球孢白僵菌侵染對(duì)家蠶抗氧化水平的影響

王樹(shù)昌 赫榮帆 陸敏泉 黃華平 王娜玉 郭錫杰 耿濤

摘 要 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種廣譜性、強(qiáng)致病性的病原真菌，然而其致病機(jī)制尚不明確，進(jìn)一步闡釋球孢白僵菌尤其是球孢白僵菌毒素的致病機(jī)制，對(duì)生防應(yīng)用和病害防控具有重要意義。本研究檢測(cè)了家蠶幼蟲(chóng)自然感染球孢白僵菌和注射球孢白僵菌毒素以及家蠶細(xì)胞添加毒素后，幼蟲(chóng)存活率、家蠶組織和細(xì)胞的總抗氧化活力、SOD和CAT酶活性及相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，家蠶2齡幼蟲(chóng)感染白僵菌后期（33～48 h），5齡幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌后期（48～72 h），5齡幼蟲(chóng)和BmN細(xì)胞注射（添加）球孢白僵菌毒素24 h后，家蠶血淋巴、脂肪體、中腸和馬氏管組織、BmN細(xì)胞總抗氧化活力、SOD和CAT酶活性顯著降低；脂肪體、中腸、馬氏管組織和BmN細(xì)胞中Bmsod和Bmcat基因表達(dá)水平在感染后期和添毒后顯著下調(diào)表達(dá)；球孢白僵菌毒素能夠誘導(dǎo)家蠶BmN細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)并最終凋亡崩解；家蠶幼蟲(chóng)添加外源SOD和CAT等抗氧化劑后，能顯著提高家蠶的存活時(shí)間。以上結(jié)果說(shuō)明，球孢白僵菌侵染家蠶后，可能通過(guò)分泌毒素攻擊脂肪體、中腸和馬氏管細(xì)胞，下調(diào)Bmsod和Bmcat基因的表達(dá)，降低機(jī)體的總抗氧化能力，破壞家蠶的氧化還原平衡，損傷組織器官功能并最終導(dǎo)致家蠶死亡；同時(shí)破壞家蠶免疫系統(tǒng)，獲得免疫逃逸，以利于菌絲生長(zhǎng)、繁殖。

關(guān)鍵詞 球孢白僵菌；家蠶；真菌毒素；SOD；CAT

中圖分類號(hào) S884 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Beauveria bassiana， a broad-spectrum entomopathogenic fungi with the strong pathogenicity. However， the pathogenic mechanism of B. bassiana was still need to be specifyied the pathogenic mechanism of B. bassiana especially the Beauveria toxins have the important significance for the study on bio-control and disease resistance. In this paper， the total antioxidant activity， SOD（Superoxide dismutase）activity， CAT（Catalase）activity and expression levels of Bmsod and Bmcat genes in hemolymph， midgut， fat body and malpighian tubule of silkworm larvae infected with B. bassiana and injected with Beauveria toxins were examined. In addition， the effects of SOD， CAT and Beauveria toxins on the survival rates of silkworm larvae infected with B. bassiana were also examined. Further more， cellular injury of BmN caused by Beauveria toxins were detected. The results showed that total antioxidant activity， SOD activity， CAT activity and expression levels of antioxidant genes（Bmsod and Bmcat）in 2 instar silkworm larvae（especially from 33 hours to 48 hours post infection with B. bassiana）， in midgut， fat body and malpighian tubule of 5 instar silkworm larvae（especially from 48 hours to 72 hours post infection with B. bassiana and 48 hours after injected with Beauveria toxins）， and in BmN cells（24 hours after injected with Beauveria toxins） reduced. In addition， Beauveria toxins could induce the agglutination of BmN cells and finally encourage apoptosis and disintegration. Furthermore， the exogenous antioxidants（SOD and CAT）could relieve the damage caused by Beauveria toxins. The results above indicated that B. bassiana might secrete toxins， which would attack the fat body， midgut and malpighian tubules of silkworm and down-regulate the expression levels of Bmsod and Bmcat genes， decreased the total antioxidant capacity and disrupt the balance of antioxidant system， which causing function injury of silkworm tissue or organ and lead to the death eventually. Besides， Beauveria toxins might destructed the immune system of silkworm in order to obtain immune escape， which was conducive to mycelial growth and reproduction.

