蘇娜 張麗 段龍艷 唐春香

摘要[目的]研究石榴皮中總多酚的熱浸提最佳工藝條件并測(cè)定其含量。[方法]以石榴皮為原料、純水為浸提溶劑加熱浸提石榴皮中總多酚，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究了石榴皮總多酚提取率隨熱浸提溫度、時(shí)間、料液比以及提取次數(shù)4個(gè)客觀因素的變化規(guī)律，并用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定石榴皮總多酚含量。[結(jié)果]通過(guò)Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)確定以熱浸提法提取石榴皮總多酚的最佳工藝為熱浸提溫度45 ℃、時(shí)間30 min、料液比1∶20（g∶mL）、提取次數(shù)為3次，4個(gè)因素對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響順序依次為溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，并以此優(yōu)化工藝進(jìn)行試驗(yàn)，所得總多酚提取率為17.11%。[結(jié)論]采用熱浸提工藝提取石榴皮總多酚并用響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)，在保證快速、高效的同時(shí)也具有節(jié)能、不破壞有效成分的優(yōu)勢(shì)，以純水作為浸提溶劑更是避免了溶劑殘毒問(wèn)題，極大地提高了其安全性，因此也拓寬了極具生物活性的石榴皮多酚在生產(chǎn)生活領(lǐng)域中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞石榴皮；總多酚；提取工藝；響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)S665.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）09-0078-06

Optimization of Extraction Process of Total Polyphenols from Pomegranate Peel by Response Surface Method

SU Na， ZHANG Li*， DUAN Longyan et al

（College of Science， Honghe University， Mengzi， Yunnan 661199）

Abstract[Objective] To study the optimal conditions for extraction of total polyphenols from pomegranate peel and determine its content. [Method] With pomegranate peel as raw material， pure water as solvent， total polyphenols were extracted from pomegranate peel. The variation law of yield of total polyphenols with temperature， time， solidliquid ratio and extraction times was explored by single factor test， the extraction process was optimized and perfected by response surface analysis， and content of total polyphenols in pomegranate peel was determined by FolinCiocalteu colorimetric method. [Result] The optimal conditions were as following： temperature 45 ℃， time 30 min， solidliquid ratio 1∶20（g∶mL）， extraction times 3. The order of influence degree from high to low was temperature， solidliquid ratio， time， extraction times. Under the above conditions， the yield of total polyphenols could up to 17.11%. [Conclusion] Using heat extraction and response surface method is not only fast， efficient but also energysaving and undamaged. With pure water as extraction solvent can avoid the problem of residual hazard， greatly improve its security， and thus widen the highly bioactive pomegranate peel polyphenols applied in the field of production and living situation.

Key wordsPomegranate peel；Total polyphenols；Extraction process；Response surface analysis

石榴屬于被子植物，主要分布在亞熱帶及溫帶地區(qū)，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的稀有漿果。

石榴成熟后，果實(shí)可食用或榨汁，果皮可入藥，其果皮中含有豐富的多酚類物質(zhì)[1]。石榴多酚是石榴果皮中含量較為豐富的一類化合物，其組成成分主要包括鞣花酸、安石榴苷、沒(méi)食子酸 、兒茶素、兒茶酚、綠原酸等其他化合物。研究表明，石榴皮中的多酚物質(zhì)具有抗氧化、抗衰老、抗癌防癌、抗菌、潤(rùn)膚、美容、降血壓和預(yù)防心腦血管疾病的功能[2-5]。石榴性溫，味甘酸澀，入經(jīng)肺、腎、大腸，能有效止血止瀉、生津止渴，還可治療久瀉、便血等病狀，對(duì)大多數(shù)革蘭氏細(xì)菌有明顯的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌作用最強(qiáng)；對(duì)大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌也有比較好的抑制作用。目前認(rèn)為，石榴皮對(duì)多種細(xì)菌、真菌和霉菌等的抑制作用可能與其所含的鞣質(zhì)（多酚）成分有關(guān)[6-7]。石榴富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性成分，因而具有極高的營(yíng)養(yǎng)、保健及藥用價(jià)值（可作為制作保健食品的功能成分）。

