李鵬 黃曉慧 王克磊 巫偉峰 李斌奇 楊芮 陳發(fā)興
摘 要 以‘黑珍珠李為試材,測定其色澤參數(shù)及其發(fā)育過程中的糖酸種類與含量、花青苷的種類與含量,并進(jìn)行花青苷含量與色澤參數(shù)的相關(guān)性分析、花青苷含量與糖酸含量的通徑分析。結(jié)果表明:果實中檢測到6種有機(jī)酸。蘋果酸含量最高,其次是順烏頭酸、莽草酸、檸檬酸、琥珀酸和富馬酸。果實中葡萄糖和果糖含量變化不大,山梨醇含量相對較低,蔗糖含量隨著果實發(fā)育逐漸升高。黑珍珠李中主要有矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷,果實發(fā)育前期果皮和果肉花青苷含量相差不大,而從花后(DAF)85 d開始,果皮花青苷含量急劇增加,此時色澤參數(shù)也有相應(yīng)變化,但果肉花青苷含量與色差變化不大。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),李果皮發(fā)育過程中,花青苷含量與L*和b*成負(fù)相關(guān),與a*成正相關(guān),果肉花青苷含量與色澤參數(shù)相關(guān)性不大;通徑分析表明,果皮中蘋果酸通過其他糖酸對總花青苷的影響較大,果肉中琥珀酸對于其他5個酸起著較大的貢獻(xiàn),而順烏頭酸起著負(fù)作用,葡萄糖對于其他3個糖在花青苷的合成上也起著負(fù)作用。
關(guān)鍵詞 李;有機(jī)酸;可溶性糖;色差;花青苷;通徑分析
中圖分類號 S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A
Abstract Based on‘Heizhenzhu, the color parameters, development process of sugar and organic acid type, content and kinds of anthocyanin were assayed, and the correlation analysis of anthocyanin content and color parameters, and the path analysis of sugar and organic acid were analyzed. The results showed that six kinds of organic acid were detected, and the content of malic acid was the highest, followed by cis-aconitic acid, shikimic acid, citric acid, succinic acid and fumaric acid. The content of glucose and fructose was relatively stable while that of sucrose increased gradually with fruit development. Cyaniding-3-glucoside and cyaniding-3-rutinoside were the main anthocyanin, and at the prophase of fruit development, the content of anthocyanin in peel and fresh was different. But 85 days after full bloom, the content of anthocyanin of peel increased sharply. At this time, the color parameters also had the corresponding change, but the content of anthocyanin and color parameters of the fresh did not changed. Correlation analysis showed that the content of anthocyanin was negatively correlated with L* and b*, and was positively correlated with a*, and the content of anthocyanin in fresh was not correlated with the color parameters; Path analysis showed that malic acid in peel by other sugars and organic acids effects on total anthocyanin larger, succinate acid in the fresh for the other five organic acid played a greater contribution, and cis-aconitic acid played a negative role, glucose for the other three sugars in total anthocyanin synthesis also played a negative role.
