王卓淵　林香鳳

摘要 [目的]研究銀杏葉葉綠素的熒光特征及其含量的變化規(guī)律。[方法]以新鮮銀杏葉為材料，采用混合有機溶劑進行萃取，并用分光光度法對銀杏葉葉綠素的含量進行測定，通過比較不同月份銀杏葉葉綠素的含量，得到葉綠素含量的變化規(guī)律，同時研究銀杏葉葉綠素的特征熒光發(fā)射峰和磷光壽命。[結(jié)果]銀杏葉葉綠素有2個特征熒光發(fā)射峰，分別位于691和718 nm處，在2個發(fā)射峰處的磷光壽命分別為8.61和8.21 μs；在不同月份的銀杏葉中，葉綠素含量從大到小依次為7月、4月、11月，但葉綠素a/b比值從大到小依次為4月、11月、7月。[結(jié)論]該研究為銀杏葉葉綠素的進一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞銀杏葉；葉綠素；熒光特征；含量測定；分光光度法

中圖分類號S792.95；R282文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）31-0134-03

Abstract[Objective] The research aimed to study fluorescence characteristics and content variance of chlorophyll in ginkgo leaves.[Method]Fresh ginkgo leaves were used as raw material， chlorophyll was extracted by mixed organic solvent and its content was measured with spectrophotometry.Chlorophyll contents in ginkgo leaves in different months were compared to obtain variance of chlorophyll content， and characteristic fluorescence peaks and phosphorescence lifetimes of chlorophyll were studied.[Result]The chlorophyll of ginkgo leaves had two characteristic fluorescence peaks and they were located at 691 nm and 718 nm， and the phosphorescence lifetimes of chlorophyll of ginkgo leaves were 8.61 and 8.21 μs at two emission peaks respectively. The chlorophyll content in ginkgo leaves in July was the highest，and that in April ranked the second，and that in November was the lowest.However， the order of chlorophyll a/b value in different months was April > November > July.[Conclusion]This study provides guidance for further research of chlorophyll in ginkgo leaves.

Key wordsGinkgo leaves；Chlorophyll；Fluorescence characteristics；Content determination；Spectrophotometry

葉綠素是植物葉片中重要的活性物質(zhì)，在植物生長發(fā)育過程的光合作用中起著關(guān)鍵的作用，直接參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化等過程。植物葉片中葉綠素a、b的含量和葉綠素總含量與葉片凈光合速率有直接關(guān)系[1-2]，葉綠素含量與作物的產(chǎn)量呈正相關(guān)[3-4]，通過選擇高葉綠素含量的作物品種，就可能成為提高作物產(chǎn)量的探索方法。

與葉綠素光合作用密切相關(guān)的是葉綠素?zé)晒庑再|(zhì)，它是植物吸收光能的傳遞、分配和轉(zhuǎn)化的另一種途徑，葉綠素光合作用和葉綠素?zé)晒舛夹枰獾哪芰?。葉綠素的熒光性質(zhì)與葉綠素的含量密切相關(guān)[5]，葉綠素的熒光參數(shù)可以用于表征植物對光能的利用效率[6]。

藥理研究表明，植物葉綠素及其衍生物具有抗菌消炎功能，可用于治療口腔潰瘍[7]；具有抗突變和抗癌等活性[8]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和醫(yī)療中，日益受到人們的重視。

筆者采用混合有機溶劑，萃取了銀杏葉中葉綠素，并利用分光光度法測定銀杏葉中葉綠素的含量，分析了不同月份銀杏葉中葉綠素含量的變化規(guī)律，同時研究了銀杏葉中葉綠素的特征熒光發(fā)射峰和磷光壽命，為銀杏葉葉綠素的進一步研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。銀杏葉采自桂林市育才路廣西師范大學(xué)校園內(nèi)，生長期為3年以上，采樣時間為4—11月，所采集的銀杏葉是當(dāng)時銀杏樹下部相對最成熟的葉片。

1.1.2主要儀器。法國Jobin Yvon Fluorolog-3時間分辨熒光光譜儀，上海佑科721可見分光光度計。

1.1.3主要試劑。所用丙酮和無水乙醇均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

1.2方法

1.2.1葉綠素的提取及含量測定方法。將采集的新鮮銀杏葉洗凈，用濾紙吸干，去掉葉梗，剪碎。采用萬分之一天平，準(zhǔn)確稱取樣品0.100 0 g左右，放入比色管中，加入10 mL體積比為1∶2的丙酮與無水乙醇混合溶劑，在室溫下避光浸泡24 h，將提取溶液過濾。準(zhǔn)確移取濾液，置于光徑為1.0 cm的比色皿中，以丙酮與無水乙醇混合溶劑為參比，在可見分光光度計中測定吸光度，再根據(jù)提取溶液在645和663 nm處的吸光度，由Amon公式[9]計算葉綠素a和葉綠素b的含量：

Ca（mg/g）=（12.7×A663-2.69×A645）×V/（1 000W）

Cb（mg/g）=（22.7×A645-4.68×A663）×V/（1 000W）

C總（mg/g）=Ca+Cb

式中，A645和A663分別為波長在645和663 nm處的吸光度值，Ca和Cb分別為葉綠素a和葉綠素b的含量，C總為葉綠素的總含量，V為提取溶液的體積，W為葉片樣品的質(zhì)量。

