初始發(fā)酵pH對秸稈酒精醪液沼氣發(fā)酵及其系統(tǒng)內(nèi)微生物群落的影響

朱浩然　李珂　張雅潔

摘要[目的]探究初始pH對秸稈酒精醪液厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響。[方法]利用秸稈酒精醪液作為唯一發(fā)酵底物，并將初始發(fā)酵pH分別設(shè)置為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，8.5，采用序批式厭氧發(fā)酵30 d。[結(jié)果]在150 mL的發(fā)酵體積下最終的甲烷積累量依次為17、24、227、289、246、257、234和143 mL。當(dāng)初始發(fā)酵pH升高時(shí)，發(fā)酵液中殘留的揮發(fā)性脂肪酸（VFA）中的乙酸所占比例逐漸升高，pH為5.0時(shí)乙酸占12.8%，pH為8.5時(shí)乙酸占43.9%。通過比較初始pH為4.0、6.5和8.5時(shí)，VFAs在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)初始pH為6.5時(shí)，乙酸的含量在第1.5天達(dá)到峰值，為3 753.6 mg/L 占總量71.6%，最終乙酸被減少了72.4%；初始pH為8.5時(shí)，乙酸的含量在第10天時(shí)增至峰值，為1 322.9 mg/L（53.8%），最終乙酸減少了36.0%。初始pH為4.0時(shí)，VFAs的總量和組成都沒有明顯的變化。當(dāng)初始發(fā)酵pH為6.0、6.5、7.0、7.5時(shí)，發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢細(xì)菌為梭菌屬（Clostridium），相對豐度為40%～47%；優(yōu)勢古菌為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）和甲烷鬃毛菌屬（Methanosaeta），其相對豐度之和為85%～88%。當(dāng)初始pH為8.5時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢細(xì)菌為普雷沃式菌（Prevotella）和互養(yǎng)單胞菌屬（Syntrophomonas），相對豐度分別為36.8%和14.7%；優(yōu)勢古菌為甲烷桿菌屬（Methanobacterium）和甲烷熱桿菌屬（Methanothermobacter），在其全古菌序列中分別占 62.3%和 11.4%。[結(jié)論]當(dāng)初始發(fā)酵pH為6.5時(shí)，甲烷的產(chǎn)氣積累量最高；當(dāng)初始發(fā)酵pH為6.0、6.5、7.0、7.5時(shí)，為乙酸營養(yǎng)型型甲烷發(fā)酵；當(dāng)初始pH為8.0和8.5時(shí)，為氫營養(yǎng)型甲烷發(fā)酵。

關(guān)鍵詞酒精醪液；初始pH；厭氧發(fā)酵；微生物群落

中圖分類號(hào)S216.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0065-05

Abstract[Objective]Exploring the impact of initial pH on anaerobic fermentative production of methane from waste liquor of alcohol from stalk.[Method]As the waste liquor of alcohol from stalk was the only fermentation substrate， sequencing batch reactor was utilized for 30 days when the initial pH was 4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 respectively. [Result] In the fermentation volume of 150 mL， the final methane accumulates to 17，24，227，289，246，257，234 and 143 mL respectively. When the initial pH was rising， the proportion of acetic acid in VFAsvolatile fatty acids remaining fermentation liquor was also increasing. Acetic acid was 12.8% in proportion when pH was 5.0 and acetic acid is 43.9% in proportion when pH was 8.5. Comparing the dynamic changes of VFAs during fermentation when the initial pH was 4.0，6.5 and 8.5， it turned out that the content of acetic acid reaches to the peak3 753.6 mg/L （71.6% of the total amount） 1.5 days later，and the final consumption of acetic acid was 72.4% when the initial pH was 6.5. Moreover， when the initial pH was 8.5， content of acetic acid reaches to the peak1 322.9 mg/L （53.8% of the total amount） 10 days later，and the final consumption of acetic acid was 36%. There was no obvious change of the total amount or composition of VFAs when the initial pH was 4.0. When the initial pH was 6.0，6.5，7.0，7.5， the dominant bacteria was Clostridium in fermentation system， and the relative abundance was 40%-47%；dominant archaeal was Methanosarcina and Methanosaeta， and the relative abundance was 85%-88%.However， the dominant bacteria was Prevotella and Syntrophomonas in fermentation system， and the relative abundance was 36.8% and 14.7% respectively；dominant archaeal was Methanobacterium and Methanothermobacter， and the relative abundance was 62.3% and 11.4% respectively when the initial pH was 8.5. [Conclusion] The gas from methane accumulates to the highest when the initial pH is 6.5；the dominating methanogenic substrates are acetate when the initial pH is 6.0，6.5，7.0 and 7.5；the dominating methanogenic substrates are H2CO2 when the initial pH is 8.0 and 8.5.

