苗雪雪 龔浩如 陶曙華 陳英姿 陳祖武 劉登彪

摘 要：采用微波消解-鉬銻抗光度法測(cè)定蔬菜中的總磷，為獲得最佳試驗(yàn)條件，對(duì)微波消解條件中的酸的種類、消解時(shí)間和消解溫度等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：硝酸和過(guò)氧化氫（體積比7∶1）為最佳消解酸系，最高消解溫度180 ℃，保持時(shí)間20 min。對(duì)紫外-可見(jiàn)光波長(zhǎng)和顯色時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行探討，結(jié)果表明710 nm和20 min為最佳試驗(yàn)條件。為評(píng)價(jià)該方法的可靠性，選用兩種蔬菜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10048和GBW 10049 對(duì)該方法進(jìn)行分析驗(yàn)證，測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值相符，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.884%和0.938%，添加回收率大于89.93%，表明該方法擁有良好的準(zhǔn)確性和精密度。微波消解-鉬銻抗光度法具有簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足蔬菜中總磷的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：微波消解；鉬銻抗比色法；蔬菜；總磷

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2017）12-0045-05

Abstract： A microwave digestion combined with molybdenum-antimony anti-spectrophotometric method is used for the determination of total phosphorus in vegetables. To get optimum test conditions， the parameters affecting the microwave digestion such as acid types， digestion time and temperature are optimized. Results show that HNO3 and H2O2（7∶1，ν/ν） are the best digestive acids， the digestion temperature is 180 ℃ and the time is 20 min. The effects of ultraviolet-visible wavelength and developing time on the test results are discussed and results show that 710 nm and 20 min are the optimum conditions. To evaluate the reliability of the method， two types of vegetable reference materials GBW 10048 and GBW 10049 are used for the analysis and verification of the method. Results show that tested values are in agreement with standard values， the relative standard deviation（RSD） is 0.884% and 0.938% and the fortified recovery is higher than 89.93%， showing the method has good accuracy and precision. Compared with the traditional method， the microwave digestion combined with molybdenum-antimony anti-spectrophotometric method is simple， rapid and environment-friendly and the method is suitable for the determination of total phosphorus in vegetables.

Keywords： microwave digestion； molybdenum antimony resistance colorimetric； vegetables； total phosphorus

0 引 言

磷作為人體核酸、輔酶、蛋白質(zhì)、核苷酸、磷脂等一系列重要物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組分，對(duì)生物體的遺傳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、能量供應(yīng)等起到不可或缺的作用[1]。人體中80%的磷存在于骨骼與牙齒，缺磷會(huì)引起骨骼和牙齒發(fā)育不正常、骨軟化、肌無(wú)力和佝僂病等癥狀[2-3]，醫(yī)學(xué)上常將鈣磷比值作為判斷軟骨癥的重要指標(biāo)，故保證人體的磷含量極為重要。人體中的磷主要是通過(guò)食品攝入，如蔬菜和魚等，加強(qiáng)對(duì)食品中磷含量的評(píng)價(jià)和監(jiān)督對(duì)磷元素的平衡攝入有重要意義，為此需要建立準(zhǔn)確、快速檢測(cè)食品中磷含量的方法。

目前，食品中磷的常規(guī)檢測(cè)方法為顯色法，分為鉬銻抗光度法、釩鉬黃光度法[4]和鉬藍(lán)分光光度法[5]3種。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1018——2006《蔬菜及其制品中磷的測(cè)定》中使用的是磷鉬藍(lán)分光光度法，然而此方法需使用高氯酸，若不慎“燒干”易發(fā)生爆炸，十分危險(xiǎn)，且方法中所用還原劑對(duì)苯二酚是劇毒物質(zhì)，對(duì)試驗(yàn)人員和環(huán)境均有著極大的傷害。相比于磷鉬藍(lán)分光光度法，磷釩鉬黃比色法則更加環(huán)保。向曉黎等[6]采用釩鉬黃比色法測(cè)定了食品中的磷含量，獲得了較好的準(zhǔn)確度和精密度。鉬銻抗比色法也常用于磷的測(cè)定，與釩鉬黃比色法相比存在一定的差異。李會(huì)娟[7]通過(guò)比較鉬銻抗光度法和釩鉬黃光度法檢測(cè)植物中的磷含量，發(fā)現(xiàn)鉬銻抗光度法適宜檢測(cè)磷含量較低的樣品，而釩鉬黃光度法適合測(cè)定磷含量較高的樣品。同樣盧超[8]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鉬銻抗比色法比磷釩鉬黃比色法能更加準(zhǔn)確測(cè)定濕地植物中的總磷含量。植物源性食品含磷一般較低，本文選用鉬銻抗光度法測(cè)定蔬菜中的全磷。

