基于流式細胞術的5種鼠尾草基因組C值測定

周翔宇 林峰 徐莉 李衛(wèi)正

摘要：【目的】測定5種鼠尾草植物C值，為鼠尾草屬的基因組學、細胞生物學和種質資源研究提供參考依據?！痉椒ā恳园呋ㄊ笪膊荨⑸钏{鼠尾草、天藍鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草和腺毛鼠尾草的嫩葉為材料，以已知基因組的水稻日本晴為內標，建立適合于鼠尾草基因組的流式細胞術C值測定方法。【結果】經解離液篩選，LB01解離液為鼠尾草屬植物的最佳選擇，測定5種鼠尾草和對照水稻的變異系數（CV）均小于5.0%；細胞懸浮液在加入碘化丙啶（PI）染色5 min左右即可上機檢測。斑花鼠尾草、深藍鼠尾草、天藍鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草和腺毛鼠尾草的1C值分別為0.555、1.170、1.515、1.031和0.884 pg，存在顯著差異（P<0.05）。【結論】測定的5種鼠尾草C值可豐富鼠尾草屬植物的C值庫；基于流式細胞術建立的鼠尾草屬植物C值測定方法可為該屬其他植物的相關研究提供借鑒。

關鍵詞： 鼠尾草；基因組C值；流式細胞術

中圖分類號： S682.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-0960-06

Measurement of genomic C value of five Salvia species

by flow cytometry

Abstract：【Objective】The genomic C value of five Salvia species were determined in order to provide reference for further study on genomics， cytobiology and germplasm resource of Salvia species. 【Method】Fresh leaves of S. forskaohlei， S. guaranitica， S. uliginosa， S. hierosolymitana and S. viscosa were taken as samples. The known genome of Oryza sativa subsp. japonica‘Nipponbare was set as internal standard. Genomic C value detection by flow cytometry（FCM） was established for Salvia. 【Result】Screened by dissociation liquid， LB01 dissociation liquid was the optimal one for Salvia species. The detected variable coefficient（CV） of five Salvia species and control were smaller than 5.0%. Cell suspension could be tested on equipment after adding propidium iodide（PI） for 5 min staining. The genomic C value of S. forskaohlei， S. guaranitica， S. uliginosa， S. hierosolymitana and S. viscosa were 0.555， 1.170， 1.515， 1.031 and 0.884 pg respectively. And there was significant defference between the C values（P<0.05）. 【Conclusion】The detected C values of five Salvia species can enrich C value database of Salvia. The C value detection method established based on FCM for Salvia species can provide reference for the related research on other Salvia species.

Key words： Salvia； genomic C value； flow cytometry

0 引言

【研究意義】鼠尾草屬（Salvia）隸屬于唇形目（Lamiales）唇形科（Labiatae），是一年生或多年生草本或小灌木，包含約1000種，我國有84種，在全國各地均有分布，以西南地區(qū)分布較多（Li and Hedge，1994）。其中藥用植物43種（不包括變種），是一個重要的藥用植物類群，屬內的許多植物具有極高藥用價值，可用于治療肺結核、感冒、嘔吐、癲癇等多種疾?。ɡ顣F輝等，2011）。鼠尾草屬植物還可用于提取精油，且有一定的觀賞價值，具有良好的開發(fā)利用前景。因此，研究鼠尾草屬的基因組對更好地利用該屬植物具有重要意義。【前人研究進展】生物體不復制的單倍體細胞核（無論倍性水平）所含DNA數量稱為C值（Dole？觩el et al.，2003），一般認為DNA的量1 pg相當于978 Mb（Bennett and Leitch，2011）。C值與植物的種群進化、物種分類及分布、遺傳信息總量等有密切關系，是各種植物的一項重要特征參數。目前測定基因組的方法主要有3種，即孚耳根微顯影（Feulgen microdensitometry）、基因組測序法和流式細胞術（Flow cytometry，FCM），其中流式細胞術制樣簡單、分辨率和準確率高，成為近年來測定基因組含量最常用的方法之一（汪艷等，2015；金亮等，2016）。至今，全世界關于鼠尾草植物C值的報道共有10個，分別為：一串紅（S. splendens）0.85 pg（Olszewska and Osiecka，1983）、長毛鼠尾草（S. broussonetii）0.43 pg（Suda et al.，2003）、加拿利鼠尾草（S. canariensis）0.50 pg（Suda et al.，2005）、短齒鼠尾草（S. brachyodon）0.48 pg、藥用鼠尾草（S. officinalis）0.49 pg（Maksimovi■ et al.，2007）、林下鼠尾草（S. nemorosa）0.55 pg、南歐丹參（S. sclarea）0.58 pg、圓盔鼠尾草（S. ringens）0.61 pg、輪葉鼠尾草（S. verticillata）0.70 pg（Siljak-Yakovlev et al.，2010）和膠質鼠尾草（S. glutinosa）1.07 pg（Temsch et al.，2010）?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內尚無關于鼠尾草基因組C值的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用流式細胞儀對5種鼠尾草的基因組進行測定分析，以期為鼠尾草屬的基因組學、細胞生物學和種質資源研究提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

