甘蔗花青素轉(zhuǎn)錄因子基因ScRS克隆與基因槍轉(zhuǎn)化研究

劉迪　施桂姣　肖乃衍　KhalilFarghama　許躍語(yǔ)　陳平華　張卓　王恒波　高三基　許莉萍　張華

摘 要 花青素不僅是天然色素，而且具有保健功能?；ㄇ嗨剞D(zhuǎn)錄因子基因?qū)τ谡{(diào)控花青素的合成具有關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)玉米花青素轉(zhuǎn)錄因子基因RS序列設(shè)計(jì)引物，利用同源克隆技術(shù)，得到甘蔗花青素轉(zhuǎn)錄因子基因ScRS的全長(zhǎng)序列；在ScRS序列兩端分別添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-35SN-ScRS，包被微粒載體通過基因槍對(duì)甘蔗愈傷組織進(jìn)行轟擊，轉(zhuǎn)化的愈傷組織明顯呈紫紅色；將紫紅色愈傷組織分化培養(yǎng)獲得再生甘蔗植株，經(jīng)PCR檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)ScRS基因陽(yáng)性植株，初步證實(shí)利用克隆的基因轉(zhuǎn)化甘蔗可以使愈傷組織顯色。研究結(jié)果對(duì)于建立新型的遺傳轉(zhuǎn)化可視化示蹤體系和培育高花青素甘蔗品種具有重要意義。

關(guān)鍵詞 甘蔗；花青素轉(zhuǎn)錄因子基因；ScRS；基因槍轟擊

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Anthocyanins are not only natural pigments， but also health care ingredients. The anthocyanin transcriptional factor genes play import roles in anthocyanin biosynthesis. In this study， the specific primer was designed according to the sequence of maize anthocyanin transcriptional factor gene RS. The full sequence of putative sugarcane anthocyanin transcription factor gene ScRS was cloned by homology cloning technology. The plant expression vector of pCAMBIA1301-35SN-ScRS was constructed by adding endonuclease sites of KpnⅠ and SalⅠ at the ends of ScRS sequence， which was transformed into sugarcane calli via gene gun bombardment， and the calli bombarded turned purple-red. The calli with purple-red color were selected and regenerated into plants. The PCR results were positive in the transgenic detection of the regenerated sugarcane plants with specific primers of ScRS. The results preliminarily confirmed that the transformation of ScRS gene would make sugarcane calli colorated. Cloning and characterization of anthocyanin transcription factor genes would contribute to develop anthocyanin-rich varieties and establish visual tracing system in genetic transformation.

Key words Sugarcane； anthocyanin transcriptional factor gene； ScRS； microprojectile bombardment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.018

甘蔗是禾本科作物，除制糖外，還可以生產(chǎn)燃料乙醇，是一種重要的化工和能源作物。另外，果蔗除了直接食用還可以用于制作飲料，消暑生津，是深受人們歡迎的水果。據(jù)測(cè)定，蔗汁還含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中含有的微量花青素還具有保健功能[1]?；ㄇ嗨兀脖环Q為花色素、花色苷，是自然界中一類普遍存在的植物源水溶性色素，不僅能使植物呈現(xiàn)豐富多彩的顏色，有利于植物之間的授粉，而且還能夠保護(hù)植物果實(shí)免受紫外線的傷害。前人的研究結(jié)果表明，花青素具備很強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力比維生素C高出20多倍，比維生素E高出50多倍。它是自由基的有效清除劑之一，在心血管疾病的預(yù)防、免疫活性的調(diào)節(jié)等方面尤為重要，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用[2]。如何利用基因工程手段來(lái)改造花青素相關(guān)基因、提高植物花青素的含量已成為熱門的研究領(lǐng)域。自然界中的大多數(shù)植物包括甘蔗均可合成花青素[3]，但由于轉(zhuǎn)錄因子的未激活等原因致使含量很低，通過導(dǎo)入調(diào)節(jié)基因，使其適當(dāng)表達(dá)，可以改變植物中花青素的含量[4]。目前已有科學(xué)研究表明，合理適當(dāng)?shù)剡\(yùn)用花青素調(diào)控基因，可以建立一套新型的植物轉(zhuǎn)基因研究可視化示蹤系統(tǒng)[5]。當(dāng)前在遺傳轉(zhuǎn)化上應(yīng)用比較廣泛的報(bào)告基因如GUS和GFP等都存在著一定程度的不足和缺陷，如GUS染色對(duì)植株具有破壞性[6]；GFP蛋白含量較高時(shí)對(duì)植物具有毒害作用，使細(xì)胞再生能力下降[7]。二者除有報(bào)告功能外，沒有其它實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；表達(dá)的蛋白還要消耗植物同化物，對(duì)植物生長(zhǎng)無(wú)益等。如以花青素轉(zhuǎn)錄因子基因作為報(bào)告基因，除了可以發(fā)揮報(bào)告功能外，對(duì)植物的生長(zhǎng)和人類健康也具有重要作用，因此，對(duì)花青素表達(dá)相關(guān)基因的研究顯得尤為重要。

