黃志明 李晨曦 陳磊 江濤 蘇軍 岡義人 帥鵬

摘 要 為探究毛竹miRNA在種子萌發(fā)過(guò)程中相關(guān)調(diào)控機(jī)理，利用熒光定量和生物信息學(xué)技術(shù)分析毛竹中可能參與種子萌發(fā)調(diào)控的miRNA，并預(yù)測(cè)其潛在靶基因。并對(duì)毛竹種子萌發(fā)過(guò)程中胚芽萌發(fā)的不同階段的miRNA及其潛在靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示，毛竹4個(gè)miRNA基因（phe-miRNA156k、phe-miRNA159b、phe-miRNA160a 和phe-miRNA396e）在種子萌發(fā)至形成完整胚芽的3個(gè)階段中表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。通過(guò)miRNA及其靶基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)毛竹這4個(gè)miRNA潛在靶基因（phe-miRNA156-T1、phe-miRNA156-T2、phe-miRNA159-T1、phe-miRNA160-T1、phe-miRNA396-T1和phe-miRNA396-T2）的表達(dá)下調(diào)，而這些靶基因可能參與調(diào)節(jié)毛竹種子萌發(fā)、細(xì)胞分化和器官形成等過(guò)程。其中根中高表達(dá)的phe-miR396e隨著毛竹萌發(fā)而上調(diào)表達(dá)，其靶基因則表達(dá)下調(diào)，它可能通過(guò)抑制其2個(gè)生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白的靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)毛竹萌發(fā)過(guò)程的調(diào)控。由此表明，這4個(gè)毛竹miRNA在胚芽萌發(fā)過(guò)程可能具有重要作用，研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步發(fā)展毛竹分子育種提供一定理論參考。

關(guān)鍵詞 毛竹；miRNA；胚芽萌發(fā)

中圖分類號(hào) S795 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to study the role of microRNAs during the process of seed germination and embryo morphogenesis in moso bamboo[Phyllostachys edulis（Carr.）H. De Lehaie]， bamboo miRNAs and their putative targets were found and predicted through the bioinformatics analysis and RT-qPCR results. And the expression pattern of miRNA during different germination stages were analyzed and verified. The results showed that the phe-miRNA156k， phe-miRNA159b， phe-miRNA160a and phe-miRNA396e had a rising expression trend during three stages of the seed germination. Through the association analysis between miRNA and their targets， we found that the 4 miRNAs are mainly negatively regulate their potential target genes phe-miRNA156-T1， phe-miRNA156-T2， phe-miRNA159b-T1， phe-miRNA160-T1， phe-miRNA396-T1 and phe-miRNA396-T2. And these target genes were predicted to be probably participated in the progress of bamboo seed germination， cell differentiation and the formation of organs and other life activities. In addition， phe-miR396e that with a high expression level in root and its target genes showed simultaneous up- and down-regulation of expression during bamboo seed germination. Phe-miR396e maybe achieve control of the process of bamboo germination through inhibit its two target genes which related to growth factor. These results showed that these four miRNAs might plays an important role in bamboo germination and may provide reference for further studies of the bamboo molecular breeding.

Key words Moso bamboo（Phyllostachys edulis）； miRNA； embryo morphogenesis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.019

毛竹[Phyllostachys edulis（Carr.）H. De Lehaie]是禾本科竹亞科剛竹屬的一種散生竹種。其生長(zhǎng)快速、材性優(yōu)良、產(chǎn)量高、用途廣泛，是非常重要的森林非木質(zhì)利用資源。在我國(guó)，毛竹林面積占全國(guó)總竹林面積的約70%，是中國(guó)竹林中分布范圍最廣、面積最大的竹種[1-3]。毛竹的開花結(jié)實(shí)習(xí)性奇特，其開花周期長(zhǎng)、難以預(yù)測(cè)，終身開花一次并在種子發(fā)育成熟后死亡，且開花零散，自然結(jié)實(shí)率低，質(zhì)量差，種子壽命短[4-5]。由于毛竹種子采收難、保存難、發(fā)芽率低，使得利用種子培育實(shí)生苗的研究和應(yīng)用受到了很大的限制。因而，研究毛竹種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)和發(fā)育等過(guò)程中的相關(guān)機(jī)制，對(duì)毛竹育種和竹林培育具有重要意義。

