山羊體細(xì)胞重編程過(guò)程中慢病毒對(duì)細(xì)胞的毒性作用

宋輝 李卉 王鋒

摘要[目的] 檢測(cè)慢病毒對(duì)普通山羊、克隆奶山羊和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊的作用。[方法] 采用慢病毒作為載體感染普通山羊、克隆奶山羊（♂12001）和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊（♀12003）體細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)慢病毒對(duì)3種山羊細(xì)胞的毒性作用。[結(jié)果] 感染后的3種體細(xì)胞在感染前3 d，細(xì)胞大量凋亡，4～7 d篩選出的細(xì)胞大量增殖。未經(jīng)慢病毒感染的3種細(xì)胞接種2 d后數(shù)量開(kāi)始明顯增加，第2～5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5～7天進(jìn)入平臺(tái)期，呈現(xiàn)典型的“潛伏期-對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期-停滯期”生長(zhǎng)模式。[結(jié)論] 慢病毒對(duì)細(xì)胞有毒性作用，會(huì)引起細(xì)胞大量凋亡。

關(guān)鍵詞慢病毒；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；凋亡

中圖分類號(hào)S858.27文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）35-0082-03

Abstract[Objective]The aim is to detect the role of lentivirus in normal goats， cloned dairy goats and transgenic cloned dairy goats. [Methods] Using lentiviral vector infection as a common goat， cloned goats （male 12001） and transgenic cloned goats （female 12003） somatic cells by cell growth curve， toxic effect of lentivirus on three kinds of goat cell was detected . [Result]After infection， the three somatic cells were infected with 3 days， and the apoptosis of cells was large. The cells screened from 4 d to 7d proliferated greatly. Without the lentivirus infected three cells significantly increased after inoculation with 2 d， cells entered the logarithmic growth phase from 2rd day to 5th day， then entered the platform phase from 5th day to 7th day， it was a typical “l(fā)atencylogarithmic growth period - the period of stagnation” growth mode. [Conclusion] Lentivirus plays a toxic role in cells and can cause apoptosis in a large number of cells.

Key wordsLentivirus；Cell growth curve；Apoptosis

目前，常用的病毒載體主要包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒3類[1]。腺病毒具有宿主范圍廣、致病性低、不會(huì)整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)，但是轉(zhuǎn)染效率低。逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率比腺病毒高，但是只能轉(zhuǎn)染分裂期的細(xì)胞。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，不但可以轉(zhuǎn)染分裂期的細(xì)胞，還可以轉(zhuǎn)染非分裂期的細(xì)胞，大大提高了轉(zhuǎn)染效率，但是不論是逆轉(zhuǎn)錄病毒還是慢病毒都面臨著一個(gè)問(wèn)題：宿主細(xì)胞毒性[1-3]。

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（ Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）是由分化的體細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)入特定基因誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程成為多能干細(xì)胞，避免了胚胎干細(xì)胞面臨的倫理困境和免疫排斥等問(wèn)題，給干細(xì)胞研究領(lǐng)域帶來(lái)革命性的變化[4-6]。在試驗(yàn)過(guò)程中，為了獲得高轉(zhuǎn)染效率，很多試驗(yàn)人員選擇慢病毒載體，但是慢病毒對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用鮮有報(bào)道。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)增長(zhǎng)數(shù)值的常用方法，也是檢測(cè)細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。因此，取地方品種山羊、克隆奶山羊和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊未感染的第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的病毒感染后的細(xì)胞，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，從而檢測(cè)體細(xì)胞重編程過(guò)程中慢病毒對(duì)細(xì)胞的作用。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、雙抗、無(wú)鈣鎂PBS緩沖液、胰蛋白酶、谷氨酰胺、β-巰基乙醇均購(gòu)置于美國(guó)Life公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。將TOP10感受態(tài)細(xì)胞從-80 ℃冰箱取出，在冰上融化。將5 μL高濃度GOF-18質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕晃混勻，冰上放置30 min。42 ℃熱休克90 s，不要搖動(dòng)試管?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2 min。加500 μL無(wú)抗生素的普通LB培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min復(fù)蘇45 min。用無(wú)菌接種棒將200 μL菌液鋪于含抗生素的平板上，37 ℃正置20 min。倒置平板，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，4 ℃保存。

1.2.2質(zhì)粒小量制備提?。ㄔ噭┖谐樘岱ǎ０碠mega質(zhì)粒小提試劑盒操作手冊(cè)抽提質(zhì)粒，步驟如下：取菌液5～10 mL，室溫12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入250 μL Buffer S1，渦旋。加入250 μL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)5～7次。加入350 μL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，室溫靜置2 min。12 000 r/min，離心10 min。吸取700 μL上清液到吸附柱中，11 000 r/min，離心1 min。加500 μL Buffer HD，離心同上。加700 μL Wash Buffer，離心同上。重復(fù)上面的步驟一次。倒去上清液，空離1次，12 500 r/min，離心3 min。取出柱子，放到無(wú)菌1.5 mL離心管中，向柱子中央加入65 ℃預(yù)熱的Eluent Buffer 80 μL，室溫靜置2 min，12 500 r/min，離心2 min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度。