目前，在石榴皮多酚提取工藝的研究中，大多采用溶劑浸提法，且其提取溶劑大多采用甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，很少以水作為提取溶劑，這是由于有機(jī)溶劑浸提法相對(duì)于水提取法提取率較高。以有機(jī)溶劑作為提取溶劑存在溶劑殘毒的問(wèn)題，同時(shí)提取成本也較高，從而導(dǎo)致其提取物不能有效地應(yīng)用于生產(chǎn)生活領(lǐng)域[8]。以純水作為提取溶劑，相對(duì)于前者方法簡(jiǎn)便，成本較低，且無(wú)溶劑殘毒后患，其提取物可廣泛應(yīng)用于食品、藥品生產(chǎn)加工領(lǐng)域。

筆者以石榴皮為原料，以純水作為提取溶劑加熱浸提石榴皮中總多酚，操作方便、取材簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)環(huán)保且可實(shí)現(xiàn)最終提取物無(wú)溶劑殘毒。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。

石榴皮粉：于蒙自石榴園采摘新鮮石榴，取其皮后經(jīng)烘箱干燥8 h，粉碎后過(guò)40目篩，于包裝袋中密封保存，置于干燥、避光的環(huán)境中。

1.1.2主要試劑。

無(wú)水碳酸鈉（AR），蒙自市滬泰物資責(zé)任有限公司；沒(méi)食子酸（AR），天津市鼎盛鑫化工有限公司；福林酚試劑（BR），南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備。

SK5200HP超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

TDL80-2B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；

WFJ2000型可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

SHZ-ⅢA循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

DHG-9003 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1總多酚的提取工藝流程。

石榴皮→干燥→粉碎→過(guò)篩→溶劑浸提→過(guò)濾→離心→上清液→蒸發(fā)濃縮→定容。

1.2.2

總多酚提取率的測(cè)定。采用 Folin-Ciocalteu比色法[9]測(cè)定石榴皮總多酚提取率，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2.1

繪制多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取沒(méi)食子酸0.012 5 g，用蒸餾水溶解并定容至500 mL，得到濃度為 0.025 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、70、8.0、9.0 mL 置于25 mL的棕色容量瓶中，分別加入福林酚試劑 1.0 mL，混勻，在0.5～8.0 min 內(nèi)加入4 mL 15%的Na2CO3溶液，充分混合后用純水定容，室溫下避光靜置 1 h，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的試樣為空白對(duì)照，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。以沒(méi)食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=0.117 2x+0.012 3，R2=0.999 1 。

1.2.2.2

樣品測(cè)定。準(zhǔn)確吸取石榴皮多酚提取液1.0 mL于25 mL的棕色容量瓶中，加入福林酚試劑1.0 mL，混勻，在0.5～8.0 min 內(nèi)加入4 mL 15%的Na2CO3溶液，充分搖勻后用純水定容，室溫下避光靜置1 h，以純水作為空白對(duì)照，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每個(gè)試樣平行測(cè)定3次。

1.2.2.3總多酚提取率計(jì)算。

石榴皮總多酚提取率=所得提取液中總多酚質(zhì)量/石榴皮粉質(zhì)量×100%。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1石榴皮中總多酚提取率隨溫度的變化規(guī)律。

準(zhǔn)確稱取3 g石榴皮粉，在熱浸提時(shí)間為30 min、料液比為1∶20（g∶mL）、提取次數(shù)為1的條件下，探究溫度對(duì)總多酚提取率的影響，其變化規(guī)律見(jiàn)圖2。

有研究表明，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出受制于溫度的影響，當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出的速率慢、效率低；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，對(duì)于熱敏性物質(zhì)性質(zhì)產(chǎn)生極大影響，可能破壞其性質(zhì)，同時(shí)能量消耗大[10]。由圖2可知，溫度升高，總多酚的提取率上升，在60 ℃時(shí)總多酚提取率達(dá)到最高；60 ℃之后，總多酚提取率隨溫度的升高反而降低。因此，以60 ℃作為提取溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2石榴皮中總多酚提取率隨時(shí)間的變化規(guī)律。