種子在適宜條件下，幼胚恢復(fù)生長(zhǎng)，細(xì)胞基本代謝活動(dòng)開始運(yùn)轉(zhuǎn)，形成新的組織和器官，形態(tài)建成逐步完成[6]。從分子生物學(xué)角度來(lái)看，種子的萌發(fā)處處都受到相關(guān)基因的調(diào)控。開展種子萌發(fā)相關(guān)的分析特別是在分子層面進(jìn)行相關(guān)的研究，對(duì)于指導(dǎo)毛竹實(shí)生苗培育和造林工作具有良好的生產(chǎn)實(shí)踐意義和借鑒作用。

miRNA是一類約21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼小分子RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及一些病毒中[7]。miRNA主要通過(guò)堿基互補(bǔ)原則切割靶基因mRNA或抑制其翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控功能[8]。在植物體內(nèi)，miRNA對(duì)葉片形成，根系發(fā)育以及成花過(guò)程等發(fā)育過(guò)程起著重要的調(diào)控作用[9]。Wang等[10]在玉米中發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)的早期，miRNA166、miRNA156和miRNA528都呈現(xiàn)較高的表達(dá)量，可能調(diào)控種子的萌發(fā)過(guò)程[10]。同時(shí)，有研究報(bào)道，擬南芥miRNA159與種子萌發(fā)過(guò)程中ABA響應(yīng)的正向調(diào)控因子MYB33和MYB101在種子的休眠和萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)存在一定聯(lián)系[11]。miRNA396 （ath-miR396a-3p）則其主要通過(guò)抑制生長(zhǎng)調(diào)控因子的表達(dá)來(lái)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段的調(diào)控[12]。Hu等[13]對(duì)百脈根種子萌發(fā)時(shí)miRNA的表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，miR156、miR160和miR399的表達(dá)水平顯著升高，結(jié)合Martin等對(duì)西紅柿種子萌發(fā)的相關(guān)研究結(jié)果，可推斷出上述miRNA對(duì)種子萌發(fā)可能起到重要作用[13]。

近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)的興起使得大規(guī)模的發(fā)掘并鑒定毛竹miRNA成為可能。Xu等[14]利用高分辨率的測(cè)序接頭，在毛竹根和葉中鑒定并證實(shí)了5個(gè)新的miRNA。He等[15]在毛竹發(fā)育的莖中進(jìn)行miRNA研究，鑒定出大量可能參與速生過(guò)程的miRNA基因。Gao等[16]通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)毛竹不同開花時(shí)期的miRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)毛竹miRNA在花發(fā)育過(guò)程中的作用。王麗麗等[17]發(fā)現(xiàn)毛竹miR164b對(duì)靶基因PeNAC1的調(diào)控，與毛竹在應(yīng)對(duì)不同非生物脅迫過(guò)程密切相關(guān)。而且毛竹miR397 和miR1432 隨著光照、干旱等脅迫以及激素（ABA 和GA3）處理響應(yīng)表達(dá)，這些miRNA可能在毛竹應(yīng)對(duì)非生物脅迫中起重要作用[18]。這些毛竹miRNA的發(fā)掘和鑒定為本研究提供可靠的基礎(chǔ)。

本研究主要關(guān)注miR156、miR159、miR160和miR396這4個(gè)miRNA及其靶基因在毛竹種子萌發(fā)過(guò)程中胚芽?jī)?nèi)的表達(dá)情況。同時(shí)研究毛竹實(shí)生苗根莖葉三部位中這4個(gè)miRNA及其靶基因的表達(dá)水平情況。初步探究毛竹胚芽萌發(fā)、生長(zhǎng)過(guò)程相關(guān)響應(yīng)的miRNA及其靶基因可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省林業(yè)科學(xué)院提供的當(dāng)年采收的毛竹種子為材料，毛竹種子剝?nèi)シN殼，用清水浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗2 h去除殘留雜質(zhì)，然后用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒1 h，蒸餾水沖洗干凈后置于無(wú)菌濾紙上，以適量蒸餾水在黑暗條件下進(jìn)行萌發(fā)，每日觀察記錄毛竹種子萌發(fā)狀態(tài)。依據(jù)種子胚芽萌發(fā)的狀態(tài)將毛竹種子的萌發(fā)過(guò)程分為胚芽萌發(fā)第1階段（7 d）、胚芽萌發(fā)第2階段（15 d）和胚芽萌發(fā)第3階段（21 d）。分別取3個(gè)萌發(fā)階段完整的毛竹胚芽，迅速置于液氮中冷凍，然后-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 miRNA成熟體序列獲得 通過(guò)同源序列比對(duì)并參考現(xiàn)有毛竹miRNA研究[19]，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)BambooGDB： Bamboo Genome Database（http：//www.bamboogdb.org/）中獲取miRNA成熟體序列，篩選所得miRNA序列為：phe-miR156k：5'- UUGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3'；phe-miR159b：5'-UUGGAUUGAAGGGAGCUCUC-3'；phe-miR160a：5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA-3'；phe-miR396e：5'-UCCACAGGCUUUCUUGAACUG-3'。

