羅劍飄 譚嘉娜 楊俊賢 官錦燕 黃海英 羅青文 謝靜 陳月桂

摘要：【目的】分析不同氮、磷和鉀營養(yǎng)水平對鐵皮石斛組培苗生長的影響，為其組培快繁及田間施肥管理提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳澡F皮石斛壯苗階段的組培苗為材料，采用L9（33）正交設(shè)計研究培養(yǎng)基中氮、磷和鉀三大元素含量配比對其株高、葉片數(shù)、新增根數(shù)、分蘗數(shù)和相對增重率的影響，并對其中影響顯著的鉀元素進行單因素多水平影響試驗?！窘Y(jié)果】極差分析結(jié)果顯示，氮對鐵皮石斛組培苗株高和分蘗數(shù)影響最大，鉀對新增根數(shù)和相對增重率影響最大，磷對葉片數(shù)影響最大。方差分析結(jié)果表明，氮、磷和鉀對鐵皮石斛組培苗的葉片數(shù)及新增根數(shù)均無顯著影響（P>0.05）；氮對株高和分蘗數(shù)影響明顯，以N2水平（氮30.0 mmol/L）的株高最高，N3水平（氮60.0 mmol/L）的分蘗數(shù)最多；鉀對鐵皮石斛組培苗相對增重率影響顯著（P<0.05），以K3水平（鉀20.0 mmol/L）的相對增重率最高。鉀離子含量試驗結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著鉀離子濃度的增加，組培苗的相對增重率呈上升趨勢，以處理k5（鉀40.0 mmol/L）組培苗的相對增重率最高?！窘Y(jié)論】在鐵皮石斛組培苗增殖階段，培養(yǎng)基中最佳氮、磷和鉀含量配比分別為60.0、1.2和20.0 mmol/L，在壯苗階段，培養(yǎng)基中最佳氮、磷和鉀含量配比分別為30.0、1.2和20.0 mmol/L。在鐵皮石斛組培苗生產(chǎn)過程中，可在此含量配比基礎(chǔ)上添加激素及其他有機或無機營養(yǎng)組分，以促進組培苗生長。

關(guān)鍵詞： 鐵皮石斛；培養(yǎng)基；氮；磷；鉀；正交試驗；組織培養(yǎng)

中圖分類號： S682.31 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）03-0481-07

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生草本植物，分布于安徽、浙江、福建、廣西、四川及云南等地海拔800～1500 m山地覆有苔蘚或腐殖質(zhì)的巖石或樹干上（李娟等，2011），富含多糖、生物堿、氨基酸及礦物質(zhì)等多種有益于人體健康的藥用活性成分，具有益胃生津、滋陰清熱、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等功效（中華人民共和國藥典委員會，2010；蔡光先等，2011；李娟等，2011；譚丹等，2016），為我國特有的傳統(tǒng)名貴中藥材。目前鐵皮石斛野生資源已瀕臨絕跡（Chen et al.，2012），被列為國家重點保護藥用植物、中國珍稀瀕危Ⅱ級保護植物和世界二類保護植物。因此，通過組織培養(yǎng)快速繁育鐵皮石斛種苗對其資源保護及可持續(xù)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，國內(nèi)外通過組培方式對鐵皮石斛進行保護和生產(chǎn)取得了較大進展，同時也遇到一些技術(shù)瓶頸，如培養(yǎng)基中添加香蕉、土豆和椰汁等有機物有助于提高鐵皮石斛種苗的分化率或促進種苗生長（蔣林等，2003；周俊輝等，2005；宋順等，2013），但存在培養(yǎng)基配制繁瑣、生產(chǎn)成本高等問題；鐵皮石斛所采用的基本培養(yǎng)基多為前人常用的固定配方MS、3/4MS、1/2MS、B5和N6等（周俊輝等，2005；Lin et al.，2011；吳菊等，2014；Fu et al.，2014；Teixeira et al.，2015），缺乏對其組培階段大量元素需求的精細化研究數(shù)據(jù)；采用不同種類和濃度的激素有助于提高鐵皮石斛不定芽和叢生芽分化率，但隨著激素濃度的增加，鐵皮石斛生長受到抑制，并容易出現(xiàn)卷葉、矮化、無根或少根等畸變現(xiàn)象，甚至枯萎死亡（郭洪波等，2007；李瑩等，2012）。羅昌國等（2010）、Wang等（2011）、黃科等（2014）、鄺雷等（2014）、Jungers等（2015）研究表明，適宜的氮、磷和鉀營養(yǎng)配比可提高苗木質(zhì)量、縮短苗木生產(chǎn)周期，有利于農(nóng)作物生長、產(chǎn)量和品質(zhì)提高?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對培養(yǎng)基中氮、磷和鉀營養(yǎng)配比對鐵皮石斛組培苗生長影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以鐵皮石斛組培幼苗為材料，采用正交設(shè)計研究不同氮、磷和鉀用量及配比對其組培苗生長的影響，為完善其組培快繁技術(shù)及提高田間施肥管理水平提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料及培養(yǎng)條件

