劉世昌　李彥芹　李鳳超　康現(xiàn)江

摘 要：從秦皇島對(duì)蝦養(yǎng)殖池采集底泥，通過(guò)富集、分離、純化，篩選出4株具有氨氮降解能力的菌株，其中菌株F1508對(duì)氨氮的去除能力最強(qiáng)，其24 h和48 h的氨氮去除率分別為81.87%和97.74%。對(duì)菌株F1508進(jìn)行了生理生化鑒定和16S rRNA同源性序列分析，結(jié)果表明菌株F1508與邁索爾節(jié)桿菌Arthrobacter mysorens序列相似性為99%。

關(guān)鍵詞：氨氮降菌解；篩選；生理生化鑒定

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖水體污染不斷增加[1]。水體中氨氮是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康生長(zhǎng)的主要理化因子之一[2]，研究表明生物脫氮是去除水體氨氮污染物最有效方法之一[3]。一直以來(lái)，硝化-反硝化模式是處理含氮污染廢水的主要路線，在硝化過(guò)程中，硝化細(xì)菌在起主要作用[4]，而硝化作用過(guò)程中占據(jù)主要地位的是自養(yǎng)型硝化細(xì)菌[5]。近年來(lái)研究表明，有些異養(yǎng)微生物也能進(jìn)行硝化作用，如芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）[6]、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[7]、副球菌屬（Paracoccus sp.）[8]等。

本實(shí)驗(yàn)從對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥取得樣品，通過(guò)富集、分離、純化，篩選出一株具有較強(qiáng)去除氨氮能力的異養(yǎng)硝化細(xì)菌F1508，對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定和16S rRNA 同源性序列分析，以期為該菌株在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 實(shí)驗(yàn)樣品采集于秦皇島對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 30.0，pH：7.0～7.2。

富集培養(yǎng)基（g/L）：檸檬酸鈉5.0，（NH4）2SO4 2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 30.0，pH：7.0～7.2。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（g/L）：（NH4）2·SO4 0.47，檸檬酸鈉8.2，NaCl 30，pH：7.0～7.2；50mL維氏鹽溶液。

維氏鹽溶液（g/L）：K2HPO4·3H2O 5.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 2.5， MnSO4·4H2O 0.05。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的富集分離 分裝100 mL 富集培養(yǎng)基于500 mL 三角瓶，加入玻璃珠數(shù)粒，滅菌后加入25 mL 泥樣，20 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)2～3 d。吸取富集液25 mL 接入新的富集培養(yǎng)基中，如上條件培養(yǎng)2～3 d，反復(fù)操作3次，以富集目的菌。

取10 mL 上述富集培養(yǎng)液至90 mL 無(wú)菌水中，梯度稀釋?zhuān)坎加贚B平板，20 ℃培養(yǎng)2～3 d。從LB平板上挑取單菌落，經(jīng)過(guò)5輪劃線，純化得到純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到試管斜面。斜面培養(yǎng)2～3 d 備用。

1.2.2 氨氮降解菌篩選 接斜面菌種2環(huán)到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，150 r/min活化24 h；再將活化的菌液按5%的接種量接到裝有100 mL的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶，20 ℃，150 r/min搖瓶48 h，每隔24 h測(cè)定一次氨氮濃度。

采用納氏試劑分光光度法[9]測(cè)定氨氮濃度。測(cè)定氨氮濃度時(shí)，培養(yǎng)液需8 000 r/min 離心10 min，吸取上清液測(cè)定。

脫氮率（A）的計(jì)算公式：A=（c1-c2）/c1，其中c1為體系中所添加氨氮的初始濃度，c2為培養(yǎng)后體系中剩余氨氮濃度。

1.2.3 菌株鑒定 形態(tài)及生理生化鑒定：20 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]。

16S rDNA 序列測(cè)定：將篩選得到的菌株保存斜面送往北京美吉生物醫(yī)藥有限公司測(cè)序。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)到裝有30 mL LB 培養(yǎng)基的三角瓶中活化12 h，將活化好的按5%的接種量接種到裝有100 mL LB 培養(yǎng)基三角瓶中，每隔3 h測(cè)定OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮降解菌的富集分離與篩選

將對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥接入富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，之后再接入LB培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)5輪劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離，最終獲得能在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的純菌株4株，分別編號(hào)為F1502、F1504、F1507、F1508。

將分離得到4株菌株接入異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測(cè)定各組培養(yǎng)基中氨氮的濃度，計(jì)算脫氮率，見(jiàn)表1。如表1所示，菌株F1508對(duì)氨氮降解效率最高，24 h和48 h的氨氮去除率分別為81.87%和97.74%，因此作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.2 菌株F1508鑒定

