陳素紅 鄒璞 廖景平

摘要[目的]研究藍(lán)豬耳大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育。[方法]采用常規(guī)石蠟切片和超薄切片技術(shù)研究藍(lán)豬耳大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程。[結(jié)果]藍(lán)豬耳為中軸胎座，倒生胚珠，單珠被，薄珠心。大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成T-形和直線形四分體。T-形四分體合點(diǎn)端大孢子具功能，胚囊為蓼型發(fā)育形式；直線形四分體中珠孔端大孢子具功能，最終形成八核七細(xì)胞的成熟胚囊。胚囊發(fā)育異常偶有發(fā)生，但大部分胚囊都能發(fā)育成正常的7-細(xì)胞胚囊。[結(jié)論]藍(lán)豬耳雌性生殖細(xì)胞發(fā)育異常并不是其結(jié)實(shí)率低的主要原因。

關(guān)鍵詞藍(lán)豬耳；大孢子發(fā)生；雌配子體形成

中圖分類號(hào)S188+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0128-03

Abstract[Objective]To study megasporogenesis and female gametophyte development of T. fournieri.[Method]Megasporogenesis and female gametophyte development of T.fournieri were investigated by techniques of paraffin sections and ultrathin sections.[Result] T.fournieri had axile placenta.The ovule was anatropous，unitegmic and tenuinucellatae.The megasporocyte divided into Ttetrad or linear tetrad after meiosis.The chalazal end megaspore was functional in Ttetrad and the embryo sac was the polygonum type.However，the micropyle end megaspore was functional in linear tetrad.The mature embryo sac was 7celled and 8nucleate type.Abnormal embryo sac was observed by chance，but most of the embryo sacs could develop normally.[Conclusion]The abnormal development of female germ cells wasnt a crucial factor for the low setting rate of Torenia fournieri.

Key wordsTorenia fournieri；Megasporogenesis；Female gametophyte development

藍(lán)豬耳（Torenia fournieri Linden.Ex Foum.）是玄參科（Scrophulariaceae）蝴蝶草屬一年生直立草本植物。現(xiàn)栽培種花色鮮艷，是夏季優(yōu)良草花盆栽觀賞花卉之一。它花期長(zhǎng)、花量大，還具有半裸露胚囊，因而被作為研究被子植物受精生物學(xué)的理想模式植物[1]。

數(shù)十年來，借助藍(lán)豬耳特殊的胚囊結(jié)構(gòu)，研究多集中在花粉管生長(zhǎng)、受精前后發(fā)育過程、離體受精體系建立等[2-10]，而有關(guān)藍(lán)豬耳胚胎學(xué)的研究較少。Vivian等[11]著重研究了藍(lán)豬耳胚和胚乳的發(fā)育，以及胚乳的吸器、營(yíng)養(yǎng)功能與成熟種子形成的關(guān)系。Tiwari[12-13]報(bào)道了藍(lán)豬耳成熟胚囊中有胼胝質(zhì)壁的出現(xiàn)，通過組織化學(xué)法研究了承珠盤的細(xì)胞壁。Wallwork等[14]研究了藍(lán)豬耳授粉后至受精前胚囊內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。目前，有關(guān)藍(lán)豬耳大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育的研究少見報(bào)道。筆者研究了藍(lán)豬耳大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程，探討了藍(lán)豬耳半裸露胚囊的形成和栽培種結(jié)實(shí)率不高的原因，為藍(lán)豬耳的胚胎學(xué)研究積累資料。

1材料與方法

試驗(yàn)材料為中國(guó)科學(xué)院華南植物園種植的藍(lán)豬耳。用卡尺測(cè)量不同發(fā)育時(shí)期的花苞，按花苞長(zhǎng)度和開放狀態(tài)分別放于FAA液中固定，抽氣。愛氏蘇木精整體染色，常規(guī)石蠟切片，厚度8 μm 。用OlympusAX70 光學(xué)顯微鏡觀察和OlympusDP50數(shù)碼拍照。