樣品的消解方法主要有干法消解、濕法消解和微波消解3種[9-10]，干法消解為傳統(tǒng)消解方式，操作簡(jiǎn)便，然而在高溫灰化過(guò)程中，會(huì)造成元素的揮發(fā)損失影響試驗(yàn)準(zhǔn)確度；濕法消解設(shè)備簡(jiǎn)單，且克服了干法消解的缺點(diǎn)，但此方法極易帶入污染物，且消化過(guò)程中的有毒氣體對(duì)操作人員的健康構(gòu)成威脅。微波消解是近些年興起的樣品前處理方法，因其是在封閉環(huán)境下消解，所以同時(shí)克服了干法消化元素?fù)p失和濕法消化易帶入污染物的缺點(diǎn)；其次，樣品在微波和高溫高壓同時(shí)作用下，消解速度大幅提高，被廣泛應(yīng)用于生物[11]、環(huán)境[12-13]、食品[9]、化工[14-15]等領(lǐng)域。Pedro等[16]建立了微波消解法測(cè)定魚類食品中的磷含量，Kumaravel等[17]采用微波消解法測(cè)定了雞蛋中的磷含量。本文采用微波消解技術(shù)-鉬銻抗光度法測(cè)定蔬菜中的全磷含量，探討該方法的準(zhǔn)確度和精密度，以期為蔬菜樣品中磷含量的檢測(cè)提供更加科學(xué)、環(huán)保的分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品：GBW 10048芹菜標(biāo)準(zhǔn)樣品，GBW 10049大蔥標(biāo)準(zhǔn)樣品，地球物理地球化學(xué)勘查研究所；土豆樣品購(gòu)買于大型菜市場(chǎng)。

儀器：UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）；Mars6型微波消解儀（美國(guó) CEM公司）；PURELAB FLEX實(shí)驗(yàn)室ELGA超純水機(jī)（萊特萊德北京純水設(shè)備技術(shù)股份有限公司）；AUX120電子天平（日本島津）。

試劑：硝酸、過(guò)氧化氫、氫氟酸、高氯酸、濃硫酸、酒石酸銻鉀和鉬酸銨，購(gòu)自長(zhǎng)沙唐華化工貿(mào)易有限公司；抗壞血酸，購(gòu)自湖北永發(fā)化工制造有限公司；磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL），購(gòu)于深圳普分科技有限公司；0.2%二硝基酚指示劑。試驗(yàn)中所用的水均為去離子水，試劑均為分析純。

1.2 磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和試劑的配制

鉬銻貯備液：量取濃硫酸126 mL，緩緩倒入約400 mL水中，攪拌冷卻。另稱取10.0 g鉬酸銨溶于約300 mL的熱水中，冷卻。然后將硫酸溶液緩緩倒入鉬酸銨溶液中，再加入質(zhì)量體積比為0.5%酒石酸銻鉀水溶液100 mL，冷卻后，用蒸餾水稀釋至1 L。

鉬銻抗顯色劑：稱取1.5 g抗壞血酸溶于100 mL上述鉬銻貯備液中，此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

磷標(biāo)準(zhǔn)使用液（5 μg/mL）：準(zhǔn)確移取2.5 mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至500 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試樣處理

新鮮土豆樣品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行洗凈、風(fēng)干和去皮，切成片狀后于80 ℃烘箱中24 h烘干，最后將土豆干樣置于塑料袋中待用。準(zhǔn)確稱取0.2 g（精確至0.000 1 g）干樣于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入7 mL硝酸和1 mL過(guò)氧化氫，旋緊蓋子，放入微波消解儀中，按照表1的消解條件進(jìn)行消解。消解完成后趕酸，待消解罐中無(wú)黃色氣體冒出時(shí)，取出冷卻，而后全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，去離子水定容待測(cè)；同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取5 μg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0.0，1.00，

2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00 mL至50 mL容量瓶中，加入5 mL鉬銻抗顯色劑，用水定容，即為含磷量0.0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 μg/mL的磷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在室溫條件下顯色20 min后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于710 nm波長(zhǎng)下比色，用空白溶液作為參比。最后以磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品的測(cè)定

吸取2.00 mL待測(cè)液于50 mL容量瓶中，加少量水至容量瓶，搖勻，然后加入二硝基酚指示劑2滴，用稀堿、濃堿和稀酸調(diào)節(jié)溶液至微黃色；加入鉬銻抗顯色劑5.00 mL，定容后于室溫條件下顯色20 min，按上述標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)步驟進(jìn)行比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的含磷量。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波消解條件的確定