1.2.2 miRNA前體及啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)分析 用miRNA成熟序列比對(duì)毛竹的基因組序列，利用在線預(yù)測(cè)軟件RNAfold（http：//www.tbi.univie.ac.at/RNA/）預(yù)測(cè)分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，得出毛竹4個(gè)miRNA成熟體的前體序列。從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)上下載前體序列的上游1 500 bp序列，利用在線平臺(tái)Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行前體上游啟動(dòng)子區(qū)的作用元件及其功能預(yù)測(cè)分析。

1.2.3 miRNA 靶基因預(yù)測(cè) 利用植物小RNA靶基因分析服務(wù)器psRNATarget將4個(gè)毛竹miRNA 成熟體序列（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/），與毛竹CDS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。運(yùn)算中的最大期望值（Maximum expectation）設(shè)置為3，其他值設(shè)為默認(rèn)值進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)。從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載潛在靶基因序列，分析miRNA對(duì)潛在靶基因的靶標(biāo)作用位點(diǎn)及靶基因主要結(jié)構(gòu)和功能。

1.2.4 miRNA成熟體和靶基因的qRT-PCR定量分析 用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根）提取毛竹種子萌發(fā)過(guò)程3個(gè)時(shí)期的胚芽樣品總RNA，操作步驟參照說(shuō)明書。用超微分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。將總RNA用Mir-X miRNA First-strand synthesis Kit試劑盒加PolyA尾并反轉(zhuǎn)錄（Clontech）獲取cDNA，將cDNA稀釋10倍后用于miRNA定量分析。反向引物用試劑盒中提供的通用引物，正向引物分別為：phe-miR156k： 5'-TTGACAGAAGAGAGTGAGCAC-3'；phe-miR159b：5'-TTGGATTGAAGGGAGCTCTC-3'；phe-miR160a：5'-TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA-3'；phe-miR396e：5'-TCCACAGGCTTTCTTGAACTG-3'，選擇U6作為內(nèi)參基因。

對(duì)于miRNA靶基因的反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)總RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作方法參考說(shuō)明書。選擇TIP41為內(nèi)參基因[20]。應(yīng)用定量引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站Primer3web： （http：//bioinfo. ut.ee/primer3/）設(shè)計(jì)檢測(cè)miRNA靶基因表達(dá)量的引物（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量用的GoTaqR qPCR Master Mix（美國(guó)Promega）試劑盒在ABI-Q6儀器上進(jìn)行定量分析。參照說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)體系配制，每個(gè)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2010和Spss 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括采用公式RQ=2-ΔΔCT進(jìn)行miRNA及其可能靶基因相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算分析，采用雙變量相關(guān)模式分析，選擇Pearson相關(guān)指數(shù)和Spearman 相關(guān)系數(shù)同時(shí)進(jìn)行4個(gè)miRNA及其對(duì)應(yīng)靶基因的表達(dá)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹種子胚芽萌發(fā)過(guò)程中miRNA的表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)毛竹種子胚芽萌發(fā)3個(gè)不同階段（7、15和21 d）的4個(gè)miRNA表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示它們表達(dá)水平總體都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖1）。其中，胚芽中的phe-miR156k和phe-miR160a的表達(dá)量在15 d時(shí)達(dá)到最高值，種子萌發(fā)的15 d到21 d期則略微有所下降。而胚芽中的phe-miR159b和在種子萌發(fā)15 d期，相較于萌發(fā)初期（7 d期），表達(dá)水平有明顯的升高。它們?cè)谶_(dá)到15 d期后總的表達(dá)量變化就呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定。而phe-miR396e在毛竹種子胚芽萌發(fā)期間，表達(dá)水平一直呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)，且直到21 d時(shí)才達(dá)到表達(dá)峰值。結(jié)果顯示，在毛竹萌發(fā)時(shí)，這4個(gè)miRNA的表達(dá)量隨著種子的萌發(fā)上調(diào)，該結(jié)果顯示它們可能參與毛竹萌發(fā)過(guò)程基因的調(diào)控。

2.2 miRNA 啟動(dòng)子序列分析

過(guò)啟動(dòng)子分析軟件，對(duì)4個(gè)miRNA的34個(gè)不同前體的上游啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)順式調(diào)控元件進(jìn)行分析（表2）。4個(gè)miRNA的潛在前體上游調(diào)控區(qū)均含有啟動(dòng)子基本作用元件，如TATA-box，CAAT-box。同時(shí)預(yù)測(cè)到的前體上游調(diào)控區(qū)存在調(diào)控分生組織發(fā)育、胚乳表達(dá)等相關(guān)的作用元件，以及光、激素響應(yīng)相關(guān)的作用元件。其中，phe-miR159b的前體序列上游存在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的作用元件，phe-miR160a中則存在種子特異性相關(guān)的作用元件。