Key words Beauveria bassiana； Bombyx mori； Beauveria toxins； superoxide dismutase； catalase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.023

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）具有寄主范圍廣、致病性強(qiáng)、易于培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，是研究最早和應(yīng)用最廣的生防菌種之一[1-2]。同時(shí)，球孢白僵菌可以感染家蠶（Bombyx mori）、蜜蜂等經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，導(dǎo)致僵病發(fā)生而給相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成重大損失[3-4]。然而球孢白僵菌侵入宿主導(dǎo)致宿主死亡的機(jī)制尚不清楚，不僅影響了球孢白僵菌作為生防制劑的生態(tài)效益，也限制了經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)防病措施的研究。

昆蟲(chóng)病原真菌菌絲突破體壁或消化管道等屏障進(jìn)入宿主體內(nèi)后，產(chǎn)生芽生孢子，進(jìn)而發(fā)育成芽生菌絲，而后菌絲大量快速增殖，競(jìng)爭(zhēng)性消耗宿主的營(yíng)養(yǎng)成分，并在感染宿主的中后期入侵并破壞宿主的組織、器官，使組織細(xì)胞發(fā)生病變、萎縮、凋亡，引起組織損傷和功能紊亂，最終導(dǎo)致宿主營(yíng)養(yǎng)枯竭而死亡[2，5]。而近年來(lái)一些研究表明，白僵菌毒素可能是導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡的主要原因[6-7]。已發(fā)現(xiàn)和鑒定的球孢白僵菌毒素有白僵素（beauverin，環(huán)狀三羧酸肽）、卵孢霉素（2，2'，5，5'-tetrahydroxy-4，4'-ditoluquinone）、白僵菌交酯（beauve rolide）和球孢交酯（bassianolide）等[8]。真菌毒素能夠攻擊宿主昆蟲(chóng)的脂肪體、馬氏管、腸等組織，妨礙正常生理功能，抑制宿主免疫反應(yīng)，直至宿主死亡[9]。但白僵菌毒素對(duì)宿主昆蟲(chóng)的作用機(jī)制尚不清楚。

家蠶是人類長(zhǎng)期馴化和飼育的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)之一，為鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物，飼育方便，生理、遺傳背景的研究比較深入，是研究宿主-病原互作機(jī)制的理想材料[10-11]。本實(shí)驗(yàn)以家蠶和球孢白僵菌為實(shí)驗(yàn)材料，分別檢測(cè)了家蠶2齡和5齡幼蟲(chóng)組織感染球孢白僵菌后抗氧化水平和相關(guān)基因表達(dá)水平的變化；還檢測(cè)了注射毒素和外源抗氧化劑，對(duì)家蠶5齡幼蟲(chóng)存活率、抗氧化活力和相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，以及毒素對(duì)家蠶BmN細(xì)胞的損傷作用。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明球孢白僵菌毒素對(duì)家蠶氧化還原平衡的影響，進(jìn)一步明確球孢白僵菌對(duì)宿主昆蟲(chóng)的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶p50（大造）品系由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所家蠶種質(zhì)資源庫(kù)提供；球孢白僵菌HN6菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所家蠶生理病理研究室從自然發(fā)病的蠶體上分離、鑒定和保存。

PCR試劑盒、RNApure ultrapure total RNA extraction kit（RN0302）、qRT-PCR kit、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自博凌科為生物科技有限公司。Total Antioxidant Capacity Assay（FRAP method）、Total SOD activity assay kit（WST-8 method）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。Total CAT activity assay kit（UV method）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。PrimeScript RT PCR kit購(gòu)自寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 球孢白僵菌侵染家蠶 家蠶p50幼蟲(chóng)飼育至2齡和5齡起蠶，浸沒(méi)于球孢白僵菌孢子懸液（1×108個(gè)/mL） 10 s接種，以浸沒(méi)無(wú)菌水為對(duì)照組。200頭2齡蠶幼蟲(chóng)為1組，做2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，溫度（25±1） ℃和95%濕度條件下取新鮮桑葉飼育幼蟲(chóng)。每3 h，取5頭家蠶為1個(gè)樣本，液氮速凍，-80 ℃保存。100頭5齡蠶為1組，每組做2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每隔6 h，選取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組家蠶各5條，解剖家蠶，分別采集各組織樣本，液氮速凍后于 -80 ℃保存。