2.1.1 消解用酸的種類和用量

硝酸是一種強(qiáng)氧化劑，在微波能量激發(fā)下有很理想的反應(yīng)能力[18]；氫氟酸可以有效破壞樣品中的SiO2晶格，釋放晶格中的組分[19]；過(guò)氧化氫的氧化性較強(qiáng)，與濃硝酸共用，可以大幅度提升氧化能力，且可以在消解完成后分解去除，以上3種無(wú)機(jī)酸被廣泛用于微波消解體系[18]。經(jīng)初步篩選，本文選用硝酸、過(guò)氧化氫、氫氟酸組合成3組不同酸系，對(duì)兩種蔬菜標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)，由于微波消解系統(tǒng)要求消解時(shí)溶劑量最少為8 mL，最多不超過(guò)30 mL，考慮到成本節(jié)約和環(huán)境保護(hù)，本文選擇消解酸用量為8 mL。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示使用7 mL硝酸+1 mL過(guò)氧化氫時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果最佳，故本文選擇7 mL硝酸+1 mL過(guò)氧化氫混合酸作為本試驗(yàn)的消解酸系。

2.1.2 消解溫度和保持時(shí)間

消解效率與消解溫度密切相關(guān)，消解溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致消解罐中反應(yīng)過(guò)于激烈，易發(fā)生沖破罐體的現(xiàn)象；而溫度太低，則使得樣品消解不完全，影響試驗(yàn)效率，故選擇合適的消解溫度至關(guān)重要。本試驗(yàn)采用三段控溫、多步驟方法進(jìn)行消解，并用單因子變量法對(duì)最高消解溫度進(jìn)行了分析討論。本文選擇160，

170，180 ℃作為最高消解溫度開(kāi)展了試驗(yàn)；試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，隨著最高消解溫度的升高，試驗(yàn)效率逐漸增加，至180 ℃時(shí)可以獲得很好的試驗(yàn)結(jié)果，故本文選用180 ℃作為試驗(yàn)的最高消解溫度。

影響消解效率的另一個(gè)重要因素是最高溫度保持時(shí)間，時(shí)間太短不足以完全消解樣品，太長(zhǎng)則浪費(fèi)資源，且長(zhǎng)時(shí)間的高溫、高壓會(huì)降低樣品消解罐的使用壽命。本文分別選擇10，15，20，25，30 min 5個(gè)不同保持時(shí)間進(jìn)行了討論，結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)保持時(shí)間從10 min增加到20 min時(shí)，消解效率不斷提高，而當(dāng)保持時(shí)間超過(guò)20 min后，試驗(yàn)結(jié)果變化不明顯，故本文選擇20 min作為保持時(shí)間。

2.2 顯色時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

本試驗(yàn)考察了顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響，選取3個(gè)不同濃度（0.10，0.30，0.50 μg/mL）的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色后每隔一段時(shí)間測(cè)定一次該溶液的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3，3個(gè)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度均在10～20 min之間有緩慢上升，繼續(xù)延長(zhǎng)顯色時(shí)間吸光度值變化不大，故本文選擇20 min作為試驗(yàn)的顯色時(shí)間。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

對(duì)磷顯色產(chǎn)物在550～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行了掃描。由圖4可以得知，磷顯色產(chǎn)物在710 nm和900 nm有吸收峰；但波長(zhǎng)大于800 nm時(shí)不在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，儀器信號(hào)不穩(wěn)定，沒(méi)有獲得良好的峰型，故本文選擇710 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 方法的線性、準(zhǔn)確度和精密度

本法在0～1.2 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 6，線性方程為y=0.542 3x-0.000 6。

為進(jìn)一步確認(rèn)本方法重復(fù)性和可靠性，本文選用芹菜標(biāo)準(zhǔn)樣品和大蔥標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，其結(jié)果見(jiàn)表3，測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)樣品要求范圍內(nèi)，說(shuō)明本方法具有較好的準(zhǔn)確度；試驗(yàn)所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.938%，重復(fù)性較好，說(shuō)明該方法具有良好的精密度。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

蔬菜樣品購(gòu)買于大型菜市場(chǎng)，利用本方法對(duì)實(shí)際蔬菜樣品黑土豆和白土豆進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，并設(shè)置高、中、低3個(gè)不同濃度，樣品連續(xù)測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果如表4所示，加標(biāo)回收率范圍分別在89.93%～98.24%和94.55%～98.24%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于2.53%，符合分析要求，說(shuō)明本方法能用于實(shí)際蔬菜樣品中磷的檢測(cè)。

3 結(jié)束語(yǔ)

本文將微波消解技術(shù)用于蔬菜中磷的檢測(cè)，取得了滿意的結(jié)果；此外，本研究選擇的硝酸-過(guò)氧化氫酸系為環(huán)境友好型酸系，減輕了消解樣品時(shí)對(duì)試驗(yàn)人員健康造成的威脅。由于試驗(yàn)條件有限，本文采用的磷檢測(cè)技術(shù)為傳統(tǒng)顯色方法，目前的分析技術(shù)大都傾向于采用更為先進(jìn)的儀器如感應(yīng)耦合電漿放射光譜儀（ICP-OES）或電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）等，然而這些大型儀器價(jià)格昂貴，并非所有的實(shí)驗(yàn)室都有配備，故采用顯色方法檢測(cè)磷更加經(jīng)濟(jì)，且更易于推廣和應(yīng)用。

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（編輯：莫婕）