2.3 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

4個(gè)miRNA預(yù)測(cè)并根據(jù)錯(cuò)配值大小等條件優(yōu)先篩選到8個(gè)靶基因（表3）。其中，phe-miR156k的靶基因是2個(gè)SBP家族的基因，功能預(yù)測(cè)顯示其主要參與植物花的形成和后期發(fā)育[21]。Phe-miR159b 的1個(gè)潛在靶基因是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的基因，還預(yù)測(cè)到1個(gè)與種子萌發(fā)代謝相關(guān)的磷脂酶C相關(guān)的基因；phe-miR396e的2個(gè)靶基因具有生長(zhǎng)調(diào)控因子的功能，預(yù)測(cè)顯示主要參與葉片和根系的發(fā)育形成。phe-miR160a的2個(gè)靶基因具有響應(yīng)生長(zhǎng)素的功能。

2.4 毛竹種子胚芽萌發(fā)過(guò)程中miRNA靶基因的表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了所預(yù)測(cè)到的8個(gè)靶基因在毛竹胚芽萌發(fā)過(guò)程中的3個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)分析。在這8個(gè)靶基因中，只有2個(gè)基因（phe-miR159-T2和phe-miR160-T2）在萌發(fā)過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，而其他6個(gè)miRNA的相應(yīng)靶基因則是下調(diào)表達(dá)。靶基因phe-miR159b-T2在15 d時(shí)開始響應(yīng)萌發(fā)過(guò)程，而phe-miR160-T2在7 d時(shí)已經(jīng)開始上調(diào)表達(dá)。在6個(gè)下調(diào)表達(dá)的靶基因中，有2個(gè)靶基因（phe-miR156-T2和phe-miR160-T1）是隨著萌發(fā)的整個(gè)過(guò)程下調(diào)表達(dá)。而其他4個(gè)下調(diào)的靶基因則是在7 d期開始下調(diào)表達(dá)，而到15 d期表達(dá)則趨于平穩(wěn)直至21 d期（圖2）。

胚芽萌發(fā)的3個(gè)時(shí)期miRNA的表達(dá)分析可發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量的變化總體呈一定的趨勢(shì)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在毛竹種子萌發(fā)過(guò)程中，4個(gè)miRNA在胚芽的表達(dá)水平和它們的潛在靶基因的表達(dá)水平總體上（5/8）是呈顯著負(fù)相關(guān)（表4），而其中的phe-miR159-T2和phe-miR160-T2兩個(gè)miRNA和靶基因?qū)Σ环县?fù)相關(guān)特征。結(jié)合Pearson相關(guān)性指數(shù)和spearman相關(guān)性指數(shù)分析，phe-miR159與其潛在靶基因phe-miR159-T1的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí)，phe-miR156與其2個(gè)潛在靶基因以及phe-miR396與潛在靶基因phe-miR396-T1、phe-miR396-T2的表達(dá)水平之間的相關(guān)性也較為顯著。

毛竹生長(zhǎng)過(guò)程中，種子萌發(fā)，發(fā)育，生長(zhǎng)、各細(xì)胞分化形成不同組織器官，長(zhǎng)成毛竹實(shí)生苗。其中，具有豐富居間分生組織的毛竹莖和主要進(jìn)行光合作用的毛竹葉子，以及不斷向地下延生快速生長(zhǎng)的毛竹根系是毛竹實(shí)生苗的三大重要部位。

2.5 毛竹實(shí)生苗不同部位miRNA的表達(dá)

4個(gè)miRNA在毛竹的根、莖、葉3個(gè)不同部位的表達(dá)水平都呈現(xiàn)差異，其中葉片中4個(gè)miRNA的表達(dá)水平差異最為顯著（圖3）。phe-miR396e在3個(gè)部位中都具有最高的表達(dá)水平。同時(shí)，同一個(gè)miRNA在毛竹實(shí)生苗的不同組織中的表達(dá)水平也呈現(xiàn)差異。phe-miR156k和phe-miR159b的表達(dá)水平在莖中表達(dá)量最低，而phe-miR160a和phe-miR396e的表達(dá)水平于葉中最低，4個(gè)miRNA的表達(dá)量在毛竹實(shí)生苗的根中呈最高值。