供試鐵皮石斛組培苗由廣東省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心提供。選取處于壯苗階段、生長良好、長勢均一、高約2 cm的鐵皮石斛幼苗，切割成單株接種。

培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，光照強度1500～2000 lx。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 氮、磷和鉀含量配比正交試驗 參照王春等（2007）的方法，以1/2MS培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基中大量元素減半，其他成分不變。下同）為基礎(chǔ)，以氮、磷和鉀濃度為變量，設(shè)3因素3水平，采用L9（33）正交設(shè)計（表1），按照表2的配方配制大量元素溶液。其中氮水平30.0 mmol/L、磷水平0.6 mmol/L及鉀水平10.0 mmol/L分別與1/2MS培養(yǎng)基中的氮、磷和鉀元素含量接近。每瓶培養(yǎng)基中接種觀察5株鐵皮石斛組培苗，4次重復(fù)，接種90 d后測定各處理組合植株的株高、葉片數(shù)、新增根數(shù)、分蘗數(shù)及相對增重率。

相對增重率（%）=（每瓶組培苗培養(yǎng)后的重量-每瓶組培苗接種前的重量）/每瓶組培苗接種前的重量×100

平均每株分蘗數(shù)=每瓶培養(yǎng)基中全部植株萌發(fā)新芽數(shù)之和/每瓶培養(yǎng)基接種的植株數(shù)

1. 2. 2 不同鉀離子含量響應(yīng)試驗 在1.2.1試驗中發(fā)現(xiàn)因素鉀對鐵皮石斛組培苗相對增重率的影響突出，因此進一步設(shè)計單因素試驗探討不同鉀離子濃度對鐵皮石斛組培苗生長的影響。與1.2.1試驗相似，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以鉀離子濃度為變量，設(shè)k0（0 mmol/L）、k1（5.0 mmol/L）、k2（10.0 mmol/L）、k3（20.0 mmol/L）、k4（30.0 mmol/L）和k5（40.0 mmol/L）6個梯度處理，按照表3的配方配制大量元素溶液。其中k2處理的鉀離子濃度接近1/2MS培養(yǎng)基。每處理接種30株，接種80 d后測定植株的相對增重率。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進行方差分析，以Duncans進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同濃度氮、磷和鉀含量配比培養(yǎng)基對鐵皮石斛組培苗生長的影響

經(jīng)過90 d培養(yǎng)，各處理鐵皮石斛組培苗葉片增厚，葉色變深，植株有所增高，底部萌發(fā)新芽，各測量指標(biāo)見表4。

極差分析結(jié)果（表5）表明，氮元素對株高和平均株分蘗數(shù)的影響最大，R（0.30和0.56）均明顯大于磷和鉀元素；鉀元素對新增平均根數(shù)和相對增重率的影響最大，R（0.25和65.49）明顯大于氮和磷元素；磷元素對新增葉片數(shù)的影響最大，R（0.25）明顯大于氮和鉀元素。方差分析結(jié)果（表6）表明，氮、磷和鉀元素對鐵皮石斛組培苗的株高、葉片數(shù)、平均新增根數(shù)和平均株分蘗數(shù)均無顯著影響（P>0.05，下同），但氮元素對株高和平均株分蘗數(shù)的影響明顯大于磷和鉀元素的影響；鉀元素對鐵皮石斛組培苗相對增重率影響顯著（P<0.05，下同）。結(jié)合表4中氮元素的正交式試驗結(jié)果分析，以N2和N3水平（分別為30.0和60.0 mmol/L）對株高和株分蘗數(shù)的影響大于N1水平。對鉀元素的多重比較分析結(jié)果（表7）顯示，K3水平與K1水平、K2水平差異顯著，K1水平與K2水平差異不顯著，以K3水平（鉀20.0 mmol/L）的相對增重率最高。