斑花鼠尾草、深藍鼠尾草、天藍鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草和腺毛鼠尾草均為上海辰山植物園科研苗圃所栽培。對照水稻日本晴（Oryza sativa subsp. japonica ‘Nipponbare）由福建農林大學提供，將種子置于20 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d后備用。鼠尾草和水稻日本晴均采摘剛抽出的幼嫩葉片作為試驗材料。熒光染料、濾膜和鞘液均購自南京博巧生物科技有限公司，Influx流式細胞儀購自美國BD公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 解離液選擇與熒光染料配制 分別采用LB01、Galbraiths（簡寫Gal）、WPB、GPB、Tris-MgCl2、Otto等多種配方進行試驗，找出測定鼠尾草基因組的最佳裂解液配方。將熒光染料碘化丙啶（PI）配成終濃度50 μg/mL，置于4 ℃冰箱保存。

1. 2. 2 細胞核懸液制備與DNA特異性染色 分別選取鼠尾草和水稻的嫩葉約1 g，蒸餾水洗凈表面塵土，濾紙吸干后放入預冷的培養(yǎng)皿中，加入預冷的解離液1.0 mL（LB01），用鋒利的刀片一次性快速切碎，在整個過程中材料需浸沒在解離液中；用0.5 mL冰解離液清洗刀片，將培養(yǎng)皿擺成斜面，使液體和切碎的材料流至皿底半弧側，用槍頭輕吸打液體，放置約1 min；吸取培養(yǎng)皿中的解離液（棄去碎材料）置于1.5 mL EP管，用400目濾膜過濾，并置于冰中孵育5 min。于4 ℃下1100 r/min離心5 min，棄上清液，再加入150.0 μL冰解離液，將待測樣品與標樣等比例混合，在250.0 μL解離液中加入0.5 μL PI儲備液，使終濃度達100 μg/mL；再加入終濃度為10 μg/mL的RNase，避光，在冰箱孵育20 min。上機檢測：低速收集8000～10000個顆粒。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用488 nm藍光激發(fā)，收集670/30通道的熒光并檢測PI發(fā)射的熒光強度。變異系數（CV）控制在5%以內。使用BD Influx自帶軟件FACSTM Sortware 1.0.0.650進行分析。

待測樣本細胞核DNA含量=對照樣本細胞核DNA含量×■。每個樣本進行5次平行試驗，用SPSS 19.0對數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2. 1 解離液的選擇

在細胞核懸液制備過程中，不同解離液對不同植物的解離效果存在明顯差異，故在試驗前需對常用的LB01、Gal、WPB、GPB、Tris-MgCl2、Otto等解離液進行逐一對比，結果發(fā)現GPB解離液對水稻的解離效果最佳，對鼠尾草的解離效果一般，而LB01解離液對二者的解離效果均表現為噪音少、分離得到的峰形最佳。由表1可知，除LB01解離液對5種鼠尾草和水稻均適用外（CV<5.0%），其他解離液則存在不適宜或CV過大的情況，考慮到試驗結果的準確性與可對比性，故最終統(tǒng)一采用LB01解離液，即15 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA-Na2、0.5 mmol/L四鹽酸精胺、80 mmol/L KCl、20 mmol/L NaCl、0.1%（v/v）TritonX-100、pH 7.0～8.0。