Key words Plum; organic acid; sugar; chromatic aberration; anthocyanin; path analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.014
色澤是評價果實質(zhì)量和商品價值的重要指標(biāo),有關(guān)果實色澤調(diào)控機(jī)理的研究也一直為人們所關(guān)注[1]。在果實色澤形成過程中,花青苷發(fā)揮著重要作用,其種類和分布狀況與果實色澤密切相關(guān)[2]。李果皮中所含花青苷的種類較多,其中含量最多的花青苷是矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷,還有少量的芍藥色素-3-葡萄糖苷和芍藥色素-3-蕓香糖苷[3]?;ㄇ嘬盏男纬赏瑫r受到溫度、光照等外界環(huán)境及糖酸、激素和礦質(zhì)元素等多種因素的影響[4]。
李果實中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇[5],其不同發(fā)育時期所含可溶性糖的種類并無差異,只是含量有所不同[6]。研究表明,可溶性總糖、果糖、葡萄糖和蔗糖均與花青苷合成呈現(xiàn)不同程度的相關(guān)性[7]。李果實中的有機(jī)酸主要為蘋果酸[8],還含有少量的檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、順烏頭酸、莽草酸和酒石酸。有機(jī)酸含量是果實風(fēng)味品質(zhì)的重要組成因素,一方面調(diào)節(jié)液泡的pH,影響花青苷的穩(wěn)定性,另一方面花青苷合成過程中的各種酶需要在一個合適的pH值條件下起催化作用[9]。
本試驗選取黑珍珠李為試材,通過對比果肉和果皮在生長發(fā)育過程中色差、糖酸和花青苷種類及含量變化的差異,探討花青苷與色澤參數(shù)的相關(guān)性及與糖酸含量的通徑分析,為深入研究李花青苷合成的調(diào)控機(jī)制提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 材料與試劑 黑珍珠李采自寧德市古田縣李種植基地,自5月16日起,每隔7 d采樣1次,隨機(jī)選擇生長一致的樹3株,每次于東南西北中取果5個,迅速帶回實驗室,除了用于色差的測量外,其它進(jìn)行削皮處理,將果皮和果肉分開,用液氮冷凍,然后放入-80 ℃冰箱,用于后續(xù)實驗。
乙醇、甲醇、鹽酸、N-N-二甲基甲酰氨(DMF)、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸(國藥集團(tuán)有限公司);順烏頭酸[阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司];富馬酸、莽草酸、蘋果酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷(美國Sigma公司);BSTFA+1%TMCS(SUPELCO公司)。
1.1.2 儀器與設(shè)備 電子分析天平(BAS224S,Sartorius公司,德國);全自動色差計(北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司);離心機(jī)(5810R,Eppendorf公司,德國);電熱恒溫水浴鍋(DK-S24,上海精宏實驗設(shè)備有限公司);氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國菲力根 TraceGC/PolarisQ); HPLC儀器:高效液相色譜儀Waters-1525,1525型高精度二元高壓梯度泵(Waters,美國),2707型自動進(jìn)樣器(Waters,美國),2998光電二極管陣列檢測器(Waters,美國),Diamonsil C18(L)5 μ 250×4.6 mm COL柱(Diamonsil,中國),外加保護(hù)柱。
1.2 方法