光鏡下確定發(fā)育時(shí)期，選取主要時(shí)期的胚珠固定于1%戊二醛（0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.2）中，4 ℃下12～24 h。用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）洗滌后轉(zhuǎn)入1%鋨酸（0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.2）中固定，4 ℃下16 h。再用上述緩沖液沖洗后經(jīng)各級(jí)乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon 812環(huán)氧樹脂滲透并包埋。包埋塊在半薄切片機(jī)上用玻璃刀切片，厚度為1～2 μm，0.5%甲苯胺藍(lán)溶液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、定位，LK-S型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在日本JEM-1010透射電鏡100 kV下觀察、拍照。

2結(jié)果與分析

2.1胚珠的發(fā)育與大孢子發(fā)生

藍(lán)豬耳為中軸胎座，子房室中有上百個(gè)胚珠，其中胚珠的發(fā)育基本是同步的。當(dāng)心皮原基腹縫線開始連合后，胎座部位細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)變得濃厚并開始迅速分裂分化，向子房腔內(nèi)迅速隆起形成圓球形的胚珠原基（圖1a）。

藍(lán)豬耳胚珠倒生，單珠被，薄珠心。當(dāng)珠被剛包圍珠心時(shí)，珠孔端珠心組織表皮下分化出一個(gè)體積較大、細(xì)胞質(zhì)濃、細(xì)胞核顯著的細(xì)胞，即孢原細(xì)胞。孢原細(xì)胞直接發(fā)育為大孢子母細(xì)胞，大孢子母細(xì)胞的體積比孢原細(xì)胞更大，細(xì)胞質(zhì)更濃，細(xì)胞器豐富（圖1b）。單層的珠心表皮細(xì)胞沒有進(jìn)一步分裂分化，而是在減數(shù)分裂時(shí)期開始解體，到功能大孢子時(shí)期珠孔端只留下一些退化的痕跡（圖1c），藍(lán)豬耳胚珠為薄珠心胚珠。藍(lán)豬耳胚珠屬單珠被胚珠，功能大孢子時(shí)期珠被細(xì)胞具有3～4層細(xì)胞（圖1d）。與此同時(shí)，由于胚珠基部的不均衡生長(zhǎng)，導(dǎo)致珠柄彎向一側(cè)，在功能大孢子形成時(shí)完全倒轉(zhuǎn)形成倒生胚珠。大孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂后形成四分體，四分體的4個(gè)大孢子排列方式多數(shù)為直線形，少數(shù)為T-形。在T-形四分體中，靠近珠孔端的3個(gè)大孢子同時(shí)解體消失，只有合點(diǎn)端的大孢子保留，即功能大孢子（圖1e）。在直線形四分體中，靠近合點(diǎn)端的3個(gè)大孢子逐個(gè)解體消失，只有珠孔端的大孢子保留，成為功能大孢子（圖1f）。藍(lán)豬耳以單孢子胚囊的發(fā)育方式進(jìn)一步發(fā)育為成熟胚囊。

2.2雌配子體發(fā)育

減數(shù)分裂完成后，功能大孢子與其他3個(gè)分離，細(xì)胞膨大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核顯著。功能大孢子繼續(xù)發(fā)育形成單核胚囊，單核胚囊的體積進(jìn)一步增大，進(jìn)行第1次有絲分裂，形成二核胚囊。二核胚囊初期，胚囊隨著大量的小液泡出現(xiàn)而體積增大；之后2個(gè)核分別向胚囊兩極移動(dòng)，中間被大液泡隔開，但兩核之間有細(xì)胞質(zhì)相連。接著，兩核各自進(jìn)行1次有絲分裂，形成四核胚囊，此時(shí)可觀察到被珠被包被的珠心表皮細(xì)胞退化留下的痕跡（圖1g）。隨著核的分裂，胚囊逐漸拉長(zhǎng)并出現(xiàn)大液泡化，四核同時(shí)進(jìn)行1次有絲分裂形成八核胚囊，在靠珠孔端有4個(gè)核，在合點(diǎn)端也有4個(gè)核，8個(gè)核處于共同的細(xì)胞質(zhì)中。在八核胚囊時(shí)期，合點(diǎn)端有2個(gè)核出現(xiàn)退化現(xiàn)象，核變形，染色變黑（圖1h）。接著發(fā)生細(xì)胞化，在珠孔端的4個(gè)核有3個(gè)組成卵器，包含1個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)助細(xì)胞；在合點(diǎn)端的4個(gè)核有2個(gè)形成反足細(xì)胞；珠孔端的上極核和合點(diǎn)端的下極核共同構(gòu)成含2個(gè)核的中央細(xì)胞。這2個(gè)極核融合形成次生核。這樣，形成八核七細(xì)胞的成熟胚囊。