1.2.2 提取球孢白僵菌毒素和注射家蠶幼蟲(chóng)以及添毒BmN細(xì)胞 1 L SMAY發(fā)酵液，濾紙抽濾和離心后，上清液即為毒素代謝物粗提液。采用活性炭吸附法提取球孢白僵菌毒素[12-13]。將毒素粗提物溶解于1 mL 0.04 mol/L pH6.6磷酸緩沖液。

取5齡第2天幼蟲(chóng)，用微量注射器吸取上述毒素溶液，按照5 μL/頭 注射家蠶幼蟲(chóng)，以注射0.04 mol/L pH6.6磷酸緩沖液為對(duì)照組。選取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組家蠶各5條，解剖家蠶，分別采集各組織樣本，液氮速凍后于-80 ℃保存。

選擇細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好的家蠶BmN細(xì)胞，傳代培養(yǎng)于6孔板中；24 h后，細(xì)胞貼壁率達(dá)到70%左右，每日向培養(yǎng)室內(nèi)加入20 μL（體積比1%）球孢白僵菌毒素，輕輕混勻；添加毒素后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部變化并拍照記錄。添毒24 h后，收集細(xì)胞，-80 ℃保存。

1.2.3 總抗氧化活力、SOD和CAT酶活力的檢測(cè)

取家蠶2齡幼蟲(chóng)、5齡幼蟲(chóng)組織和BmN細(xì)胞樣本，分別加入1 mL預(yù)冷的0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液，冰浴中研磨勻漿，4 ℃，1 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至干凈無(wú)菌的EP管中即為粗酶液。分別按BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、Total Antioxidant Capacity Assay（FRAP method）、Total SOD activity assay kit（WST-8 method）和Total CAT activity assay kit（UV method）說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各處理組樣品中蛋白含量和抗氧化活力。蠶體和組織樣品酶活力用U/mg蛋白表示，血液樣品酶活力用U/mL表示。

1.2.4 球孢白僵菌毒素對(duì)家蠶幼蟲(chóng)存活率的影響

從冰箱取出SOD和CAT，用0.5 mL 0.15 mol/L NaCl溶液溶解，分別制備6 000 U/mL的SOD溶液和0.1 g/mL的CAT溶液，作為外源抗氧化劑。取5齡第2天幼蟲(chóng)，每頭幼蟲(chóng)注射1 μL孢子懸液（1×108個(gè)/mL）以接種球孢白僵菌，培養(yǎng)6 h后，分別注射3 μL毒素、3 mL SOD溶液、3 μL CAT溶液、3 μL毒素+SOD溶液、3 μL毒素+CAT溶液。取新鮮桑葉在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼育幼蟲(chóng)，每小時(shí)記錄幼蟲(chóng)的死亡數(shù)，計(jì)算存活率，繪制存活率曲線。

1.2.5 RNA提取和cDNA合成 總RNA的提取以及基因組DNA的去除按照超純總RNA提取試劑盒DNA消解說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2 μg總RNA加入到20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按照PrimeScript RT PCR kit說(shuō)明書(shū)合成cDNA，于-20 °C保存。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)NCBI登錄的Bmsod基因、Bmcat基因和家蠶管家基因Bmactin 3的cDNA序列，用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，序列見(jiàn)表1，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行引物合成。

按照qRT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系：2 × SYBR Premix 10 μL，F(xiàn)引物0.4 μL，R引物0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。三步PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。用2-△△CT method[14]計(jì)算不同樣本中Bmsod和Bmcat的表達(dá)模式。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SSPS 19.0分析軟件中χ2檢驗(yàn)檢測(cè)處理組間的差異顯著性（p<0.05為差異顯著，標(biāo)注“*”，p<0.01為差異極顯著，標(biāo)注“**”）；應(yīng)用Probit回歸計(jì)算各處理組的LT50及95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶2齡幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌后抗氧化水平的變化

總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力是抗氧化水平的重要檢測(cè)指標(biāo)。2齡蠶酶活檢測(cè)結(jié)果表明，家蠶感染球孢白僵菌后總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力在感染過(guò)程中略有升高，而在感染后期則顯著下降，分別下降81.6%、83.3%和85.5%（圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明2齡家蠶感染球孢白僵菌后期機(jī)體的抗氧化平衡遭到破壞。