本研究在其他作物研究的基礎(chǔ)上，試圖在甘蔗中克隆出與花青素合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，并將克隆的基因轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，觀察顯色效果，篩選可引起甘蔗細(xì)胞發(fā)生顏色變化的基因，旨在評(píng)估利用該基因建立遺傳轉(zhuǎn)化可視化示蹤體系的潛力，同時(shí)為培育高花青素品種和創(chuàng)制優(yōu)良種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料與試劑 甘蔗品種ROC22和FN39由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程中心選育；表達(dá)載體pCAMBIA1301-35SN由本中心保存；pMD18-T載體、Premix TaqTM（RR902A）、RNA kit ver.3.0購(gòu)自TAKARA公司；TIANscript RT Kit、DNA Maker、T4 DNA Ligase和DH5α購(gòu)自北京天根公司；LA Taq酶、2×Premix Ex Taq酶、Pfu DNA聚合酶、內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ購(gòu)自Fermentas公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（D2500-02）、E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit（D6942-02）購(gòu)自O(shè)MEGA公司；上海生工生物工程公司（下文簡(jiǎn)稱上海生工）合成PCR引物、提供LB培養(yǎng)基、Trizol試劑和DEPC H2O；基因槍耗材購(gòu)自Bio-Rad公司；植物DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司；卡那霉素、亞精胺、CaCl2·2H2O均購(gòu)于Sigma公司；甘蔗培養(yǎng)基配方參見張卓等[8]，有關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 定性PCR檢測(cè)使用德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的5331型PCR儀；基因槍使用美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的PDS-1000/He微粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)玉米R(shí)S（GenBank：X15806.1）序列，在起始和終止密碼子位置設(shè)計(jì)一對(duì)引物，分別為ScRSF1（5′-ATGGCCGTTTCAGCTTCC-3′）、ScRSR1（5′-TCACCGCTTCCCTATAGC-3′）。在引物的兩端添加內(nèi)切酶位點(diǎn)SalⅠ和KpnⅠ，用于構(gòu)建植物表達(dá)載體（ScRSF2：5′-ACGCGTCGACATGGCCGTT

TCAGCTTCC-3′；ScRSR2：5′-GGGGTACCTCACC

GCTTCCCTATAGC-3′）。

1.2.2 甘蔗葉片總RNA的提取 提取方法參照張卓等[8]。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度。同時(shí)取6 μL總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.3 cDNA第一鏈的合成 以甘蔗葉片總RNA為模板，使用TIANscript RT Kit試劑盒合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系：5 μL總RNA樣品，2 μL Super pured NTPs，2 μL Oligo（dT）15 Primer，加ddH2O使總體積達(dá)到14.5 μL，混勻離心，70 ℃保溫5 min，在冰水中冷卻2 min；然后加入5×Reverse Transcriptase Buffer（含DTT）4 μL，RNasin 0.5 μL，TIANSCRIPT M-MLV 1 μL，終體積20.0 μL；混勻、離心，進(jìn)行如下熱循環(huán)反應(yīng)：25 ℃ 10 min；42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min；將反應(yīng)液稀釋至50 μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增ScRS目的基因片段 配制50 μL的PCR反應(yīng)體系，包括30 μL ddH2O、5 μL 10×pfu Buffer、1 μL Pfu DNA Polymerase、5 μL dNTP、2 μL ScRSF1（10 μmol/L）、2 μL ScRSR1（10 μmol/L）、5 μL模板cDNA，混勻、離心，于PCR儀上進(jìn)行如下熱循環(huán)反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，25個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min），最后72 ℃延伸10 min，將PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。