準(zhǔn)確稱取石榴皮粉3 g，在提取溫度為60 ℃、料液比為1∶20（g∶mL）、提取次數(shù)為1的條件下，探究石榴皮中總多酚提取率隨時(shí)間變化的規(guī)律，具體見(jiàn)圖3。

圖3石榴皮中總多酚提取率隨時(shí)間的變化規(guī)律

Fig.3The change of yield of total polyphenols from pomegranate peel with time

熱浸提時(shí)間是影響石榴皮總多酚提取率的一個(gè)重要因素，熱浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、過(guò)短都不利于石榴皮多酚類物質(zhì)的有效提取。熱浸提時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)時(shí)間短，石榴皮總多酚提取不完全，其提取率低；熱浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熱敏性物質(zhì)被破壞，生產(chǎn)效率低，且在長(zhǎng)時(shí)間加熱條件下多酚易氧化而使其活性被破壞[11]，從而使得提取率降低。從圖3可以看出，熱浸提時(shí)間在15～30 min時(shí)石榴皮總多酚提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，30 min時(shí)總多酚提取率最高，30 min后隨提取時(shí)間增加石榴皮總多酚提取率逐漸降低?？紤]生產(chǎn)效率，選擇30 min作為熱浸提時(shí)間較為合理。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

2.1.3石榴皮中總多酚提取率隨料液比的變化規(guī)律。

準(zhǔn)確稱取石榴皮粉3 g，在固定提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間30 min、提取次數(shù)為1的條件下，探究石榴皮總多酚提取率隨料液比變化的規(guī)律，具體見(jiàn)圖4。

圖4石榴皮中總多酚提取率隨料液比的變化規(guī)律

Fig.4The change of yield of total polyphenols from pomegranate peel with solidliquid ratio

料液比是影響原料中多酚提取的重要因素之一。料液比的不同可能造成石榴皮粉末與提取溶劑的接觸面積不同，從而影響石榴皮總多酚的提取率。由圖4可見(jiàn)，石榴皮總多酚提取率隨著料液比中溶劑用量的增加逐漸增高，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)，石榴皮總多酚提取率最大，在1∶20（g∶mL）后石榴皮總多酚提取率隨料液比中溶劑用量的增加逐漸降低，同時(shí)增加了成本以及造成了試劑浪費(fèi)。因此，選擇1∶20（g∶mL）為最佳料液比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4石榴皮中總多酚提取率隨提取次數(shù)的變化規(guī)律。

準(zhǔn)確稱取石榴皮粉3 g，在提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶20（g∶mL）的條件下，探究石榴皮總多酚提取率隨提取次數(shù)變化的規(guī)律，具體見(jiàn)圖5。

圖5石榴皮中總多酚提取率隨提取次數(shù)的變化規(guī)律

Fig.5The change of yield of total polyphenols from pomegranate peel with extraction times

由圖5可知，總多酚提取率是隨著提取次數(shù)的增加而增加，提取1、2、3次的總多酚提取率增加較快，即提取效率較高，但3次以后其增加速度逐漸減小并趨于平緩，提取效率不再顯著。因?yàn)殡S著提取次數(shù)增加石榴皮中的多酚類物質(zhì)逐漸提取完全并且其他雜質(zhì)的分解也干擾了總多酚提取率。當(dāng)提取3次時(shí)，總多酚提取率最高，所以選擇提取3次為最優(yōu)提取次數(shù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化石榴皮多酚提取工藝

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)。

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理[12]，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）和提取次數(shù)（D）4個(gè)因素作為自變量，以石榴皮總多酚提取率為響應(yīng)值，采用4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2.2.2響應(yīng)面分析方案及結(jié)果。