Key wordsAlcohol mash；Initial pH；Anaerobic fermentation；Microbial community

自20世紀(jì)能源危機(jī)爆發(fā)以來，生物質(zhì)可再生能源便得到越來越多的關(guān)注。其中利用農(nóng)作物秸稈發(fā)酵生產(chǎn)生物質(zhì)乙醇技術(shù)得到了快速發(fā)展[1]。由于秸稈發(fā)酵乙醇在環(huán)境問題、糧食問題和能源問題上的重要意義，使其在全球得到了廣泛的認(rèn)可與重視。秸稈發(fā)酵乙醇的工藝主要是預(yù)處理（氣爆、酶解），酵母發(fā)酵，蒸餾提純；生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的高濃度有機(jī)醪液（化學(xué)需氧量高達(dá)20 000～60 000 mg/L），并且呈酸性（pH 2～5），有機(jī)懸浮物濃度高（懸浮固體高達(dá)10 000～40 000 mg/L）[2]。醪液直接排入環(huán)境中，不僅會(huì)對環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，也不利于資源與能源的高效利用。目前國內(nèi)外針對酒精醪液已有多種處理方法，例如DDGS法、濃縮燃燒法、濃縮制肥法、稀釋農(nóng)灌法以及生物處理法等[3]。利用厭氧發(fā)酵原理對酒精醪液進(jìn)行厭氧消化最終產(chǎn)生甲烷，這一技術(shù)不僅符合廢水資源化回收利用的清潔生產(chǎn)性質(zhì)，也會(huì)給廠家?guī)硪欢ǖ慕?jīng)濟(jì)效益。