綜合考慮極差分析及方差分析結(jié)果，可優(yōu)選出最佳氮、磷和鉀含量配比組合。對氮元素而言，極差分析及方差分析結(jié)果均表明，其是影響鐵皮石斛組培苗株高和分蘗數(shù)的首要因素，但對葉片數(shù)、平均根數(shù)和平均株分蘗數(shù)影響不明顯（可忽略氮元素對這3個指標(biāo)的影響）；當(dāng)取N2水平（氮30.0 mmol/L）時，鐵皮石斛組培苗的株高最高，取N3水平（氮60.0 mmol/L）時，分蘗數(shù)最多。因此，可考慮在組培苗增殖階段選用N3水平（氮60.0 mmol/L）、在組培苗壯苗階段選用N2水平（氮30.0 mmol/L）為培養(yǎng)基中氮含量配比。對鉀元素而言，極差分析及方差分析結(jié)果均表明，其是影響鐵皮石斛組培苗相對增重率的首要因素，極差分析結(jié)果顯示鉀是平均新增根數(shù)的最大影響因素，但其對株高、葉片數(shù)及相對增重率的影響不明顯（可忽略鉀元素對這3個指標(biāo)的影響），當(dāng)選取K3水平（鉀20.0 mmol/L）時，相對增重率和平均新增根數(shù)均取得最大值，因而考慮選用K3水平（鉀20.0 mmol/L）為培養(yǎng)基中鉀含量配比。對磷元素而言，方差分析結(jié)果表明其對株高、葉片數(shù)、平均新增根數(shù)、相對增重率和平均株分蘗數(shù)等指標(biāo)的影響均不明顯，但極差分析結(jié)果顯示其對葉片數(shù)的影響排在第一位，取P3水平（磷1.2 mmol/L）時葉片數(shù)最多，因而考慮選取P3水平（磷1.2 mmol/L）為培養(yǎng)基中磷含量配比。綜上所述，在鐵皮石斛組培苗增殖階段，培養(yǎng)基中最佳氮、磷和鉀含量配比組合為N3P3K3，在其壯苗階段，最佳氮、磷和鉀含量配比組合為N2P3K3。

2. 2 不同濃度鉀離子含量培養(yǎng)基對鐵皮石斛組培苗相對增重率的影響

方差分析及多重比較分析結(jié)果（表8）表明，不同濃度鉀離子對鐵皮石斛組培苗相對增重率的影響差異極顯著（P<0.01），隨著鉀離子濃度的增加，組培苗的相對增重率呈上升趨勢，其中以k5處理（鉀40.0 mmol/L）的相對增重率最高，比常用1/2MS培養(yǎng)基（k2處理，鉀10.0 mmol/L）的相對增重率高50%以上，說明鐵皮石斛能耐受較高濃度鉀離子，且鉀離子含量的增加在一定程度上有利于鐵皮石斛種苗的物質(zhì)積累。

3 討論

前人對鐵皮石斛肥料需求的研究多數(shù)以組培苗出瓶后栽培的馴化苗或成苗為對象（白美發(fā)，2009；石麗敏等，2013；孔德棟等，2015；張之鵬等，2015），對組培苗階段大量元素營養(yǎng)需求的精細化研究鮮見報道。本研究以鐵皮石斛壯苗階段組培苗為研究對象，采用3因素3水平的氮、磷和鉀元素正交試驗設(shè)計探討三大元素營養(yǎng)對其生長的影響，明確其養(yǎng)分需求量。

孔德棟等（2015）以1年生鐵皮石斛為試材研究其需肥特點，發(fā)現(xiàn)高氮肥顯著影響其株高，植株出現(xiàn)徒長現(xiàn)象。張之鵬等（2015）研究不同營養(yǎng)液對鐵皮石斛組培苗出瓶后生長的影響，發(fā)現(xiàn)氮、磷和鉀3種元素對株高均有極顯著影響，其影響強弱排序為鉀>磷>氮，同時發(fā)現(xiàn)隨著氮濃度的升高，株高發(fā)育受到抑制。本研究中，氮元素對鐵皮石斛組培苗株高影響明顯，與上述兩項研究結(jié)果相似，但發(fā)現(xiàn)鉀和磷對株高影響不顯著，可能是本研究所用材料與上述研究材料分別處于瓶苗和馴化苗兩個不同階段，不同生長環(huán)境下的生理機制不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn)，氮濃度取N2水平（30.0 mmol/L）時鐵皮石斛組培苗株高最高，取N3水平（60.0 mmol/L）時株高反而有所下降，與張之鵬等（2015）的研究結(jié)果相符。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在一定氮濃度范圍內(nèi)，隨著氮濃度的升高，鐵皮石斛組培苗的分蘗數(shù)呈增加趨勢，與孟志霞等（2008）的研究結(jié)果一致。由于氮是氨基酸、酰胺、蛋白質(zhì)、核酸、核苷酸及輔酶等的組成元素，同時葉綠素、某些植物激素、維生素和生物堿等也含有氮，在生命活動中占有首要的地位，故氮肥具有加速植物生長、增加分枝（分蘗）及使?fàn)I養(yǎng)體健壯的作用（潘瑞熾，2004）。因此，在組培苗分化增殖階段，可適當(dāng)增加培養(yǎng)基的氮含量，增加分蘗數(shù)以提高組培苗的增殖率；在組培苗壯苗階段，要相應(yīng)減少氮含量，以促進植株長高并減少分蘗。生產(chǎn)上，在馴化苗或成苗栽培中，鐵皮石斛的老株生長到一定程度便會停止生長，開始落葉并逐漸萎縮，靠老株基部萌發(fā)新芽以維持植株生長，新芽的萌發(fā)時間一般在春季和秋季，其萌發(fā)數(shù)量對來年鐵皮石斛鮮條的產(chǎn)量有重要影響，如能在鐵皮石斛萌發(fā)新芽前適當(dāng)增施氮肥，可增加新芽萌發(fā)的數(shù)量，有利于植株的更新?lián)Q代及產(chǎn)量的維持。