1.2.1 色澤參數(shù)測量 果實色澤用色差計測量果實赤道4個點的果皮色差L*,a*,b*,C和h,隨后切開果實,隨機(jī)取3個點測量其果肉色差。L*值表示顏色的亮度,取值范圍在0~100之間,100代表白色,0代表黑色;a*代表紅綠色度,取值范圍為-60~+60,a*取正值時為紅色和紫色,負(fù)值為綠色和藍(lán)色,絕對值越大則顏色越深;b*值代表黃藍(lán)色度,取值范圍也在-60~+60,正值時為黃色,負(fù)值時為藍(lán)色,絕對值越大則顏色越深[9]。由a*和b*值可以計算出C和h。其中,C=[(a*)2+(b*)2]1/2表示色澤飽和度,h為色調(diào)角。
1.2.2 糖酸的組分和含量測定 (1)李果實有機(jī)酸和可溶性糖的提取。有機(jī)酸和可溶性糖的提取方法參照J(rèn)ia等[10]的方法,并有所改良。稱取-80 ℃條件下保存的樣品果肉2.0 g放入研缽中,用液氮研磨,加入5 mL提取液(80%的乙醇溶液),37 ℃水浴加熱30 min,超聲波提取15 min,離心(4 ℃,10 000 g,15 min),將上清液轉(zhuǎn)到25 mL容量瓶中,重復(fù)提取3次,定容。
(2)有機(jī)酸和可溶性糖含量的測定。取100 μL提取液于色譜瓶中,真空干燥后先加入50 μL DMF,然后再加入50 μL BSTFA+1%TMCS,在60 ℃下反應(yīng)30 min,即可進(jìn)行上樣分析[11]。
氣相色譜(GC)條件:VF-5ms 30 m×0.25 mm×0.25 μm;程序升溫,起始溫度70 ℃,保持5.0 min,以5 ℃/min的速度升溫至310 ℃,保持1 min;進(jìn)樣口溫度230 ℃,不分流進(jìn)樣,載氣為氦氣,恒流,1 mL/min。
質(zhì)譜(MS)條件:質(zhì)譜接口溫度為250 ℃,離子源溫度220 ℃,電離方式EI,離子能量70 ev,全掃描模式,掃描質(zhì)量范圍為50~600 mu;溶劑切除時間8 min。
1.2.3 花青苷的組分和含量測定 李果實花青苷的提取。取李果實樣品用液氮研磨成粉末,稱取1.0 g樣品,溶解于10 mL的HCl/甲醇(0.25 ∶ 99.75,V/V)溶液中,4 ℃黑暗條件下,提取24 h,期間搖動2次。4 ℃下,12 000 r/min離心10 min。取1 000 μL上清液轉(zhuǎn)移至自動進(jìn)樣瓶。檢測波長530 nm,柱溫40 ℃;流速1.0 mL/min,進(jìn)樣5 μL。梯度洗脫:溶液A(100%甲醇)和溶液B(0.3%磷酸水溶液)。利用溶液A進(jìn)行梯度洗脫:0 min,17%;12 min,36%;13 min,25%。
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用Excel 2003進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的整理,利用SPSS 19.0進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)顯著性利用Pearson雙側(cè)檢驗的方法進(jìn)行檢驗,并進(jìn)行花青苷含量與有機(jī)酸和可溶性糖含量間的通徑分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 果實生長發(fā)育過程中色差的變化
在CIE色度空間中,L*值代表果實表面的亮度,一般與果實著色程度和果實表面的光潔度有關(guān)。隨著李果實生長發(fā)育,前期果皮和果肉L*值變化不明顯,而從花后85 d,果皮的L*值明顯下降(圖1),即從53.85下降至19.23,此時花青苷開始積累,果皮顏色則由黃綠色向黑紫色轉(zhuǎn)變,而果肉的L*值變化不明顯。在色澤參數(shù)中a*被認(rèn)為是代表果實紅綠色度的值,果皮a*值前期稍微有所下降,而到了花后85 d,a*值迅速增大,從-71.99增大至-28.79,果肉a*值變化也不是明顯。果皮a*值前期比果肉低一些,而后期明顯比果肉高,可見果皮和果肉著色機(jī)理存在很大差異。b*值是黃藍(lán)色度參數(shù),隨著果實發(fā)育,果皮b*值前期稍稍增大,即由24.10增大至25.95,而到了花后85 d由25.95迅速下降至4.13,可能原因是前期葉綠素降解,果皮顏色綠色稍稍變淺,到了著色期時,花青苷開始積累合成[12],從黃綠色慢慢轉(zhuǎn)變成紅色和紫黑色,而果肉整個時期變化不明顯。果皮中的C值呈略微上升,然后陡然下降的趨勢,而果肉變化平緩。果皮中的h值則呈先上升再下降再上升的趨勢,果肉的變化趨勢為先略微上升,再趨于平緩。
2.2 果實生長發(fā)育過程中糖酸的變化