厭氧發(fā)酵是一種復(fù)雜的物理化學(xué)與微生物活動(dòng)過程。厭氧消化過程產(chǎn)生的有機(jī)小分子酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等。不同的發(fā)酵途徑會(huì)產(chǎn)生多種特定的末端產(chǎn)物，起作用的微生物的種類不同。王晉[4]在文獻(xiàn)綜述中總結(jié)了能夠以揮發(fā)性脂肪酸（VFA）為末端代謝產(chǎn)物的3類功能菌群：水解發(fā)酵產(chǎn)酸菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和同型產(chǎn)乙酸菌。水解發(fā)酵產(chǎn)酸細(xì)菌可以將底物中復(fù)雜有機(jī)物（纖維素、蛋白質(zhì)和脂類等）水解，再經(jīng)過各自的產(chǎn)酸代謝途徑將水解后的小分子轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸等VFA。完成水解作用的細(xì)菌主要是嚴(yán)格厭氧的擬桿菌、梭菌及兼性厭氧的真桿菌等，而產(chǎn)酸發(fā)酵細(xì)菌則是產(chǎn)酸效率較高的產(chǎn)芽孢細(xì)菌，如梭菌科、鏈球菌科、芽孢乳桿菌科、毛螺菌科等。產(chǎn)甲烷菌是一類以甲烷為最終產(chǎn)物的微生物，該過程也是厭氧消化產(chǎn)甲烷的最終過程，因此被認(rèn)為是直接影響甲烷產(chǎn)量的微生物。產(chǎn)甲烷菌一詞是在 1974年由 Bryant 首次提出的，將產(chǎn)甲烷菌同嗜甲烷菌區(qū)別開。所有的產(chǎn)甲烷菌都有3個(gè)共同特征：①都能夠產(chǎn)甲烷，并通過產(chǎn)甲烷獲得生長所需要的大部分能量。②都屬于古菌域中的廣古菌門。③都是嚴(yán)格的厭氧菌。根據(jù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的原理，產(chǎn)甲烷菌和與之相關(guān)的功能性微生物在發(fā)酵過程中起到了重要作用[5]。而影響微生物生長的因素有很多，其中pH是一個(gè)重要因素[6]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，厭氧發(fā)酵的適合pH應(yīng)該在6.0～8.3[7]；6.5～7.5時(shí)產(chǎn)氣最好[8]；pH在6.8～7.2時(shí)啟動(dòng)速度最快[9]。目前針對酒精醪液厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的研究大多集中于木薯、玉米等淀粉類物質(zhì)產(chǎn)酒精后的醪液，而以純纖維素類物質(zhì)如玉米秸稈或稻草等發(fā)酵后醪液的厭氧發(fā)酵研究還很少見。因此，筆者選用秸稈酒精醪液作為生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的底物，以39 ℃發(fā)酵，研究不同初始pH對厭氧發(fā)酵的積累甲烷產(chǎn)量、發(fā)酵產(chǎn)物VFAs的分布的影響，分析并探討初始pH對秸稈酒精醪液厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷及反應(yīng)體系中微生物生長的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1酒精醪液。

該試驗(yàn)中的酒精醪液取自吉林長春某秸稈酒精發(fā)酵廠的廢水厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中反應(yīng)器的中部，取樣時(shí)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)良好。醪液水質(zhì)呈酸性，總化學(xué)需氧量（TCOD）和總懸浮固體物質(zhì)濃度（TS）較高，分別為7.4×104和6.1×104 mg/L。同時(shí)具有較高的可生化性，五日生化需氧量（BOD5）為1.5×104 mg/L，其他如溶解性化學(xué)需氧量（SCOD）、總氮（TN）、總磷（TP）、氨氮（NH+4-N）檢測結(jié)果詳見表1。為保證醪液水質(zhì)的穩(wěn)定性，將醪液儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中備用。

1.1.2接種污泥。

接種污泥分別取自原發(fā)酵廠的厭氧污泥床（UASB）反應(yīng)器中的厭氧顆粒污泥。為保持污泥活性，將其保存于4 ℃冰箱內(nèi)。接種前6 h將污泥置于35 ℃搖床，振蕩培養(yǎng)12 h使其恢復(fù)活性[9]。

1.2方法

所有的發(fā)酵試驗(yàn)均在自制的250 mL厭氧反應(yīng)器（圖1）中進(jìn)行，向其中添加135 mL酒精醪液，15 mL活性污泥，并且使用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl將混合液的pH調(diào)節(jié)為為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。利用厭氧反應(yīng)器上通入發(fā)酵液中的橡膠管向其中通入99.99%的氮?dú)猓?0 min。之后，確保關(guān)閉反應(yīng)器上所有的三通閥，用凡士林密封瓶蓋，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（上海一恒 MGC-450BP-2）培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)溫度為（39±1）℃，振蕩速率為150 r/min，厭氧發(fā)酵的周期為30 d。