3 討論

毛竹產(chǎn)量的需求日益增大使得人們對(duì)毛竹發(fā)育生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制越來(lái)越重視，這是培育高產(chǎn)、速生毛竹品種的前提條件之一。本研究對(duì)毛竹4個(gè)miRNA的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)它們?cè)诿劝l(fā)過(guò)程中，根中的表達(dá)量均高于在莖和葉中的表達(dá)量。這可能與生長(zhǎng)初期毛竹需要集中大量能量來(lái)生根有一定的關(guān)系，深入土壤的扎根有利于葉片及植株整體對(duì)于土壤無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)的獲取。而經(jīng)預(yù)測(cè)這4個(gè)miRNA與根生長(zhǎng)具有一定的關(guān)系。例如在根中高表達(dá)量的miR396的擬南芥同源基因參與根中干細(xì)胞和增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)換過(guò)程，在根中具有重要的調(diào)控功能[22]。

對(duì)于4個(gè)miRNA啟動(dòng)子分析中發(fā)現(xiàn)含有大量與GA3、ABA、生長(zhǎng)素等激素及植物分生、分化相關(guān)的作用元件。這表明它們?cè)诿裆L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能參與到激素的調(diào)控過(guò)程。在擬南芥中，miR159被證實(shí)受到ABA的誘導(dǎo)而表達(dá)，并在種子萌發(fā)過(guò)程中調(diào)控下游靶基因MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[11]。本研究中毛竹phe-miR159b啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)可能的ABA響應(yīng)元件且在種子萌發(fā)中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明毛竹phe-miR159b可能也在毛竹種子受ABA調(diào)控的過(guò)程中起一定的調(diào)控作用。

植物miRNA的表達(dá)具有一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通常是抑制其靶基因的表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。miR156表達(dá)水平在胚芽發(fā)育中后期顯著上升，其靶基因phe-miR156-T1和phe-miR-156-T2都呈表達(dá)水平下降趨勢(shì)，miRNA和靶基因的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。擬南芥miR156通過(guò)調(diào)控SPL3的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)幼體到成體的轉(zhuǎn)變[23]，而本研究中miR156也與毛竹SPL家族的2個(gè)靶基因在表達(dá)趨勢(shì)上具有一定的相關(guān)性。通過(guò)功能預(yù)測(cè)分析顯示，phe-miRNA159b 的潛在靶基因phe-miR159-T2是磷酸酯酶C相關(guān)的基因，其表達(dá)水平在胚芽生長(zhǎng)第3階段明顯上升，phe-miRNA159b可能通過(guò)正向調(diào)控作為漿胞膜上的關(guān)鍵酶的基因，從而對(duì)細(xì)胞的分裂和細(xì)胞的代謝活動(dòng)進(jìn)行產(chǎn)生重要意義。毛竹胚芽發(fā)育過(guò)程中，phe-miRNA396e基因的表達(dá)水平不斷增加，其兩個(gè)靶基因的表達(dá)水平都呈現(xiàn)與miRNA成熟體表達(dá)水平的顯著負(fù)相關(guān)。這種表達(dá)模式與目前大部分基于miR396的研究結(jié)果相似。在葉子發(fā)育中miR396的表達(dá)量隨葉齡的增長(zhǎng)而增加[22]。且有研究表明miR396通過(guò)負(fù)調(diào)控GRF，抑制細(xì)胞分裂由此調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[24-26]。

在本研究中有兩個(gè)靶基因與其上游miRNA的表達(dá)模式一致，同時(shí)在毛竹萌發(fā)過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果并未符合傳統(tǒng)的miRNA表達(dá)上調(diào)后會(huì)使其靶基因相應(yīng)的表達(dá)下調(diào)，這可能是由于miRNA在對(duì)部分靶基因調(diào)控是只是起微調(diào)的作用或者是由于其對(duì)靶基因調(diào)控上起到增強(qiáng)子調(diào)節(jié)器的作用[27]。

綜上，通過(guò)初步對(duì)4個(gè)毛竹miRNA表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們可能參與到毛竹種子萌發(fā)過(guò)程，但仍需要對(duì)它們靶基因的功能驗(yàn)證進(jìn)行深入分析。本研究中發(fā)現(xiàn)phe-miR396e在根中高表達(dá)且隨著毛竹萌發(fā)而上調(diào)表達(dá)，它可能通過(guò)抑制其兩個(gè)生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白的靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)毛竹萌發(fā)過(guò)程的調(diào)控。越來(lái)越多的miRNA在毛竹種子萌發(fā)過(guò)程的深入研究，將有可能揭示其內(nèi)在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將使得毛竹的分子育種成為可能。

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