不同種類(lèi)酒炮炙對(duì)牛膝飲片指紋圖譜的影響

吳國(guó)學(xué) 張振凌

摘要 目的：比較牛膝生品、蒸餾水炙品及不同乙醇濃度酒炙品指紋圖譜差異，研究不同乙醇濃度酒炮炙對(duì)牛膝飲片的影響。方法：采用HPLC，以島津VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)243 nm，進(jìn)樣量15 μL，采集90 min。結(jié)果：牛膝各酒炙品大部分峰面積較生品的要稍高，蒸餾水炙品的較生品稍低，但不是很明顯。結(jié)論：酒炙有利于本實(shí)驗(yàn)建立指紋圖譜中的牛膝大部分有效成分的溶出，高濃度乙醇炙品在有效成分溶出方面優(yōu)于低濃度乙醇炙品。

關(guān)鍵詞 牛膝；指紋圖譜；酒炙；HPLC；蛻皮甾酮；不同濃度乙醇

Abstract Objective：To compare the fingerprints among Medicinal Cyathula Root raw products， distilled by solid water and different concentrations of ethanol， so as to stud the effects of Medicinal Cyathula Root products processed by different concentration of ethanol. Methods：By using HPLC method， taking the SHIMADZU VP-ODS （4.6×250 mm， μm） as the chromatographic column， acetonitrile-water as mobile phase gradient elution， flow rate 0.8 mL/min， column temperature 25 ℃，detection wavelength 243 nm， sample volume 15 μL， acquisition for 90 min. Results：Most of the peak area of Medicinal Cyathula Root that processed by ethanol were slightly higher than raw products； raw products were lower than the distilled water products， but not very obviously. Conclusion：In this experiment， Medicinal Cyathula Root processed by ethanol is conducive to the dissolution of most active ingredient， high concentration ethanol processed product is better than the low concentration ethanol in the terms of the active ingredients dissolution.

Key Words Medicinal Cyathula Root； Fingerprints； Ethanol processing； HPLC； Ecdysterone； Different concentrations of ethanol

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.058

牛膝系莧科植物牛膝（Achyrabthes bidentate BL.）的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品。牛膝的主產(chǎn)地“河南溫縣、武陟、博愛(ài)、沁陽(yáng)”舊稱(chēng)懷慶府，故又稱(chēng)懷牛膝，并為享有盛譽(yù)的“四大懷藥”之一。牛膝所含的化學(xué)成分比較多，主要為齊墩果酸型三萜皂苷類(lèi)化合物、甾酮類(lèi)化合物、多糖類(lèi)化合物等化合物，另外還含有有機(jī)酸、生物堿、黃酮、環(huán)二肽、甾醇等[1]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法比較不同輔料用酒炙牛膝及其生品飲片指紋圖譜的差異，判斷牛膝炮炙前后化學(xué)成分在種類(lèi)和數(shù)量上的改變，初步評(píng)價(jià)牛膝炮炙作用，為牛膝炮制作用機(jī)制提供初步數(shù)據(jù)，并且對(duì)控制牛膝飲片質(zhì)量，篩選炮炙輔料用酒提供初步依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜分析儀島津LC-20AT，SPD-20A檢測(cè)器，Chromato-Solution Light色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DV型，昆山市超聲儀器有限公司）。十萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 試藥 藥材采購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張振凌教授鑒定為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentata BL.）的干燥根。其中牛膝生品、黃酒（16.5%）炙品、黃酒（16%）炙品、黃酒（22%）炙品、白酒炙品、蒸餾水炙品飲片均為按文獻(xiàn)[2]中1.1項(xiàng)下的方法制備的樣品，依將該批樣品編號(hào)為樣品“1，2，3，4，5，6”，即牛膝生品為1號(hào)、黃酒（16.5%）炙品為2號(hào)、黃酒（16%）炙品為3號(hào)、黃酒（22%）炙品為4號(hào)、白酒（56%）炙品為5號(hào)、蒸餾水炙品為6號(hào)。對(duì)照品：蛻皮甾酮（β-ecdysone）（批號(hào)：20070226）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，純度>98%。