1.3分析方法

該試驗(yàn)中的TCOD、SCOD、TN、TP、NH+4-N、TS及VS等常規(guī)指標(biāo)均采用國標(biāo)法測定。醪液、接種物和發(fā)酵液的pH通過pH計(jì)（梅特勒-托利多）測定。氣體組分使用氣相色譜儀（北京京科瑞達(dá)）測定，熱導(dǎo)檢測器（TCD），色譜柱為PropoR-Q（2 m×3 m）柱，載氣采用氦氣，其流速為25 mL/min，氣體進(jìn)樣量為1 mL，定量方法為外標(biāo)法。VFA（乙酸、丙酸、正丁酸之和）通過高效液相色譜儀（日本島津）測定，緩沖液為0.1%的磷酸緩沖液；色譜柱為C18反相柱；檢測器為紫外可見光檢測器，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min。底泥總DNA的提取采用試劑盒（Fast DNA SPIN kit for soil），提取過程按試劑盒說明書進(jìn)行。測序平臺(tái)為MiSeq測序平臺(tái)（上海美吉），PCR擴(kuò)增引物對于細(xì)菌是338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′）和806R（5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）；對于古菌是519F（5′CAGCMGCCGCGGTAA3′）和915R（5′GTGCTCCCCCGCCAATTCCT3′）。PCR采用Trans Gen AP22102：Trans Start Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系。細(xì)菌PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)。古菌PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)。

高通量測序所得的序列通過 QIIME（http：//qiime.org/tutorials/index.html）和RDP Classifier[10]（version 2.2 http：//sourceforge.net/projects/rdpclassifier/，置信度閾值為0.7）進(jìn)行處理，比對數(shù)據(jù)庫為Silva[11]（Release119 http：//www.arbsilva.de）。

2結(jié)果與分析

2.1不同初始發(fā)酵pH條件下各反應(yīng)器的甲烷發(fā)酵規(guī)律

在控制除pH以外的所有條件下，經(jīng)30 d的序批式厭氧發(fā)酵，8組反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵系統(tǒng)基本處于穩(wěn)定。根據(jù)圖2，所有反應(yīng)器在150 mL的發(fā)酵體積下最終甲烷積累量由高至低依次是pH 6.5（289 mL）、pH 7.5（257 mL）、pH 7.0（246 mL）、pH 8.0（234 mL）、pH 6.0（ 227 mL）、pH 8.5（143 mL）、pH 5.0（24 mL）、pH 4.0（17 mL）。在發(fā)酵后12 h就已啟動(dòng)的反應(yīng)器共有5組，分別是pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5和pH 8.0，產(chǎn)氣量依次是28、53、46、44、8 mL。pH 4.0和pH 5.0在發(fā)酵開始后，基本沒有太明顯的發(fā)酵活動(dòng)，產(chǎn)氣也極其微弱。而pH 8.5在發(fā)酵開始后第4天才有明顯的產(chǎn)氣活動(dòng)。根據(jù)圖3，pH 8.5發(fā)酵第1天到第4天的日產(chǎn)氣量分別是4.0、9.0、1.5、11.5 mL，而發(fā)酵啟動(dòng)最快的pH 6.5發(fā)酵開始4 d內(nèi)的日產(chǎn)氣量分別為88.0、78.0、7.5、6.5 mL。pH 6.0、pH 7.0、pH 7.5的產(chǎn)氣規(guī)律較為相似。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)，所有反應(yīng)器在發(fā)酵開始20 d后，日產(chǎn)氣量均低于5 mL。綜上，當(dāng)pH接近于中性時(shí)有利于厭氧發(fā)酵的啟動(dòng)；pH偏堿性時(shí)厭氧發(fā)酵會(huì)滯后，pH過低時(shí)厭氧發(fā)酵不能正常啟動(dòng)。

2.2不同初始發(fā)酵pH條件下各反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵過程中VFA含量的變化