對(duì)石榴皮總多酚的水提工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

利用 Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的因素和響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得石榴皮中總多酚提取率（Y）對(duì)熱浸提溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）以及提取次數(shù)（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=16.74-1.20 A-0.27 B-047 C+0.050 D-0.21 AB-0.31 AC-0.042 AD+0.37 BC+011 BD+0.44 CD-057 A2 -1.43 B2 -1.50 C2-1.68 D2。

通過(guò)方差分析得出，試驗(yàn)所選用模型的P<0.000 1，故極顯著（P<0.05），且模型的確定系數(shù)R2=0.962 8，模型的調(diào)整確定系數(shù) R2adj為0.925 7，表明該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差極小；再者該模型能解釋 92.57%響應(yīng)值的變化，完全可用此模型對(duì)石榴皮總多酚提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)所得回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由回歸模型方差分析得出提取溫度A（P<0.000 1）、時(shí)間二次項(xiàng)B2（P<0000 1）、料液比二次項(xiàng)C2（P<0.000 1）及提取次數(shù)二次項(xiàng)D2（P<0000 1）對(duì)石榴皮提取液中總多酚提取率影響極大；提取時(shí)間 B（P=0.035 7）、料液比C（P=0.001 0）、提取溫度二次項(xiàng)A2（P=0.002 4）以及料液比與提取次數(shù)的交互項(xiàng)CD（P=0044 9）對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響極顯著。由此得出，4個(gè)因素對(duì)提取率的影響順序依次為提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)。

2.2.3石榴皮總多酚提取率及各個(gè)因素之間的響應(yīng)面分析。

以所得回歸方程為依據(jù)，利用Design Expert 8.0軟件對(duì)其進(jìn)行繪圖分析。通過(guò)繪制的等高線圖及交互響應(yīng)曲面圖來(lái)預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量的相互關(guān)系。若交互響應(yīng)曲面圖為凸形曲面且開(kāi)口向下，則表明響應(yīng)值存在極大值，各因素對(duì)石榴皮中總多酚提取率的影響可通過(guò)曲線的陡峭程度來(lái)判斷，曲線越陡峭則表明該因素對(duì)石榴皮總多酚的影響越大，其響應(yīng)值的變化就越大。等高線圖也是衡量變量之間交互作用的一個(gè)重要表征，若為橢圓的等高線圖，則表明交互作用明顯；若為圓形的等高線圖則說(shuō)明交互作用不明顯[13]。其中提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)有2個(gè)因素不變時(shí)，另外2個(gè)因素及其交互作用對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響能從交互響應(yīng)面和等高線圖中分析得出。

當(dāng)液料比為1∶20、提取次數(shù)為3時(shí)，提取溫度與提取時(shí)間2個(gè)因素之間的交互作用如圖6所示，兩者交互等高線圖呈橢圓形，由此得出這2個(gè)因素間的交互作用明顯。起初，石榴皮總多酚提取率隨著時(shí)間和溫度的增加而增加，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃、時(shí)間30 min后，石榴皮總多酚提取率開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且從圖6中可以看出，相對(duì)于溫度對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響，時(shí)間對(duì)其的影響效果更明顯，曲線表現(xiàn)為陡峭；當(dāng)時(shí)間為30 min、提取溫度為60 ℃時(shí)，石榴皮總多酚提取率較高。

當(dāng)提取時(shí)間為30 min、提取次數(shù)為3時(shí)，提取溫度與料液比2個(gè)因素之間的交互作用見(jiàn)圖7。 由圖7可得，這2個(gè)因素間的交互作用明顯。石榴皮總多酚提取率與料液比和提取溫度的關(guān)系成正比，在溫度達(dá)到60 ℃、液料比1∶20后，石榴皮總多酚提取率開(kāi)始下降，并且從圖7中可以看出料液比對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響效果比提取溫度對(duì)其的影響更為明顯，曲線表現(xiàn)為陡峭。石榴皮總多酚提取率在液料比為1∶20、提取溫度為60 ℃時(shí)較高。

