(3): 305-312.

[6] Duperron S, Sibuet M, Gregor M, et al. Diversity, relative abundance and metabolic potential of bacterial endosymbionts in threemussel species from cold seeps in the Gulf of Mexico[J]. Environmental Microbiology, 2007, 9(6): 1423-1438.

[7] Detree C, Chabenat A, Lallier F H, et al. Multiple I-type lysozymes in the hydrothermal vent musseland their role in symbiotic Plasticity[J]. PLoS ONE, 2016, 11(2): e0148988.

[8] Nelson D C, Hagen K D, Edwards D B, et al. The gill symbiont of the hydrothermal vent musselis a psychrophilic, chemoautotrophic, sulfur bacterium[J]. Mar Biol, 1995, 121(3): 487-495.

[9] Distel D L, Cavanaugh C M.Independent phylogenetic origins of methanotrophic and chemoautotrophic bacterial endosymbiosis in marine bivalves[J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176: 1932-1938.

[10] 鄭平, 王敏曉, 李超倫, 等. 熱液和冷泉無(wú)脊椎動(dòng)物基因組大小測(cè)定及比較[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2016, 38(6): 41-50. Zheng Ping, Wang Minxiao, Li Chaolun, et al. Survey of genome size in 10 invertebrates from hydrothermal vent and cold seep[J]. Chinese Journal of Oceanography, 2016, 38(6): 41-50.

[11] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bull, 1987, 19: 11-15.

[12] Li WJ, Xu P, Schumann P, et al.sp. nov., a novel actinobacterium isolated from forest soil in Yunnan (China), and emended description of the genus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57(7): 1424- 1428.

[13] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(24): 4876- 4882.

[14] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24: 1596-1599.

[15] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425.

[16] Lampert Y, Kelman D, Dubinsky Z, et al. Diversity of culturable bacteria in the mucus of the Red Sea coral[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 58: 99-108

[17] Webster N S, Wilson K J, BlackallL L, et al. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 434–444.

[18] 席宇, 朱大恒, 劉紅濤, 等. 假交替單胞菌及其胞外生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2005, 32(3): 108-112. Xi Yu, Zhu Daheng, Liu Hongtao, et al. Advances onspecies and their extracellular bioactive compounds[J]. Microbiology, 2005, 32(3): 108-112.

[19] Colwell R R. Polyphasic Taxonomy of the genus: numerical taxonomy ofcholerae,, and relatedspecies[J]. J Bacteriol, 1970, 104: 410 -433.

[20] Head I M, Jones D M, Roling W F. Marine microorganisms make a meal of oil[J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(3): 173-182.

[21] 譚周進(jìn), 肖羅, 謝丙炎, 等. 假單胞菌的微生態(tài)調(diào)節(jié)作用[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2004, 18(1): 72-76.Tan Zhoujin, Xiao Luo, Xie Bingyan, et al. Microecological functions of Pseudomonad[J]. Acta Agric Nucleat Sinica, 2004, 18(1): 72-76.

[22] 吳業(yè)輝, 邵宗澤. 海洋烷烴降解菌sp. A-11-3 的分離鑒定及其降解酶基因研究[J]. 臺(tái)灣海峽, 2008, 27(4): 427-434. Wu Yehui, Shao Zongze. Isolation and identification of a novel alkane-degrading bacterial speciessp. A-11-3 and alkane hydroxylase gene detection[J]. Journal of Oceanography In Taiwan Strait, 2008, 27(4): 427-434.

[23] 王文娟, 孫冬巖, 孫笑非, 等. 芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體調(diào)節(jié)作用的研究[J]. 飼料研究, 2011(8): 73-74. Wang Wenjuan, Sun Dongyan, Sun Xiaofei, et al. The study of the regulation effect ofon aquaculture water[J]. Feed Research, 2011(8): 73-74.

Isolation and phylogenetic analysis of epiphytic bacteria from mussels collected from the cold seep

GUO Wen-jie1, 2, 3, ZHAO Jin2, 3, QI Hong-tao1, JIANG Peng2, 3, LI Fu-chao2, 3, LI Rong-gui1

(1. Laboratory of Molecular Biology, College of Life Sciences, Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory of Marine Biology and Biotechnology, National Laboratory of Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

Epiphytic bacteria play an important role in substance absorption and metabolism of mussels. Gills of mussels in different experimental groups were collected at different times, and the epiphytic bacteria were cultured and separated. A total of 270 strains were obtained. Four strains, which might be new species, were discovered. The diversity of epiphytic bacteria decreased sharply in 6 h sterile-seawater cultivation. In the methane treatment group, the number ofincreased gradually. In the group treated with Na2S,associated with sulfur circulation increased gradually. It is important to study the interaction between mussels and epiphytic bacteria and to explore the biological resources in extreme deep sea environments.

South China Sea; cold seep; mussel; epiphytic bacteria; diversity

Q938

A

1000-3096(2017)02-0089-07

10.11759/hykx20160930003

2016-09-30;

2017-01-06

中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)(XDA11030404); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31300365)

郭文捷(1991-), 女, 山東聊城人, 碩士, 主要從事深海極端環(huán)境微生物群落多樣性研究, 電話: 17854299753, E-mail: 17854299753@ 163.com。通信作者: 李富超, 053282898500, lifuchao@qdio.ac.cn

Sep.30, 2016

[Special Fund for Strategic Leading Science and Technology Chinese Academy of Sciences, No.XDA11030404; National Natural Science Foundation of China, No.31300365]

(本文編輯: 張培新)