2.2.1 果實生長發(fā)育過程中有機(jī)酸含量的變化 由圖2可知,果皮中的總有機(jī)酸在花后92 d達(dá)到最高值12 700 mg/kg,然后又有所下降,達(dá)到9 930 mg/kg,而果肉中的總有機(jī)酸維持在6 000 mg/kg。果皮和果肉的蘋果酸含量相差較大,且果皮含量多于果肉含量,果皮中的蘋果酸前期變化平緩,隨后有所上升,花后92 d達(dá)到最高值12 700 mg/kg,然后有所下降,花后99 d時達(dá)到9 930 mg/kg,而果肉中蘋果酸含量整體變化平緩,維持在6 000 mg/kg。果肉的檸檬酸整體呈下降趨勢,花后99 d達(dá)到最低值49.90 mg/kg,而果皮中的檸檬酸含量先呈下降趨勢,花后76 d達(dá)到126.12 mg/kg,隨后有所上升,花后92 d達(dá)到163.63 mg/kg,最后呈下降趨勢,于花后99 d達(dá)到最低值92.6 mg/kg。果皮和果肉中的順烏頭酸前期都呈下降趨勢,且果皮下降量110.41 mg/kg大于果肉下降量34.78 mg/kg,花后85 d,果皮中的順烏頭酸稍微有所上升,花后99 d時,達(dá)到最高值199.57 mg/kg,果肉中的順烏頭酸則急劇下降,花后99 d達(dá)到最低值89.15 mg/kg,可能是果皮和果肉中順烏頭酸相互轉(zhuǎn)移造成。果肉中的莽草酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于果皮中的莽草酸,果皮中的莽草酸在整個發(fā)育過程中呈下降趨勢,而果肉中的莽草酸含量在花后92 d達(dá)到最低值66.63 mg/kg,然后有所上升,達(dá)到85.51 mg/kg。果皮和果肉中的琥珀酸和富馬酸在發(fā)育前期呈上升趨勢,花后76 d達(dá)到最高值,分別為82.02、84.04 mg/kg和110.88、88.02 mg/kg。隨后呈下降趨勢,琥珀酸中果皮和果肉含量相差不大,在花后99 d達(dá)到最低值15.93 mg/kg和17.06 mg/kg。果皮和果肉中的富馬酸也呈下降趨勢,果皮中的富馬酸在花后99 d達(dá)到最低值37.64 mg/kg,而果肉中的富馬酸在花后92 d達(dá)到最低值17.17 mg/kg,隨后有所上升,在花后99 d升至25.40 mg/kg。
2.2.2 果實生長發(fā)育過程中可溶性糖含量的變化
由圖3可知,果皮和果肉的總可溶性糖變化趨勢大致相同,花后92 d達(dá)到最高值38.38和23.52 mg/g,然后略微有些下降,達(dá)到37 726和23 184 mg/kg。果皮和果肉中葡萄糖、果糖和山梨醇變化都呈平緩趨勢,分別維持在9 800、9 300、8 600和6 500、5 500、5 000 mg/kg。果皮和果肉中的蔗糖在整個生長發(fā)育過程中呈上升趨勢,且果皮中的蔗糖增加量(5 280 mg/kg)于果肉中的蔗糖增加量(2 420 mg/kg),分別為10 175和6 368 mg/kg。
2.3 果實生長發(fā)育過程中花青苷含量的變化
由圖4可知,在果實發(fā)育前期果皮和果肉中的花青苷含量變化平緩,而到了花后85 d時,果皮中的Cy-3-glu和Cy-3-rut含量陡然上升,達(dá)26.70和11.39 mg/hg,果肉中花青苷含量的變化平緩。果皮中的總花青苷從花后85 d開始積累,于花后99 d達(dá)到最高值38.09 mg/hg,而果肉中的總花青苷變化平緩。
2.4 花青苷含量與色差的相關(guān)性
黑珍珠李發(fā)育過程中花青苷含量與色澤參數(shù)的相關(guān)性見表1。由表1可知,果皮中的花青苷與L*值、 b*值和C值相關(guān)性顯著,呈負(fù)相關(guān)且相關(guān)系數(shù)大,其中,Cy-3-glu含量與b*值在 0.97以上,而與a*值呈正相關(guān),Cy-3-glu含量與a*值相關(guān)系數(shù)也在0.97以上。果肉與色澤參數(shù)相關(guān)性不明顯。
2.5 花青苷含量與糖酸含量的通徑分析
以總花青苷含量為因變量,以琥珀酸、富馬酸、順烏頭酸、莽草酸、檸檬酸、蘋果酸、葡萄糖、果糖、山梨醇和蔗糖為自變量進(jìn)行通徑分析,把各糖酸含量與總花青苷含量的相關(guān)系數(shù)分解為直接作用和間接作用,以明確不同糖酸含量對總花青的效應(yīng)大小。
在果皮有機(jī)酸和總花青苷的通徑分析中(表2),琥珀酸和莽草酸含量與總花青苷含量呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.773和0.882,富馬酸含量與總花青苷含量呈顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.523。相關(guān)性分析結(jié)果表明,隨著果皮花青苷含量的增加,琥珀酸和富馬酸含量相應(yīng)下降,而莽草酸則相應(yīng)增加。而莽草酸含量對總花青苷含量的直接通徑系數(shù)最大(p=0.883),與相關(guān)系數(shù)相近,說明莽草酸含量通過其他糖酸的間接作用很小。蘋果酸含量對總花青苷含量的直接通徑系數(shù)最?。╬=-0.532),而與總花青苷含量的相關(guān)系數(shù)為-0.003,差異性不顯著,說明蘋果酸通過其他糖酸對總花青苷的影響較大,蘋果酸通過莽草酸和山梨醇的間接通徑系數(shù)分別為0.183和0.252,表明莽草酸和山梨醇在蘋果酸對總花青苷含量的增加起著重要貢獻(xiàn)。琥珀酸、富馬酸和順烏頭酸通過莽草酸對總花青苷的間接通徑系數(shù)都為負(fù)值,分別為-0.580、-0.475和-0.340,表明莽草酸在對其他有機(jī)酸的下降起著重要貢獻(xiàn)。