2. 2 基因組大小的測定結果

以水稻日本晴為內標，分別測定鼠尾草懸浮液、水稻懸浮液及兩者混合液，測試結果如圖1～圖7所示。在上機檢測時，先以日本晴與各鼠尾草單獨上機檢測，初步確定對照與待測樣本的熒光強度范圍。熒光強度表現為流式細胞術檢測圖種峰的位置，如圖1所示，水稻日本晴的熒光強度在12000附近，在同一檢測模板下，斑花鼠尾草的熒光強度在18000附近（圖2）。說明在下一步混合樣品流式細胞術檢測中，機器設置條件一致的情況下，水稻日本晴的峰將出現在檢測圖的左側，而樣品在檢測圖的右側。在圖7中，左側的P1峰代表水稻日本晴的熒光強度，右側的P2（A-E）峰分別代表樣品：斑花鼠尾草、深藍鼠尾草、天藍鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草、腺毛鼠尾草。

水稻日本晴2C DNA含量為0.795 pg（Sasaki and Burr，2000）。5種鼠尾草的1C值見表2，其中以天藍鼠尾草的1C值最高（1.515 pg），其次是深藍鼠尾草（1.170 pg），最低的是斑花鼠尾草（0.555 pg），5種鼠尾草的1C值間存在顯著差異（P<0.05）。

3 討論

早在20世紀初，鼠尾草屬植物的觀賞和藥用價值已得到廣泛關注，從134個物種中分離獲得773種次生代謝化合物，具有巨大的應用前景（Wu et al.，2012）。目前，國內尚無關于鼠尾草基因組C值的研究報道。本研究采用已知基因組大小的水稻日本晴為內標，結果顯示，水稻日本晴與5種鼠尾草樣品的測定峰區(qū)分度良好，DNA含量CV均控制在5.0%以內，試驗結果穩(wěn)定、可靠。此外，CV只能在線性標尺模式下計算，對于在數標尺模式下的測定則無意義（Dole？觩el et al.，2003）。因此，本研究采用的是線性標尺進行測定。

植物樣品檢測過程中，解離液、材料選擇和染色時間是關鍵（Dole？觩el et al.，2003）。在解離液選擇方面，水稻對解離液要求不高，解離液LB01、Gal、WPB、GPB、Tris-MgCl2和Otto均能檢測出良好的峰形，其中以GPB解離液的效果最佳；鼠尾草由于葉片內富含揮發(fā)油類、二萜類和酚酸類等成分，碎片較多，僅LB01解離液的解離效果最佳，故最終選擇標樣與待測樣本均適宜的LB01解離液進行前處理。在供試葉片方面，水稻采用種子萌發(fā)后、在培養(yǎng)箱培育10 d的嫩葉，鼠尾草均采用新鮮的嫩葉，使用的葉面積不超過1 cm×1 cm，以減少碎片。懸浮液在加入PI后避光染色5～10 min再進行流式檢測。

Greilhuber等（2005）提出了“1C值”的概念：1C值代表體細胞DNA含量（2C）的一半。本研究所用的內標水稻日本晴基因組大小為389 Mb，根據公式計算得到斑花鼠尾草、深藍鼠尾草、天藍鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草及腺毛鼠尾草的1C含量分別為0.555、1.170、1.515、1.031和0.884 pg，與國外報道的同屬10種植物C值范圍（0.43～1.07 pg）相近（Olszewska and Osiecka，1983；Suda et al.，2003，2005；Maksimovi■ et al.，2007；Siljak- Yakovlev et al.，2010；Temsch et al.，2010）。方差分析結果表明，5種鼠尾草基因組C值存在顯著差異；這種差異較普遍，甚至在種內也存在差異（Ramsey and Ellis，1996）。基因組C值既有種的特征，又具有生態(tài)適應上的意義。已有研究表明，C值與被子植物中的多樣性、物種滅絕風險性等均有一定關系（Bancheva and Greilhuber，2006）。全世界有1000多種鼠尾草植物，但迄今為止僅有10種鼠尾草植物基因組C值被測定，本研究結果可為加快該屬植物的C值測定提供借鑒。

4 結論

測定的5種鼠尾草C值可豐富鼠尾草屬植物的C值庫；基于流式細胞術建立的鼠尾草屬植物C值測定方法可為該屬其他植物的相關研究提供借鑒。

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（責任編輯 羅 麗）