1.3 試劑 甲醇（天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，批號(hào)：20080320，分析純），甲醇（天津市四友精密化學(xué)品有限公司，批號(hào)：080520，色譜純），乙腈（美國(guó)Tedia公司，批號(hào)：08045020，色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：島津VP-ODS（4.6×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈：水；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：243 nm；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫：0.01～10 min：98-95A，10～20 min：95-95A，20～35 min：95-81A，35～50 min：81-81A，50～65 min：81-65A，65～80 min：65-58A；進(jìn)樣量15 μL；采集90 min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蛻皮甾酮對(duì)照品5.03 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升含蛻皮甾酮0.503 mg）。

2.3 供試品溶液的制備 取牛膝各樣品粉末（過(guò)20目篩）約5 g，精密稱(chēng)定，加入50 mL甲醇超聲（500 w，40 kw）30 min，靜置后過(guò)濾，濾渣再加入甲醇50 mL，重復(fù)上面操作，過(guò)濾，并以少量甲醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，合并過(guò)濾液，置水浴上揮發(fā)至干，殘?jiān)由V甲醇定溶至10 mL容量瓶中，用0.45 μm為微孔濾膜過(guò)濾既得供試品溶液。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品[牛膝黃酒（22%）炙品]溶液15 μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算各樣品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.68%，相對(duì)峰面積的RSD≤1.91%，表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品試液[牛膝黃酒（22%）炙品]分別于制備后0、6、12、18、24、48 h在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣15 μL，計(jì)算各樣品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.73%，相對(duì)峰面積的RSD≤1.66%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品[牛膝黃酒（22%）炙品]5份，每份約5.0 g，精密稱(chēng)定，照2.3方法制成五份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，依次進(jìn)樣15 μL，計(jì)算各樣品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.39%，相對(duì)峰面積的RSD≤1.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 指紋圖譜的建立 分別將按2.3項(xiàng)下方法把牛膝生品、黃酒（16.5%）炙品、黃酒（16%）炙品、黃酒（22%）炙品、白酒（56%）炙品及蒸餾水炙品飲片制備成供試品溶液，并在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣分析，按2.2項(xiàng)下制得蛻皮甾酮對(duì)照品同樣進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

2.8 共有峰的標(biāo)定 分析牛膝各樣品指紋圖譜，確定共有峰10個(gè)。其中5號(hào)峰為蛻皮甾酮的峰。見(jiàn)圖3。該峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高且比較穩(wěn)定，將其作為參比峰，計(jì)算其他各峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.9 相似度計(jì)算 利用Chromafinger 2005 Beta 0.1色譜軟件對(duì)牛膝生品、蒸餾水炙品及各酒炙品的指紋圖譜進(jìn)行處理，得到各樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果。見(jiàn)表3。結(jié)果表明牛膝各樣品相似度>0.90，各樣品比較相似。用該軟件處理得出牛膝生品與各酒炙品飲片鏡像圖譜。見(jiàn)圖4（各對(duì)圖譜相似度均較高，僅選一對(duì)圖譜顯示），結(jié)果同樣顯示牛膝生品與各酒炙品飲片指紋圖譜相似較高。

從2.8項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，除4號(hào)、9號(hào)、3號(hào)（僅16%黃酒炙品）共有峰外牛膝各酒炙品其他共有峰相應(yīng)的峰面積較生品的要稍高，除2號(hào)、9號(hào)共有峰外牛膝蒸餾水炙品的其他共有峰的峰面積較生品的要稍低，并且整體上各樣品大部分共有峰相應(yīng)的峰面積隨炮炙用輔料用酒的濃度的提高而增高，但不是特別明顯。另外從本實(shí)驗(yàn)的整個(gè)圖譜上來(lái)看，牛膝各樣品指紋圖譜相似度較高，在峰的數(shù)目和保留時(shí)間方面沒(méi)有太大改變。