而果皮中葡萄糖、果糖、山梨醇和蔗糖含量與總花青苷含量呈正相關(guān)(見表2),其中蔗糖與總花青呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.717,即隨著蔗糖含量的增加,果皮的花青苷含量也相應(yīng)增加。山梨醇含量與與總花青苷含量的直接通徑系數(shù)最大(p=0.291),但相關(guān)系數(shù)只有0.026,差異不顯著,表明山梨醇含量對總花青苷含量的增加有貢獻(xiàn),但通過蘋果酸對總花青苷含量的間接通徑系數(shù)為-0.460,說明在山梨醇對總花青苷的影響中,蘋果酸起著抑制的作用。而在葡萄糖、果糖和蔗糖通過蘋果酸對總花青苷的間接通徑系數(shù)為負(fù)值,分別為-0.472、-0.344和-0.284,表明蘋果酸在可溶性糖對總花青苷含量起著負(fù)作用。
果肉與總花青苷的通徑分析與果皮有很大差異(見表3),有機(jī)酸和總花青苷含量相關(guān)性不顯著,且呈負(fù)相關(guān)。琥珀酸和莽草酸對總花青含量的直接通徑系數(shù)最大,分別為1.186和0.565,而富馬酸和順烏頭酸對總花青苷含量的直接通徑系數(shù)最小,分別為-0.678和-1.242。富馬酸、順烏頭酸、莽草酸、檸檬酸和蘋果酸通過琥珀酸對果肉總花青苷的間接通徑系數(shù)較大,分別為1.061、0.805、0.652、0.700和0.620,表明琥珀酸對于其他5個酸在總花青苷合成上有著較大的貢獻(xiàn)。而琥珀酸、富馬酸、莽草酸、檸檬酸和蘋果酸對果肉的總花青苷的間接通徑系數(shù)較小,分別為-0.843、-0.722、-0.810、-1.081和-0.164,表明順烏頭酸對于其他5個酸在總花青苷合成有著較大的負(fù)作用。
果肉中山梨醇含量與總花青苷含量呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.696,且山梨醇對總花青含量的直接通徑系數(shù)最大(p=0.696),而葡萄糖對總花青苷的直接通徑系數(shù)最?。╬=-3.237)。果糖、山梨醇和蔗糖通過葡萄糖對總花青苷含量的間接通徑系數(shù)均為負(fù)值,分別為-2.755、-2.800和-2.418,說明葡萄糖在間接作用對于另外3個糖起著負(fù)的作用。
果實中總有機(jī)酸和總可溶性糖與總花青苷的通徑圖如圖5所示,果皮中總可溶性糖含量對總花青苷含量的直接通徑系數(shù)為1.198,比上果肉總可溶性糖對總花青苷的直接通徑系數(shù)0.620大,而果皮中總有機(jī)酸對總花青苷的直接通徑系數(shù)(p=-0.959)比果肉的(p=-0.25)小,一方面表明可溶性糖對于花青苷的合成有著較大的貢獻(xiàn),而有機(jī)酸對于花青苷的合成起著負(fù)作用,另一方面由于果皮和果肉數(shù)據(jù)上的差異,表明可能是因為果皮和果肉所處的微琙環(huán)境不同造成了糖酸和花青苷有著較大的差異,譬如光照和溫度等。
3 討論
‘黑珍珠李生長發(fā)育過程中,大部分有機(jī)酸呈下降趨勢,但最主要的有機(jī)酸蘋果酸變化并不明顯,呈平緩的趨勢;葡萄糖和果糖、山梨醇變化平緩;蔗糖呈上升趨勢?;ㄇ嘬蘸颗c色澤參數(shù)相關(guān)性分析表明,果皮在生長發(fā)育過程中,花青苷含量L*值和b*值成負(fù)相關(guān),與a*值成正相關(guān),這一點與前人研究結(jié)果一致[13-14]。
另外,李果實生長發(fā)育過程中花青苷含量與糖酸含量的通徑分析表明,果皮中蘋果酸通過其他糖酸對總花青苷的影響較大,果肉中琥珀酸對于其他5個酸起著較大貢獻(xiàn),而順烏頭酸起著負(fù)作用,葡萄糖對于其他另外3個糖在花青苷的合成上也起著負(fù)作用。李果實總有機(jī)酸和總可溶性糖對總花青苷的通徑圖上表明,總可溶性糖在總花青苷的合成上起著較大的貢獻(xiàn),而總有機(jī)酸起著負(fù)作用,且果皮變化比果肉明顯。崔艷濤[15]、張茜等[16]和張義等[17]也有類似的研究報道,但不同果實存在基因型差異,而且受其他外界因素,譬如激素、光照和溫度影響也非常大。
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