菌株F1508形態(tài)特征：細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，菌落圓形，邊緣整齊規(guī)則，不透明，菌落淺黃色，菌落直徑0.5～1 mm。菌株F1508的生理生化特征見(jiàn)表2。菌株F1508能夠利用葡糖糖和蔗糖發(fā)酵，能夠產(chǎn)生淀粉酶，利用檸檬酸鹽，不能分解明膠。該菌株能與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生氣泡，呈接觸酶陽(yáng)性。該菌株在吲哚、VP色素實(shí)驗(yàn)中，吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性，VP實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陰性。

分離菌株F1508經(jīng)16S rRNA測(cè)序后與菌株Arthrobacter mysorens （GenBank中的登錄號(hào)為AJ639831.1）進(jìn)行同源性比較，同源性達(dá)99%，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可初步判定所篩選菌株F1508為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。

2.3 生長(zhǎng)曲線

菌株F1508的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，菌株F1508在0～3 h處于調(diào)整期，OD值呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在LB培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)短暫適應(yīng)，3 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD值呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD值變化趨于平緩。

圖1 菌株F1508的生長(zhǎng)曲線

3 討論與結(jié)論

水產(chǎn)養(yǎng)殖中氨氮的積累與眾多的微生物代謝活動(dòng)相關(guān)，不僅影響?hù)~(yú)類(lèi)等水生生物的生長(zhǎng)，甚至?xí)?dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，引起水質(zhì)惡化，污染環(huán)境。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有大量氨氮降解菌被分離出來(lái)，多應(yīng)用于生活和工業(yè)污水處理，但水產(chǎn)養(yǎng)殖中可以應(yīng)用的脫氮菌株相對(duì)較少。如廖小紅等從高溶解氧條件下馴化的SBR曝氣反應(yīng)器中篩選出的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）WXZ-8的氨氮去除率最高達(dá)96.06%[11]。研究表明，能夠進(jìn)行硝化作用的菌株多為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[7]、副球菌屬（Paracoccus sp.）等，然而在節(jié)桿菌屬中具有氨氮降解能力的細(xì)菌報(bào)道相對(duì)較少。

目前我國(guó)海水養(yǎng)殖廢水生物處理研究大多還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用方面相對(duì)較少。因此針對(duì)河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖特定情況，分離篩選出適應(yīng)性強(qiáng)的本土土著菌群，可顯著提高微生物的數(shù)量，快速生產(chǎn)出適宜凈化本土水質(zhì)環(huán)境的菌群，提高菌群的成活率、利用率和處理效果。

本實(shí)驗(yàn)在好氧條件下，分離篩選出1株高效氨氮降解菌F1508，去除率為97.74%。

經(jīng)16S rDNA 同源性分析及形態(tài)觀察、生理生化鑒定，初步判定菌株F1508屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。

參考文獻(xiàn)：

[1]

張峰峰，謝鳳行，周可，等.一株高氨氮去除能力菌株的分離篩選及鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29（4）：221-225

[2] 張家順，蘇真真，薛菲菲，等.2株氨氮去除菌的分離鑒定及去除率影響因素分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2015，39（10）：1549-1557

[3] 李彥芹，李春青，管鵬悅，等.一株好氧反硝化菌的分離鑒定及脫氮條件研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2015（7）：33-37

[4] 劉芳芳，周德平，吳淑杭，等.養(yǎng)殖廢水中異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選和鑒定[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（11）：2232-2237

[5] 王弘宇，馬放，楊開(kāi)，等.兩株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的氨氮去除特性[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2009，29（1）：47-52

[6] 郭強(qiáng)，楊云龍，陳宏平.一株地衣芽孢桿菌異氧硝化-好氧反硝化特性研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2015（7）：38-42

[7] Koschorreck M，Moore E，Conrad R.Oxidation of nitric oxide by a new heterotrophic Pseudomonas sp.[J].Archives of Microbiology，1996，166（1）：23-31

[8] 王潔，藍(lán)江林，劉波.一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定和脫氮特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（4）：805-810

[9] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].第四版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002

[10] 東秀珠，季妙英.常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：294-348

[11] 廖小紅，汪蘋(píng)，刁惠芳，等.蠟狀芽孢桿菌WXZ-8的異養(yǎng)硝化/好氧反硝化性能研究[J].環(huán)境污染與防治，2009，31（7）：17-20

（收稿日期：2016-11-23）