1.2.5 目的基因片段回收及加尾 用OMEGA膠回收試劑盒回收目的片段；在微量離心管內(nèi)配制下列反應(yīng)液：7.5 μL的ScRS基因片段，1 μL的10×Taq DNA聚合酶緩沖液（含MgCL2），0.5 μL的Ex Taq DNA聚合酶，1 μL的dATP，總體積10 μL；于PCR儀上70 ℃溫育20 min。此反應(yīng)液直接用于TA克隆。

1.2.6 ScRS基因片段TA克隆 在離心管中配制下列反應(yīng)液：2 μL的ScRS基因PCR加尾產(chǎn)物（50 ng/μL），1 μL的pMD18-T vector（50 ng/μL），2 μL的ddH2O，5 μL的Solution I，總體積10 μL；于16 ℃反應(yīng)60 min，即為連接產(chǎn)物。

1.2.7 轉(zhuǎn)化大腸桿菌及重組子篩選 參照說(shuō)明將上述克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后吸取150 μL菌液，加40 μL X-gal（20 mg/ml）和16 μL IPTG（50 mg/ml）混勻，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h；挑取白色的單菌落，接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），于37 ℃過夜培養(yǎng)；吸取2 mL菌液，離心收集菌體，用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒；吸2 μL重組質(zhì)粒，分別加入6 μL ddH2O，10 μL 2×ExTaq Mix，ScRSF1（10 μmol/L）和ScRSR1（10 μmol/L）各1 μL；于PCR儀上進(jìn)行如下熱循環(huán)反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，30個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），最后72 ℃延伸10 min；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。篩選的重組子命名為pMD18-T-ScRS。

1.2.8 植物表達(dá)載體構(gòu)建 吸2 μL pMD18-T-ScRS質(zhì)粒，加入6 μL ddH2O，10 μL 2×ExTaq Mix，ScRSF2（10 μmol/L）和ScRSR2（10 μmol/L）各1 μL，于PCR儀上進(jìn)行如下熱循環(huán)反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，30個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），最后72 ℃延伸10 min；將PCR產(chǎn)物電泳，回收目的片段；用SalⅠ和KpnⅠ對(duì)回收片段和載體pCAMBIA1301-35SN進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物電泳，回收目的片段；用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。重組子篩選參照1.2.7，引物用ScRSF2和ScRSR2，同時(shí)用SalⅠ和KpnⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.9 基因槍轉(zhuǎn)化和植株再生 基因槍法轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織和植株再生方法參考張卓等[8]。

1.2.10 轉(zhuǎn)基因甘蔗再生植株P(guān)CR檢測(cè) 以再生植株為樣品，利用微量堿裂解方法制備PCR模板[9]，根據(jù)表達(dá)載體設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)特異性檢測(cè)引物，上、下游引物分別在CaMV35S和NOS區(qū)，分別為35S-F（5′-GGGATGACGCACAATCCCACTATC-3′）、NOS-R（5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′）。PCR對(duì)照甘蔗內(nèi)參基因?yàn)锳LS，引物序列為ALS-F（5′-CTCCC

AGTGAAGGTCTTTGCG-3′）、ALS-R（5′-TGCTGGA

ATGTTGAACCCTTT-3′）。反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，PCR模板2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至終體積20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃變性3 min；進(jìn)行30次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min）；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA濃度與完整性

測(cè)定結(jié)果顯示，提取所得的甘蔗葉片總RNA D260/D280為1.95，D260/D230為2.03。經(jīng)凝膠電泳分離，結(jié)果顯示，提取的總RNA有3條（28s、18s、5s）明顯的條帶（圖1），且條帶較清晰，無(wú)明顯雜質(zhì)，可以用于RT-PCR擴(kuò)增。

2.2 ScRS基因克隆

2.2.1 ScRS基因序列獲得 利用設(shè)計(jì)的用于克隆花青素轉(zhuǎn)錄因子基因RS的引物ScRSF1和ScRSR1，以甘蔗葉片cDNA為模板擴(kuò)增得到一個(gè)大約1 700 bp的DNA片段，命名為ScRS基因，如圖2所示。

回收純化擴(kuò)增效果較好的ROC22 PCR產(chǎn)物，將其與pMD-18T載體連接，用PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序，得到1 722 bp的序列，見圖3。甘蔗ScRS基因開放讀碼框長(zhǎng)度為1 722 bp。將甘蔗ScRS基因的編碼區(qū)序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與玉米的RS基因（登錄號(hào)：NM_