3 討論

從圖譜分析發(fā)現(xiàn)，牛膝各樣品指紋圖譜沒(méi)有太大區(qū)別，只是在含量上稍有不同。生品與炙品，炙品之間的差別都不是太明顯，在峰的數(shù)目與保留時(shí)間方面沒(méi)有太大改變，經(jīng)相似度計(jì)算表明，牛膝各飲片的相似性較好，相關(guān)系數(shù)和夾角余弦都>0.9，說(shuō)明牛膝生品飲片與酒炙品飲片、酒炙品飲片之間無(wú)明顯差異，牛膝、酒牛膝飲片在本實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜上沒(méi)有太大的改變。有文獻(xiàn)報(bào)道牛膝生品飲片與各炮炙品飲片在蛻皮甾酮含量上的差別[2]，而通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得到的各樣品指紋圖譜蛻皮甾酮的峰面積基本與文獻(xiàn)報(bào)道的規(guī)律一致，即白酒（56%）炙品>黃酒（22%）炙品>黃酒（16%）炙品>黃酒（16.5%）炙品>生品>蒸餾水炙品，也就是蛻皮甾酮的含量隨著炮炙用酒乙醇濃度的提高而增高。

牛膝生品大部分共有峰的峰面積要比相應(yīng)保留時(shí)間上炙品的要稍小，但不是很明顯，這可為牛膝酒炙后增強(qiáng)活血化瘀作用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)上的數(shù)據(jù)；另外酒味甘、辛，性大熱，酒炙過(guò)程中酒“能升能散、宣行藥勢(shì)”的藥性[3]可為酒炙能增加藥物溶出作用提供理論上的依據(jù)。牛膝蒸餾水炙品大部分共有峰的峰面積要比相應(yīng)保留時(shí)間上生品的要小，這可能是牛膝生品飲片在與蒸餾水加熱的過(guò)程中，藥材中蛋白質(zhì)的凝固以及淀粉粒的糊化影響了有效成分的溶出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大部分共有峰相應(yīng)的峰面積隨著炮炙輔料中乙醇含量的升高而增加，這說(shuō)明高乙醇濃度輔料用酒炮炙有利于本實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜中各成分的溶出，這為牛膝飲片炮炙輔料用酒的篩選提供一定的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm，這個(gè)波長(zhǎng)為蛻皮甾酮的檢測(cè)波長(zhǎng)，因而在控制蛻皮甾酮的方面有著一定的作用。另外牛膝中還含有三萜皂苷、生物堿、多糖、黃酮、有機(jī)酸等成分，其中齊墩果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm左右[4]；而甜菜堿在低紫外區(qū)195 nm才有吸收[5]，且其極性較大，需用正相柱，因而用該實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)條件不能同時(shí)監(jiān)控牛膝的各個(gè)成分，牛膝指紋圖譜有待進(jìn)一步研究。鑒于蒸發(fā)光檢測(cè)器幾乎可以檢測(cè)所有的物質(zhì)，因而在以后研究中可以考慮用HPLC-蒸發(fā)光散器來(lái)建立牛膝的指紋圖譜，該方法可為闡明牛膝酒炙炮制機(jī)制提供試驗(yàn)參數(shù)；另外正相柱可更直觀的顯示牛膝酒炙前后水溶性成分的改變，因而今后的研究同時(shí)可以考慮建立牛膝正相柱的指紋圖譜，這也可為牛膝酒炙的炮制機(jī)制提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)為牛膝、酒牛膝飲片的質(zhì)量監(jiān)控提供參數(shù)。

參考文獻(xiàn)

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（2017-02-08收稿 責(zé)任編輯：張文婷）