定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bmsod基因在球孢白僵菌侵染家蠶早期（12～18 h），表達(dá)水平開(kāi)始下調(diào)，最高下調(diào)約7倍，而后恢復(fù)正常水平；但是在侵染后期（約33 h-家蠶死亡）則顯著下調(diào)表達(dá)，最高下調(diào)約90倍（圖2-A）；而B(niǎo)mcat基因在球孢白僵菌侵染家蠶早期（6～12 h）上調(diào)表達(dá)（約上調(diào)6倍），在感染后期（約36 h-家蠶死亡），則顯著下調(diào)表達(dá)（圖2-B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明球孢白僵菌在感染家蠶過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)節(jié)家蠶SOD、CAT等抗氧化酶基因的表達(dá)水平來(lái)影響家蠶的抗氧化體系。

2.2 家蠶5齡幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌后組織中抗氧化水平的變化

為進(jìn)一步說(shuō)明球孢白僵菌對(duì)家蠶抗氧化體系的作用，分析了家蠶不同器官、組織中抗氧化水平的變化。結(jié)果表明，家蠶感染球孢白僵菌后，血淋巴、脂肪體、中腸和馬氏管組織中總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力均在感染初期略有升高（36～42 hpi），而后顯著降低（48～72 hpi）（圖3）。血淋巴總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力均高于其他組織，其抗氧化活力對(duì)維持家蠶抗氧化平衡至關(guān)重要；而感染白僵菌后3個(gè)抗氧化指標(biāo)分別下降76.1%（降幅188.3 U/mL）、84.0%（降幅184.7 U/mL）、73.6%（降幅187 U/mL）。脂肪體是家蠶重要的免疫和解毒器官，其中CAT酶活力下降幅度最大，下降77.7%（降幅146 U/mg）。中腸組織中總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力均低于其他組織，而且白僵菌侵染后，酶活力下降幅度也低于其他組織，分別下降69.2%（降幅108.9 U/mg）、74.9% （降幅80.9 U/mg）、54.2%（降幅46.1 U/mg）。馬氏管是重要的排泄器官，能夠有效的排除多余的有毒有害物質(zhì)；感染白僵菌后，其總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力也顯著降低，分別下降76.8% （降幅124.6 U/mg）、79.3%（降幅97.4 U/mg）、79.1% （降幅150.3 U/mg）。以上結(jié)果說(shuō)明，白僵菌侵染家蠶后可能對(duì)家蠶各器官、組織造成損傷，嚴(yán)重破壞了家蠶的抗氧化平衡。

Bmsod和Bmcat是家蠶重要的抗氧化基因。白僵菌感染家蠶之后，Bmsod和Bmcat在脂肪體、中腸和馬氏管組織中均顯著下調(diào)表達(dá)，而在血淋巴中表達(dá)水平基本不變（圖4）。Bmsod基因表達(dá)水平在脂肪體、中腸和馬氏管組織中分別從48、54和60 hpi開(kāi)始顯著下調(diào)，下調(diào)約49.1倍、48.62倍和68.9倍。Bmcat基因在脂肪體、中腸和馬氏管組織中分別從54、42、48 hpi開(kāi)始顯著下調(diào)表達(dá)，分別下調(diào)約36.2倍、29.8倍和38.5倍。以上結(jié)果說(shuō)明，白僵菌侵染能夠調(diào)節(jié)家蠶脂肪體、中腸和馬氏管組織中抗氧化基因的表達(dá)水平，進(jìn)而破壞抗氧化體系。

2.3 注射球孢白僵菌毒素對(duì)家蠶幼蟲(chóng)組織抗氧化水平的影響

家蠶5齡幼蟲(chóng)注射球孢白僵菌毒素后，血淋巴中和脂肪體中總抗氧化活力、SOD酶活力和CAT酶活力下降幅度較大，中腸和馬氏管中3種抗氧化指標(biāo)也有所下降（圖5）。因此說(shuō)明球孢白僵菌毒素是導(dǎo)致家蠶抗氧化體系破壞的主要因素。實(shí)時(shí)定量結(jié)果表明，注射毒素后，血淋巴中Bmsod基因和Bmcat基因表達(dá)水平基本不變；Bmsod在脂肪體、中腸和馬氏管中均下調(diào)表達(dá)；而B(niǎo)mcat基因在脂肪體中下調(diào)表達(dá)，而在中腸和馬氏管組織中顯著下調(diào)表達(dá)（圖6）。說(shuō)明球孢白僵菌毒素能夠影響脂肪體、中腸和馬氏管的抗氧化基因的表達(dá)，破壞這些器官的解毒和抗氧化功能。