根據(jù)圖4可知，當(dāng)初始發(fā)酵pH不同時(shí)，各反應(yīng)器內(nèi)的VFA積累曲線具有一定的差異性。當(dāng)初始pH為4.0和5.0時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)的VFA含量變化不明顯。當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)的VFA含量以最快的速度達(dá)到所有反應(yīng)器內(nèi)的峰值，即發(fā)酵開始后1.5 d達(dá)到4 386 mg/L。當(dāng)初始pH低于或者高于6.5時(shí)，其系統(tǒng)內(nèi)的VFA含量出現(xiàn)的峰值都要小于反應(yīng)器pH 6.5內(nèi)的峰值，各反應(yīng)器內(nèi)VFA的含量最高時(shí)為pH 6.0（4 058 mg/L）、pH 7.0（4 041 mg/L）、pH 7.5（3 998 mg/L）、pH 8.0（3 259 mg/L）、pH 8.5（2 459 mg/L）、pH 5.0（1 299 mg/L）、pH 4.0（1 178 mg/L）。其中當(dāng)初始pH為8.5時(shí)，反應(yīng)器在發(fā)酵開始后的第10天才達(dá)到VFA含量的峰值，同甲烷產(chǎn)氣的積累曲線一樣出現(xiàn)了滯后現(xiàn)象。以上說明甲烷發(fā)酵的啟動(dòng)速度與VFA的積累速度有直接關(guān)系。所有反應(yīng)器發(fā)酵結(jié)束后，最終的VFA含量由高至低依次為pH 8.5（1 936 mg/L）、pH 7.0（1 659 mg/L）、pH 6.5（1 630 mg/L）、pH 6.0（1 516 mg/L）、pH 8.0（1 425 mg/L）、pH 7.5（1 382 mg/L）、pH 5.0（1 257 mg/L）和pH 4.0（1 146 mg/L）。

2.3初始pH為4.0、6.5和8.5時(shí)系統(tǒng)內(nèi)VFA組成的動(dòng)態(tài)變化

圖5為初始pH 4.0、6.5、8.5時(shí)，發(fā)酵開始1.5、4.0、10.0、18.0和30.0 d時(shí)發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)VFA的組成情況。在發(fā)酵開始初期，3組反應(yīng)器內(nèi)的VFA組成情況為乙酸11.7%（97.30 mg/L）、丙酸36.3%（302.00 mg/L）、丁酸52.0%（432.64 mg/L）。當(dāng)初始pH為4.0時(shí)，發(fā)酵過程中主要變化的成分是丙酸和丁酸，乙酸的含量從發(fā)酵開始后緩慢增長，最終為198.3 mg/L（17.3%），丙酸和丁酸最終的含量分別為58.4 mg/L（5.1%）和889.3 mg/L（77.6%），這說明系統(tǒng)內(nèi)的乙酸菌被嚴(yán)重抑制，丁酸菌成為了優(yōu)勢菌。在初始pH為6.5的反應(yīng)器內(nèi)，乙酸含量變化起伏較大，在發(fā)酵開始后1.5 d，乙酸的含量由97.3 mg/L（11.7%）激增至3 753.6 mg/L（71.6%），之后乙酸的含量又持續(xù)較低，最終為386.3 mg/L（2.4%），而丙酸和丁酸最終的含量分別為133.6 mg/L（8.2%）和1 110.0 mg/L（6.8%）。這可能是因?yàn)樵诜磻?yīng)器pH 6.5內(nèi)，乙酸菌在發(fā)酵前期大量繁殖，所以乙酸的含量迅速升高，隨著發(fā)酵的持續(xù)發(fā)酵基質(zhì)減少以及乙酸型產(chǎn)甲烷菌的存在，乙酸的含量又迅速減少。當(dāng)發(fā)酵pH為8.5時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)丙酸和丁酸含量的變化與pH為6.5時(shí)相似，最終的含量分別為311.7 mg/L（1.6%）和774.4 mg/L（40.0%）。乙酸的含量自發(fā)酵開始后變化緩慢，但發(fā)酵時(shí)間持續(xù)到第10天時(shí)乙酸的含量增至1 322.9 mg/L（53.8%），最終消耗至849.9 mg/L（43.9%），相較于反應(yīng)器pH 6.5，反應(yīng)器pH 8.5內(nèi)最終的乙酸含量比峰值減少了36.0%，而pH 6.5內(nèi)卻減少了72.4%。以上說明當(dāng)初始發(fā)酵pH為8.5時(shí)，系統(tǒng)的產(chǎn)乙酸菌生長緩慢，且系統(tǒng)內(nèi)沒有優(yōu)勢的乙酸型產(chǎn)甲烷菌，從而造成了pH 8.5內(nèi)乙酸的堆積。