藍(lán)豬耳成熟胚囊半裸露于珠孔端，卵器和部分中央細(xì)胞清晰可見（圖2a）。卵細(xì)胞內(nèi)有大液泡，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)大部分位于細(xì)胞的合點(diǎn)端，較大的液泡則位于珠孔端；2個(gè)助細(xì)胞和卵細(xì)胞呈“品”字型排列，2個(gè)助細(xì)胞的核和大部分細(xì)胞質(zhì)都分布在珠孔端（圖2b）。中央細(xì)胞中2個(gè)極核距離較近，位于胚囊的中心位置（圖2c）。當(dāng)胚囊發(fā)育成熟，2個(gè)極核融合成的次生核有向珠孔端移動(dòng)的趨勢(shì)，中央細(xì)胞的核和核仁與卵細(xì)胞的相比都較大（圖2d）。3個(gè)反足細(xì)胞呈“品”字型排列，細(xì)胞為長(zhǎng)橢圓形（圖2e）。

3討論

Vivian等[11]簡(jiǎn)要報(bào)道了藍(lán)豬耳雌配子體發(fā)育特征，顯示大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后成4個(gè)大孢子，合點(diǎn)端的一個(gè)行使功能最終發(fā)育成雌配子體，然而該研究結(jié)果與之不同。該研究顯示：胚囊發(fā)育為單孢子型，當(dāng)大孢子減數(shù)分裂后為T-形四分體時(shí)，胚囊為蓼型發(fā)育形式，成熟胚囊為八核七細(xì)胞；當(dāng)大孢子減數(shù)分裂后為直線形四分體時(shí)，珠孔端第1個(gè)大孢子為功能大孢子，其他3個(gè)逐個(gè)退化，最終成熟胚囊仍為八核七細(xì)胞。藍(lán)豬耳胚囊發(fā)育特征有待進(jìn)一步研究。

從花苞外部形態(tài)與內(nèi)部大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育情況比較（表1）可見，藍(lán)豬耳花蕾不大，生殖器官發(fā)育所經(jīng)歷的時(shí)間不長(zhǎng)，但雌蕊與雄蕊發(fā)育進(jìn)程是不同步的。早期雄蕊的發(fā)育快于雌蕊，但胚囊后期發(fā)育進(jìn)程快，使得雌、雄性生殖細(xì)胞在開花時(shí)基本同時(shí)達(dá)到成熟階段。

植物開花后所產(chǎn)生的成熟果實(shí)比所開的花少，而果實(shí)中成熟種子數(shù)比胚珠數(shù)少許多，這既是環(huán)境條件對(duì)植物進(jìn)行選擇的結(jié)果，也是植物對(duì)有限環(huán)境資源適應(yīng)的結(jié)果[16]。許多植物不能正常地繁衍后代，很重要的原因之一是植物有性生殖過程的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)了障礙[17-18]。筆者研究了藍(lán)豬耳雌配子體發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)在胚囊形成的過程中有異?，F(xiàn)象發(fā)生，但經(jīng)過大量

切片統(tǒng)計(jì)，胚囊不能正常發(fā)育的數(shù)量很少，大部分都能發(fā)育成正常的7-細(xì)胞胚囊。因此，認(rèn)為藍(lán)豬耳雌性生殖細(xì)胞發(fā)育異常并不是其結(jié)實(shí)率低的主要原因。

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