2.4 體腔注射白僵菌毒素和外源抗氧化劑對(duì)家蠶幼蟲(chóng)存活率的影響

SOD和CAT能夠結(jié)合并消除機(jī)體內(nèi)的活性氧、過(guò)氧化物質(zhì)等自由基，維持機(jī)體正常生理機(jī)能，是常見(jiàn)的天然抗氧化劑。存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖7），正常感染組所有家蠶幼蟲(chóng)在61 h全部死亡；注射毒素后，家蠶幼蟲(chóng)在56 h全部死亡，存活率曲線明顯左移，說(shuō)明添加毒素能夠加速染病幼蟲(chóng)死亡；注射SOD和CAT外源抗氧化劑后，家蠶幼蟲(chóng)分別在添毒后69 h和65 h才全部死亡，存活率曲線比對(duì)照組顯著右移，說(shuō)明添加外源抗氧化劑能夠延緩染病幼蟲(chóng)的死亡；而注射“毒素+SOD”和“毒素+CAT”后，家蠶幼蟲(chóng)分別在添毒后58 h和57 h全部死亡，存活率曲線較注射毒素組向右偏移，說(shuō)明添加外源抗氧化劑能夠消除毒素對(duì)蠶體的損傷作用。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS19.0軟件的Probit回歸計(jì)算出各處理組的半數(shù)致死時(shí)間（LT50）（表2）。表2的數(shù)據(jù)說(shuō)明，添加外源抗氧化劑均能消除毒素的損傷作用而延長(zhǎng)LT50，其中SOD的作用（延長(zhǎng)約6 h）強(qiáng)于CAT的作用（延長(zhǎng)約2 h）。

2.5 毒素對(duì)家蠶細(xì)胞的影響

生命代謝的功能單位是細(xì)胞。向BmN細(xì)胞中添加球孢白僵菌毒素，觀察毒素對(duì)家蠶細(xì)胞的損傷情況。添加白僵菌毒素后，家蠶BmN細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，胞質(zhì)內(nèi)液泡顯著增加，最終全部崩解（圖8）。此外，細(xì)胞總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力以及Bmsod和Bmcat基因的表達(dá)水平在72 hpi之后顯著下降（圖9）。說(shuō)明球孢白僵菌毒素能夠直接作用于家蠶細(xì)胞，破壞抗氧化還原平衡，造成細(xì)胞自溶、崩解，進(jìn)而可能損傷組織器官。

3 討論

活性氧（Reactive oxygen species， ROS）是自由基的重要類別，由分子氧轉(zhuǎn)化而來(lái)[15]。ROS主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基（·OH）和過(guò)氧化氫（H2O2）等[16]。ROS極為活潑，具有較強(qiáng)的氧化能力，累積過(guò)多的ROS會(huì)導(dǎo)致氧化還原平衡失調(diào)，機(jī)體生理功能紊亂[17]。

機(jī)體內(nèi)的ROS水平容易受環(huán)境因子的影響而失去平衡并過(guò)度累積，尤其是機(jī)體受到病原菌侵染時(shí)，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)現(xiàn)象，導(dǎo)致超氧陰離子（O-2）、羥自由基（OH-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O2）等多種活性氧產(chǎn)生和累積[15]。一方面，此類ROS能夠參與吞噬作用，破壞已吞噬病原微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而殺死入侵病原微生物；另一方面，機(jī)體內(nèi)積累過(guò)多此類具有較強(qiáng)反應(yīng)特性的ROS，會(huì)破壞核酸、不飽和脂肪酸、功能蛋白等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)宿主細(xì)胞造成嚴(yán)重的傷害[18]。