1.2.2

葉綠素?zé)晒夤庾V測定方法。將銀杏葉葉綠素提取溶液置于熒光比色皿中，采用時間分辨熒光光譜儀，測定提取溶液中葉綠素的熒光激發(fā)譜，再以熒光激發(fā)譜中各個激發(fā)峰所處波長為激發(fā)波長，測定葉綠素的熒光發(fā)射譜。

1.2.3

葉綠素磷光壽命測定方法。采用時間分辨熒光光譜儀，按照熒光發(fā)射峰所對應(yīng)的激發(fā)波長和發(fā)射波長，設(shè)置激發(fā)單色儀的波長和發(fā)射單色儀的波長，測定提取溶液中銀杏葉葉綠素的磷光衰減曲線，再以單指數(shù)函數(shù)進行擬合計算，求得葉綠素的磷光壽命。

2結(jié)果與分析

2.1銀杏葉葉綠素的吸收光譜特征

采用Origin 7.0軟件，處理銀杏葉葉綠素提取溶液的吸光度數(shù)據(jù)，得到銀杏葉葉綠素的吸收光譜，如圖1所示。從圖1可看出，在藍(lán)紫光區(qū)的400～460 nm和紅光光區(qū)的640～680 nm，銀杏葉葉綠素有2個強吸收譜帶，吸收峰分別位于431和661 nm處，與桑葉葉綠素的吸收光譜[10]非常相似。

2.2不同月份銀杏葉中葉綠素含量的變化

銀杏是落葉植物，在不同的月份，因溫度和所受光照強度不同，銀杏葉片的發(fā)育成熟程度不同，其中葉綠素的含量也有所不同，測定結(jié)果見表1。從表1可看到，7月份銀杏葉中葉綠素的含量最高，但葉綠素a/b的比值最低，為2.03；4月份銀杏葉中葉綠素的含量稍低，葉綠素a/b的比值最高，為2.32；11月份銀杏葉中葉綠素的含量最低，葉綠素a/b的比值居中，為2.15。顯然，與4月份的銀杏葉相比，7月份的銀杏葉發(fā)育更加成熟完善，具有較高的葉綠素含量和較低的葉綠素a/b比值，這是曾經(jīng)引起人們關(guān)注的問題[2]，主要是由于葉綠素b的含量很低，它的微小變化更容易調(diào)節(jié)葉綠素a與葉綠素b的比例關(guān)系，在改變?nèi)~綠素a/b比值時起著關(guān)鍵的作用。

2.3銀杏葉葉綠素的熒光光譜

從圖2可看出，在可見光區(qū)有2個激發(fā)譜帶與圖1的吸收譜帶相對應(yīng)。銀杏葉葉綠素的特征熒光激發(fā)峰位于524、544和687 nm處，以各個激發(fā)峰所處波長為激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射譜，所得的熒光發(fā)射譜均有2個特征熒光發(fā)射峰，而且發(fā)射峰的位置相同，如圖3所示。

由圖3可知，銀杏葉葉綠素的特征熒光發(fā)射峰在紅光波段位于691 nm處，在遠(yuǎn)紅光波段位于718 nm處。銀杏葉葉綠素的熒光發(fā)射譜與桑葉葉綠素的熒光發(fā)射譜[10]很相似，是典型的高等植物葉綠素的熒光發(fā)射譜。

2.4銀杏葉葉綠素的磷光壽命

在銀杏葉葉綠素的691和718 nm 2個發(fā)射峰處，分別測得銀杏葉葉綠素的磷光衰減曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），2條衰減曲線相互交錯，幾乎重疊。采用單指數(shù)函數(shù)進行擬合，當(dāng)擬合參數(shù)R2為0.902 2時，求得銀杏葉葉綠素在691 nm峰處的磷光壽命為8.61 μs；當(dāng)R2為0.913 2時，得到銀杏葉葉綠素在718 nm峰處的磷光壽命為8.21 μs，二者非常相近。

3結(jié)論與討論

對葉綠素含量進行準(zhǔn)確測定是植物生理學(xué)研究的重要內(nèi)容，葉綠素a含量、葉綠素b含量及葉綠素總含量的多少直接影響凈光合速率的大小，葉綠素a/b比值也能在一定程度上反映光合速率，作物具有較高的光合速率，就可能有較高的產(chǎn)量，葉綠素的含量與作物的產(chǎn)量呈正相關(guān)。另外，葉綠素的熒光性質(zhì)與葉綠素含量密切相關(guān)，葉綠素的熒光參數(shù)反映植物光合機構(gòu)內(nèi)部變化和生理調(diào)節(jié)能力，可用于表征植物對光能的利用效率。

該研究結(jié)果表明，以丙酮和無水乙醇混合溶劑，可成功提取銀杏葉葉綠素，采用分光光度法測定和Amon公式計算，得到銀杏葉中葉綠素a和葉綠素b的含量。在不同月份中，7月份銀杏葉中葉綠素的含量最高，但葉綠素a/b的比值卻最低，而4月份銀杏葉中葉綠素的含量較低和葉綠素a/b的比值最高，這可能與銀杏葉發(fā)育成熟程度的變化有關(guān)。銀杏葉葉綠素具有2個特征熒光發(fā)射峰，分別位于691和718 nm處，它是良好的紅色熒光材料。銀杏葉葉綠素在2個發(fā)射峰處的磷光壽命分別為8.61和8.21 μs，它具有良好的磷光性質(zhì)。

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