石麗敏等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，噴施磷酸二氫鉀能促進鐵皮石斛1年生馴化苗增重?？椎聴澋龋?015）研究指出，適當(dāng)補充鉀肥對鐵皮石斛有促壯、增產(chǎn)、增加干物質(zhì)、增加植株干鮮比、提高葉綠素含量和增加多糖含量的作用。本研究中，鉀肥對鐵皮石斛組培苗的增產(chǎn)效應(yīng)與上述兩項研究結(jié)果相符。本研究中的鉀離子含量單因素試驗結(jié)果表明，鐵皮石斛能耐受較高含量鉀離子，且增產(chǎn)作用在一定范圍內(nèi)隨著鉀離子含量的提高而增大。鉀離子作為高等植物唯一普遍需要的一價陽離子，對植物的生長發(fā)育起著極重要作用，鉀供應(yīng)充分時，能促進碳水化合物代謝，并加速同化產(chǎn)物向貯藏器官中運輸，可提高產(chǎn)量（潘瑞熾，2004）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)鉀含量對鐵皮石斛新增根數(shù)也有一定影響，因此，在鐵皮石斛組培苗的生產(chǎn)中可適當(dāng)加大鉀離子含量，在大棚種植中采收鮮條前增施鉀肥，可有利于鐵皮石斛根系發(fā)育，同時改善鐵皮石斛的品質(zhì)和增加產(chǎn)量。

張之鵬等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，磷元素對鐵皮石斛馴化苗的株高、莖粗及多糖含量均有顯著影響。本研究結(jié)果與其不一致，極差分析結(jié)果顯示磷元素對鐵皮石斛組培苗的葉片數(shù)有一定影響，但方差分析結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)磷元素對各測定生長指標(biāo)有顯著影響，較低含量的磷元素即可滿足鐵皮石斛組培苗的生長需求。因此，在蘭類花卉生產(chǎn)中應(yīng)改變其營養(yǎng)生長階段施氮、磷、鉀肥為20∶20∶20的比例，適當(dāng)降低磷元素的施用量，節(jié)省成本。

常規(guī)鐵皮石斛快繁流程包括萌芽、增殖、壯苗和生根等不同階段，本研究對象為鐵皮石斛壯苗階段的組培苗，但研究結(jié)果對快繁的其他階段也有一定參考價值，實際操作中可在本研究最佳氮、磷和鉀含量配比基礎(chǔ)上調(diào)整培養(yǎng)基的其他組分。此外，為調(diào)節(jié)各處理氮、磷和鉀三大元素的不同比例及保持鈣、鎂和硫元素的恒定，本研究采用硝酸鉀和硝酸銨作為調(diào)節(jié)試劑，對加入培養(yǎng)基中氮元素的形態(tài)未進行詳細區(qū)分，每處理既含有硝態(tài)氮又含有銨態(tài)氮，同時個別處理引入了較多的氯離子，這些因素對鐵皮石斛生長可能產(chǎn)生一定的影響，在今后的研究中需進一步探討和對試驗方案進行改進。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，氮元素含量對鐵皮石斛組培苗株高及分蘗數(shù)影響明顯，鉀元素含量對鐵皮石斛組培苗相對增重率影響顯著；鐵皮石斛組培苗增殖階段的氮、磷和鉀元素最佳含量配比分別為30.0、1.2和20.0 mmol/L，壯苗階段的氮、磷和鉀元素最佳含量配比分別為60.0、1.2和20.0 mmol/L。在鐵皮石斛組培苗的實際生產(chǎn)過程中，可在此大量元素含量配比基礎(chǔ)上適當(dāng)添加激素及其他有機營養(yǎng)組分，以促進組培苗生長。

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（責(zé)任編輯 思利華）