1.2.3細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和凍存。將凍存細(xì)胞從液氮罐里取出，投入到37 ℃恒溫水浴鍋中，迅速解凍，接種到培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞匯合到80%以上，用胰酶進(jìn)行消化傳代，多余的細(xì)胞加凍存液放到凍存管里，依次放到4 ℃冰箱里30 min，-20 ℃冰箱1～2 h，-80 ℃冰箱過(guò)夜，最后放到液氮里長(zhǎng)期保存。山羊成纖維細(xì)胞使用F3代細(xì)胞，293FT細(xì)胞解凍后，傳代2～3次，調(diào)整好細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行病毒包裝。

1.2.4慢病毒包裝。將293FT細(xì)胞傳至T75的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后換為無(wú)抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%。 準(zhǔn)備5個(gè)10 mL離心管，前4個(gè)加1.5 mL OPTI-MEM，最后一個(gè)加6 mL，依次編號(hào)①、②、③、④、⑤。將脂質(zhì)體LIPFACTIN 2000輕輕搖一搖，⑤號(hào)管中先吸出260 μL OPTI-MEM，再加260 μL（65ULX4）脂質(zhì)體，上下倒置混勻。向①、②、③、④號(hào)管中加包裝載體PAPX：8 μg，PMD：4 μg，并且分別加4種因子12 μg，用手指輕叩管底，混勻，室溫放置5 min。將離心管⑤號(hào)管中的溶液分別向①、②、③、④號(hào)管各加1.5 mL，用手指輕叩管底，記時(shí)20 min到4 h。293FT細(xì)胞每個(gè)瓶子上標(biāo)號(hào)，①、②、③、④號(hào)離心管補(bǔ)加到10 mL，將293FT細(xì)胞中的培養(yǎng)液吸出，換成4個(gè)離心管中的溶液。8～11 h后換成體細(xì)胞培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后48 h和72 h分別收集病毒，然后用0.45 μm濾器過(guò)濾后，超低溫離心機(jī)4 000 r/min，4 ℃，離心30 min，進(jìn)行病毒濃縮，分裝后凍于-80 ℃冰箱。

1.2.5包裝病毒質(zhì)量的檢測(cè)。在24孔板的9個(gè)孔中鋪293FT細(xì)胞，編號(hào)①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%的匯合度時(shí)，每個(gè)孔加0.5 mL培養(yǎng)液，在①、②、③、④孔中分別加適量的4種病毒濃縮液：OCT4、SOX2、KLF4和CMYC，在⑤、⑥、⑦、⑧孔中分別加適量的4種病毒原液：OCT4、SOX2、KLF4和CMYC，第⑨個(gè)孔什么都不加。40 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)。

1.2.6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制。用胰酶消化羊耳成纖維細(xì)胞，用含有病毒感染液的培養(yǎng)液將細(xì)胞吹成單細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)板上。取地方品種山羊、克隆奶山羊和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊未感染的第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞和對(duì)應(yīng)的病毒感染后的細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，按1×104個(gè)/mL的密度，每孔接種1 mL。接種時(shí)記為0小時(shí)，每隔24 h對(duì)3孔內(nèi)的細(xì)胞密度進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，一共計(jì)數(shù)7 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1病毒質(zhì)量檢測(cè)

病毒感染40 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到293FT細(xì)胞帶有紅色熒光（圖1），說(shuō)明包裝的病毒質(zhì)量很好，而且濃縮病毒感染后的293FT細(xì)胞的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)于病毒原液感染后293FT細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2.2誘導(dǎo)前后細(xì)胞變化特征

3種細(xì)胞接種2 d后數(shù)量明顯增加，第2～5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5～7天進(jìn)入平臺(tái)期，呈現(xiàn)典型的“潛伏期-對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期-停滯期”生長(zhǎng)模式（圖2、3、4）。而感染后的3種體細(xì)胞在感染前3 d，細(xì)胞大量凋亡（圖5A）。4～7 d篩選出的細(xì)胞大量增殖（圖5B）。

3結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地批量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因hLF已經(jīng)很好地整合到這些克隆羊的基因組中[7]。取地方品種山羊、克隆奶山羊和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊未感染的第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的病毒感染后的細(xì)胞，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。3種細(xì)胞接種2 d后數(shù)量開(kāi)始明顯增加，第2～5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5～7天進(jìn)入平臺(tái)期，呈現(xiàn)典型的“潛伏期-對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期-停滯期”生長(zhǎng)模式。而感染后的3種體細(xì)胞在感染前3 d，由于病毒的侵染，引起了細(xì)胞免疫應(yīng)答，相關(guān)基因的表達(dá)，外源 dsRNA和多肽引起細(xì)胞凋亡，氧化還原，DNA重置和抗原反應(yīng)。由于病毒侵入引起的這些突出的

生物學(xué)過(guò)程還伴隨著細(xì)胞凋亡，0～4 d細(xì)胞增殖速度加快，但是伴隨有大量的誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程。這個(gè)時(shí)間段的作用可能是使外源轉(zhuǎn)錄因子融入細(xì)胞，并篩選更加強(qiáng)壯的病毒感染后的細(xì)胞，4～7 d篩選出的細(xì)胞大量增殖。

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