001112603.1）序列相似度為90%，與玉米Lc基因（登錄號(hào)：NM_001111869.1）相似度為82%，與高粱b1-1基因（登錄號(hào)：AY542311.1）相似度為89%，與玉米b1基因（登錄號(hào)：NM_001112236.1）相似度為84%，與狗尾草R-S基因（登錄號(hào)：NM_004970820.1）相似度為83%。特別是在與眾多花青素相關(guān)基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，說(shuō)明所克隆的基因?yàn)榛ㄇ嗨睾铣上嚓P(guān)基因。

2.2.2 ScRS基因氨基酸序列分析 甘蔗ScRS基因開放讀碼框長(zhǎng)1 722 bp，編碼573個(gè)氨基酸，理論分子量為62.55 ku。其cDNA序列相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如圖4所示。通過NCBI進(jìn)行conserved domains specific BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甘蔗ScRS蛋白中含有bHLH-MYC（第11-203氨基酸）和HLH（第382-432氨基酸）結(jié)構(gòu)，這是花青素調(diào)控因子的共有特征，進(jìn)一步證明克隆的基因確實(shí)為花青素調(diào)控因子基因。

2.3 表達(dá)載體構(gòu)建與酶切驗(yàn)證

通過酶切、目的片段回收和連接等過程，將克隆的ScRS基因插入到載體pCAMBIA1301-35SN中，將重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1301-35SN-ScRS。用SalⅠ和KpnⅠ酶切，結(jié)果顯示目的基因已成功整合進(jìn)重組質(zhì)粒中（圖5）。

2.4 基因槍轉(zhuǎn)化和植株再生

挑取嫩黃色、致密的愈傷組織進(jìn)行基因槍轟擊。轟擊4～5 d后，甘蔗愈傷組織表面會(huì)出現(xiàn)少許褐色；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，觀察到愈傷組織表面顏色發(fā)生了明顯變化，出現(xiàn)了紅色的斑點(diǎn)，而轟擊空載體的愈傷組織和未進(jìn)行基因槍轟擊的愈傷組織對(duì)照則無(wú)明顯變化，見圖6。

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，挑選紅色愈傷組織于光照條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)，逐漸分化產(chǎn)生了綠苗；經(jīng)過生根培養(yǎng)和煉苗移栽獲得了完整甘蔗苗，觀察到大部分再生苗葉片呈綠色（圖7-A）。溫室移植苗葉鞘部分呈紫紅色（圖7-B），與對(duì)照差別明顯。

2.5 轉(zhuǎn)基因甘蔗再生苗的分子檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因再生苗葉片于1.5 mL離心管中，利用微量堿裂解方法處理葉片[9]，分別獲得一定量的DNA模板。首先以甘蔗內(nèi)參基因ALS為參照基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖8，每一個(gè)樣品在接近200 bp位置均產(chǎn)生了一個(gè)條帶，與ALS基因目的條帶（171 bp）一致，說(shuō)明堿裂解制備的模板質(zhì)量能夠滿足PCR檢測(cè)的要求，可以進(jìn)行目的基因的檢測(cè)。

以紅色細(xì)胞再生苗葉片堿裂解液為模板，用檢測(cè)目的基因ScRS表達(dá)框的結(jié)構(gòu)特異性引物35S-F和NOS-R進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示在2 000 bp和2 500 bp位置附近各出現(xiàn)了一個(gè)條帶，結(jié)果見圖9。

分別將2個(gè)條帶切下，回收；將回收的PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，結(jié)果顯示小片段為目的基因，大片段為GUS基因。由于GUS基因和目的基因兩側(cè)的啟動(dòng)子和終止子均為CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子，所以PCR檢測(cè)結(jié)果顯示有2條帶，這與測(cè)序結(jié)果相一致，說(shuō)明利用基因槍轉(zhuǎn)化得到了轉(zhuǎn)ScRS基因甘蔗苗。