2.4發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)中的微生物群落

在歷經(jīng)30 d的厭氧發(fā)酵后，8組不同初始發(fā)酵pH的發(fā)酵系統(tǒng)已基本停止產(chǎn)生甲烷。提取發(fā)酵液中的DNA，通過Miseq高通量測序分析其中的細(xì)菌和古菌菌落的結(jié)構(gòu)特征。測序共得到有效的細(xì)菌序列157 107條以及有效的古菌序列87 228條，所有反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)菌覆蓋度超過99%，所有反應(yīng)器內(nèi)古菌的覆蓋度超過了99.9%，所以此次測序所得的序列深度能夠充分代表各反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)菌和古菌種類。

2.4.1不同初始發(fā)酵pH反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌菌落的結(jié)構(gòu)。

所得全部序列在經(jīng)過一系列的質(zhì)量控制后，按照97%相似性進(jìn)行OTU的聚類，并且合并相對豐度低于1%的細(xì)菌菌屬之后，得圖6。如圖6所示，不同初始發(fā)酵pH的反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌菌落在屬水平上結(jié)構(gòu)差異性較為明顯。明顯地，反應(yīng)器pH 4.0和pH 5.0的細(xì)菌菌屬結(jié)構(gòu)相似，它們的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌門的擬桿菌屬，其相對豐度分別是35.7%和37.3%。而梭菌屬在反應(yīng)器pH 6.0、6.5、7.0和7.5中有著絕對的優(yōu)勢，其相對豐度依次為40.5%、46.7%、42.3%和40.4%，梭菌屬是一類同型產(chǎn)乙酸菌，因此還可能利用 H2 和 CO2 產(chǎn)生乙酸，供乙酸利用型的產(chǎn)甲烷菌如甲烷鬃毛菌屬或甲烷八疊球菌作為底物產(chǎn)甲烷[12]。同時(shí)隸屬于厚壁菌門的毛螺旋菌屬和屬于互養(yǎng)菌門的互養(yǎng)單胞菌屬也有較高的分布，其在全菌序列中所占比例分別為13%～22%和8%～15%。當(dāng)初始發(fā)酵pH變?yōu)?.0和8.5時(shí)，發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌菌落分布又有了較大的變化，具體表現(xiàn)為，原本在中性或者酸性的初始發(fā)酵環(huán)境中的優(yōu)勢菌梭菌屬的相對豐度大幅減少，其在pH 8.0和8.5中的相對豐度分別為12.8%和8.9%，優(yōu)勢菌變化為普雷沃式菌和互養(yǎng)單胞菌屬，它們能與氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌，例如甲烷桿菌屬，合作共生將長鏈脂肪酸降解轉(zhuǎn)化乙酸和氫[13]。它們的相對豐度分別為25.3%、36.8%和13.9%、14.7%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隸屬于螺旋體門的密螺旋菌屬在初始發(fā)酵pH接近中性時(shí)有著較為豐富的含量，其在pH 6.0、6.5、7.0和7.5中的相對豐度依次為7.3%、5.9%、7.8%和3.2%，而在其他反應(yīng)器內(nèi)的含量均小于2%，并且該菌同樣是一類同型產(chǎn)乙酸菌。并且在各反應(yīng)器內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了硝化螺旋菌屬、共養(yǎng)桿菌屬、脫硫弧菌屬、綠灣菌屬和一些含量較少的菌屬。以上結(jié)果說明，當(dāng)初始pH接近中性時(shí)有利于產(chǎn)乙酸菌得生長，當(dāng)初始pH偏堿性時(shí)則會(huì)抑制產(chǎn)乙酸菌從而造成產(chǎn)氫菌的大量繁殖。

2.4.2不同初始發(fā)酵pH反應(yīng)器內(nèi)古菌菌落的結(jié)構(gòu).