當(dāng)提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶20時(shí)，提取溫度與提取次數(shù)2個(gè)因素之間的交互作用見(jiàn)圖8。其等高線圖呈橢圓，則表明這2個(gè)因素間交互作用明顯。石榴皮總多酚提取率隨著提取次數(shù)的增加和提取溫度的升高而增加，但當(dāng)提取次數(shù)達(dá)3次、溫度60 ℃后，總多酚含量開(kāi)始減少，并且從圖8中可以看出，提取次數(shù)對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響效果比溫度對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響更加明顯，曲線表現(xiàn)為陡峭。當(dāng)提取次數(shù)3次、溫度60 ℃時(shí)，提取的石榴皮總多酚較多。

當(dāng)溫度為60 ℃，提取次數(shù)為3次時(shí)，料液比與提取時(shí)間2個(gè)因素之間的關(guān)系見(jiàn)圖9。等高線圖呈橢圓，則說(shuō)明這2個(gè)因素之間存在明顯的交互作用。隨著時(shí)間和料液比的不

斷增加，石榴皮總多酚提取率也在逐漸增大；總多酚提取率

在料液比1∶20、提取時(shí)間30 min后開(kāi)始下降，曲線都呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)，據(jù)此得出提取時(shí)間和料液比對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響差別不大。石榴皮總多酚提取率在1∶20的料液比、30 min的提取時(shí)間下效果較好。

當(dāng)溫度為60 ℃、料液比為1∶20時(shí)，提取次數(shù)與時(shí)間兩者的交互作用見(jiàn)圖10。等高線圖呈橢圓，兩因素間存在明顯的交互作用。提取時(shí)間和提取次數(shù)增加的同時(shí)，總多酚提取率上升，但當(dāng)料液比達(dá)1∶20，時(shí)間30 min后，總多酚提取率開(kāi)始下降，二者曲線都漸漸趨向平緩。由此可知，提取次數(shù)與時(shí)間對(duì)石榴皮總多酚提取率的影響差別不大。當(dāng)時(shí)間為30 min、提取次數(shù)3次的條件下，石榴皮總多酚提取率較高。

當(dāng)溫度為60 ℃、時(shí)間為30 min時(shí)，料液比與提取次數(shù)2個(gè)因素之間的交互作用見(jiàn)圖11。 等高線圖為橢圓，說(shuō)明這2個(gè)因素的交互作用明顯。石榴皮總多酚提取率隨著提取次數(shù)和料液比的增加而增大，在料液比達(dá)到1∶20，提取次數(shù)3次后，上升的程度開(kāi)始平緩。因此，石榴皮總多酚提取率在提取次數(shù)為3次、料液比1∶20時(shí)效果較佳。

2.2.4提取工藝條件的確定。

通過(guò)試驗(yàn)輔助軟件 Design Expert 8.0 得到最優(yōu)提取條件為熱浸提溫度45 ℃、熱浸提時(shí)間29.63 min、料液比1∶20、提取次數(shù)為3次，此時(shí)所得石榴皮總多酚提取率為 17.38%。

考慮到實(shí)際操作的可行性，將提取條件修正為熱浸提溫度45 ℃、熱浸提時(shí)間30 min、料液比1∶20、提取次數(shù)為3次，在修正條件下做 3 次平行試驗(yàn)，該工藝條件下石榴皮總多酚提取率為17.11%，與理論值的相對(duì)誤差極小，表明經(jīng)響應(yīng)面分析法優(yōu)化后的石榴皮總多酚提取工藝具有實(shí)際可行性及可操作意義。

3結(jié)論

近年來(lái)，關(guān)于石榴皮多酚的活性研究越來(lái)越多，很多研究方法采用有機(jī)溶劑提取，但該研究本著環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、有效、無(wú)毒無(wú)害的研發(fā)理念，以純水作為提取溶劑來(lái)研究石榴皮總多酚物質(zhì)提取工藝，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了熱浸提溫度、提取時(shí)間、料液比以及提取次數(shù)對(duì)石榴皮中總多酚提取率的影響，并且通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定用溫度45 ℃、時(shí)間30 min、料液比1∶20（g∶mL）、提取次數(shù)3次作為熱浸提法提取石榴皮中總多酚的最佳工藝條件。

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