3 討論

3.1 ScRS基因在培育高花青素甘蔗中的應(yīng)用前景

本研究從甘蔗葉片中克隆得到ScRS基因，經(jīng)過核苷酸和氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析，證明該基因是花青素轉(zhuǎn)錄因子基因。通過轉(zhuǎn)化進(jìn)一步證明ScRS基因在甘蔗中具有調(diào)節(jié)花青素合成的作用。目前，紫心地瓜、獼猴桃等已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，因天然色素的特殊保健作用使得其價(jià)值倍增。但迄今為止，市場(chǎng)上尚未見有紫心甘蔗品種，也尚未見有研究報(bào)道。如培育出高花青素的糖料甘蔗品種，則可在加工蔗糖的同時(shí)回收花青素，為食品生產(chǎn)提供天然色素，不僅可以消除化學(xué)色素添加劑造成的餐桌污染，而且由于花青素的保健作用，將使多種食品成為保健食品；如培育出高花青素的果蔗品種，果蔗的價(jià)值將成倍增長(zhǎng)，大幅提高蔗農(nóng)的收入，促進(jìn)甘蔗行業(yè)發(fā)展。當(dāng)然，如果得到的轉(zhuǎn)基因甘蔗ScRS表達(dá)量過高，將可能影響轉(zhuǎn)基因甘蔗的其它性狀，如產(chǎn)量、蔗糖含量等；因此，需要?jiǎng)?chuàng)制較大的轉(zhuǎn)ScRS基因甘蔗群體，從中篩選ScRS基因表達(dá)量適中且其它經(jīng)濟(jì)性狀變化不大的轉(zhuǎn)基因株系，培育具有推廣應(yīng)用價(jià)值的高花青素甘蔗新品種。

3.2 基因槍轟擊對(duì)甘蔗愈傷組織的影響

基因槍轟擊后，對(duì)愈傷組織會(huì)造成一定的損傷，使得愈傷組織表面發(fā)生輕微的褐化現(xiàn)象。Goff[10]等曾報(bào)道，槍擊時(shí)，DNA一般只能達(dá)到組織表面細(xì)胞的1～5層內(nèi)，最深的不過12層。本研究顯示，顯色細(xì)胞不是褐化現(xiàn)象，因?yàn)閷?duì)照細(xì)胞沒有出現(xiàn)褐化，轉(zhuǎn)ScRS基因的愈傷組織出現(xiàn)的是紫紅色斑點(diǎn)，顯微觀察整個(gè)細(xì)胞呈紅色，不顯褐色，且顯色部位也不在細(xì)胞間隙。本研究結(jié)果表明，可以通過轉(zhuǎn)入花青素的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因ScRS，對(duì)愈傷組織進(jìn)行有目的的選擇，挑取有顏色的組織進(jìn)行分化，得到轉(zhuǎn)基因植株，ScRS具有作為篩選標(biāo)記基因的潛力。

3.3 ScRS的調(diào)節(jié)作用

在類黃酮次生代謝生物合成中，轉(zhuǎn)錄因子扮演著重要角色。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子同結(jié)構(gòu)基因結(jié)合后，能激活代謝途徑中多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)，進(jìn)而使次生代謝途徑能夠有效地啟動(dòng)。轉(zhuǎn)錄因子在花色合成過程中的空間表達(dá)體現(xiàn)了組織特異性和時(shí)空差異性。同一合成途徑在植物的不同發(fā)育階段，花色素合成受控于不同的轉(zhuǎn)錄因子。Eugenio等[11]曾報(bào)道將從金魚草中克隆的轉(zhuǎn)錄因子基因Rosea1轉(zhuǎn)入番茄，轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)呈藍(lán)紫色。楊蕓菲等[12]將從巨峰葡萄中分離的花青素合成調(diào)節(jié)基因VlmybA2轉(zhuǎn)入到水稻中，轉(zhuǎn)基因水稻的根際變?yōu)榧t褐色條紋。Han等[13]利用玉米調(diào)控基因pl和Lc轉(zhuǎn)化玉米時(shí)也得到了相似的結(jié)果。本研究中，在甘蔗愈傷組織階段，愈傷組織表面出現(xiàn)紫紅色，而分化成為植株后組織器官較對(duì)照并未發(fā)生明顯的顏色變化，但當(dāng)其在溫室內(nèi)發(fā)育成為較大植株時(shí)又出現(xiàn)顯著的顏色變化。推測(cè)ScRS的調(diào)節(jié)作用具有時(shí)空性，在愈傷組織期間表達(dá)顯著，增強(qiáng)了代謝途徑，使愈傷組織呈現(xiàn)出紅色；在愈傷組織發(fā)育成為植株的過程中，ScRS的調(diào)節(jié)作用減弱；植株形成后，ScRS的調(diào)節(jié)作用又開始顯現(xiàn)，使得植株在不同階段表現(xiàn)出顏色的差異，其機(jī)理有待深入研究。

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