在全部的反應(yīng)器中，廣古菌門是絕對的優(yōu)勢菌，其在反應(yīng)器pH 4.0中的相對豐度依次為94.3%、94.7%、96.8%、97.4%、98.2%、97.3%、96.9%和98.3%，并且還有少部分的古菌屬于奇古菌門和泉古菌門。對所有反應(yīng)器中的全古菌庫在屬的水平上進(jìn)行分析，根據(jù)圖7，各反應(yīng)器的古菌菌落差異較為明顯，其中pH 4.0和5.0的古菌菌落結(jié)構(gòu)較為相似，且優(yōu)勢菌的分布也較為均勻，具體的優(yōu)勢菌為甲烷桿菌屬、甲烷八疊球菌屬以及甲烷熱桿菌屬，該3類產(chǎn)甲烷菌在pH 4.0中的相對豐度依次為33.8%、19.7%和23.5%，在pH 5.0中的相對豐度依次為29.1%、19.3%和26.4%。而反應(yīng)器pH 6.0、6.5、7.0、7.5的古菌菌落的結(jié)構(gòu)相似度較高，該4組反應(yīng)器的優(yōu)勢菌均為隸屬于甲烷八疊球菌目的甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬，這是2類乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。兩者所占全古菌菌庫之和依次為85.1%、87.9%、85.4%以及86.8%。其中pH 6.5的甲烷八疊球菌屬含量最高，為50.8%；pH 6.0的甲烷鬃毛菌屬含量最高為46.3%。同樣地，甲烷八疊球菌屬和甲烷鬃毛菌屬在pH 8.5中的相對豐度僅為9.4%與9.9%，其發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢古菌為隸屬于甲烷桿菌目的甲烷桿菌屬和甲烷熱桿菌屬，其在反應(yīng)器pH 8.5中的全古菌序列中分別占62.3%和11.4%，而甲烷桿菌屬和甲烷熱桿菌屬是2類氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌。造成上述現(xiàn)象的原因可能是，當(dāng)初始發(fā)酵pH接近中性時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)存在大量產(chǎn)乙酸細(xì)菌，如梭菌屬、密螺旋菌屬，促進(jìn)了乙酸型產(chǎn)甲烷菌的生長如甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬。相反地，當(dāng)初始pH偏堿性時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)乙酸菌的生長會(huì)受到抑制產(chǎn)氫細(xì)菌大量繁殖，從而促使了氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的繁殖。而一個(gè)良好的沼氣反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷的主要途徑應(yīng)該是乙酸型的產(chǎn)甲烷途徑[14-15]，所以這可能就是反應(yīng)器pH 8.5產(chǎn)氣不良的主要原因。

3結(jié)論與展望

當(dāng)初始發(fā)酵pH為6.5時(shí)，甲烷的產(chǎn)氣最高。過低的pH會(huì)抑制參與水解了大分子有機(jī)物的微生物和產(chǎn)甲烷

菌的生長，造成發(fā)酵系統(tǒng)不能正常啟動(dòng)；過高的pH則會(huì)阻礙產(chǎn)乙酸

菌的生長，從而導(dǎo)致產(chǎn)氫菌的繁殖，最終導(dǎo)致氫營養(yǎng)型的

甲

烷菌成為優(yōu)勢菌，從而造成不良產(chǎn)氣效果。該研究還缺乏對

整個(gè)發(fā)酵階段的微生物動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，結(jié)論的數(shù)據(jù)支持還不夠完整，最后希望能夠通過該研究給酒精醪液發(fā)酵產(chǎn)業(yè)及研究帶來一定的技術(shù)支持。

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