因此，生物體進(jìn)化出一套完善的抗氧化系統(tǒng)，以維持體內(nèi)的氧化還原平衡，以清除累積的自由基，避免機(jī)體受到氧化損傷[19]。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)由兩部分組成：一類是非酶類抗氧化劑，主要包括谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、維生素C等具有還原作用的活性物質(zhì)，在抗氧化系統(tǒng)中起到輔助作用；另一類是酶類抗氧化劑，主要包括超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase， SOD）、過(guò)氧化物酶（Peroxidase， POD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase， CAT）等，它們可以直接清除ROS，在抗氧化系統(tǒng)中起到主導(dǎo)作用[20-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，家蠶感染球孢白僵菌后期，總抗氧化活力顯著降低，表明ROS等自由基在感染后期顯著增加。機(jī)體本應(yīng)啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)以維持抗氧化還原平衡，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SOD酶活力、CAT酶活力及其基因表達(dá)水平卻在感染后期顯著下調(diào)，說(shuō)明蠶體感染白僵菌后抗氧化體系遭到破壞。

昆蟲(chóng)的中腸是阻止毒素、生物堿、糖苷類物質(zhì)、槲皮素、黃酮類物質(zhì)等次生代謝物質(zhì)的第一道防線[23-24]；昆蟲(chóng)脂肪體是重要的免疫器官和重要的解毒器官，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的肝臟，它在清除自由基、抵御氧化損傷、降解次生代謝物質(zhì)方面發(fā)揮著重要的作用[25]；昆蟲(chóng)的馬氏管相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的腎具有解毒功能，在解毒相關(guān)的超氧化物和次生代謝物質(zhì)方面發(fā)揮著重要的作用[26-27]；昆蟲(chóng)血淋巴含有大量的抗氧化酶類和非酶抗氧化劑，在維持昆蟲(chóng)氧化還原平衡中起到重要作用[25]。家蠶感染球孢白僵菌后，血淋巴、中腸、馬氏管和脂肪體的總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力顯著降低，而馬氏管、脂肪體和中腸中相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，說(shuō)明球孢白僵菌可能攻擊了家蠶的抗氧化、解毒器官，進(jìn)而破壞了家蠶的抗氧化平衡。

球孢白僵菌在感染宿主昆蟲(chóng)后期會(huì)分泌真菌毒素等有毒代謝產(chǎn)物，破壞宿主昆蟲(chóng)的生理平衡，高濃度毒素可以直接導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡[7，28]。武藝等用活性炭吸附法從液態(tài)培養(yǎng)的球孢白僵菌菌絲代謝產(chǎn)物中提取了白僵菌毒素混合物，用此混合物添毒草地夜蛾[Spodoptera frugiperda（J. E. Smmith）]體外培養(yǎng)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞代謝紊亂，結(jié)構(gòu)破壞，線粒體和核糖體損傷嚴(yán)重[12，29]。因此白僵菌毒素很可能是破壞家蠶抗氧化體系的重要因素。毒素注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，球孢白僵菌毒素也能夠降低家蠶血淋巴、中腸、脂肪體的總抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力，馬氏管、脂肪體和中腸中Bmsod和Bmcat基因也顯著下調(diào)表達(dá)。因此，筆者推測(cè)球孢白僵菌可能通過(guò)分泌毒素破壞家蠶的抗氧化系統(tǒng)。

宿主昆蟲(chóng)抗氧化系統(tǒng)破壞會(huì)導(dǎo)致自由基過(guò)度累積，嚴(yán)重影響機(jī)體的生命代謝尤其是免疫力[17]。ROS能夠與核酸的堿基發(fā)應(yīng)，產(chǎn)生突變，引起堿基缺失或DNA斷裂，影響免疫及生理代謝等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[17]。ROS能夠與功能蛋白的氨基酸結(jié)合，改變蛋白空間結(jié)構(gòu)或破壞活性中心，影響細(xì)胞的正常代謝和免疫防御能力[15]。ROS能夠氧化宿主細(xì)胞膜上的寡糖鏈中糖分子的羥基碳，導(dǎo)致細(xì)胞自溶[30]。ROS能夠攻擊生物膜磷脂分子的不飽和脂肪酸，尤其是溶酶體膜破壞，釋放酸性磷酸酶，嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞內(nèi)的膜細(xì)胞器[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射球孢白僵菌毒素后，家蠶幼蟲(chóng)存活率顯著降低，而添加外源抗氧化劑能夠消除毒素的損傷作用，顯著延長(zhǎng)幼蟲(chóng)的存活時(shí)間；家蠶BmN細(xì)胞添加球孢白僵菌毒素后發(fā)生凝集作用并最終崩解死亡，BmN細(xì)胞的總抗氧化活力和Bmsod和Bmcat基因表達(dá)水平也顯著下調(diào)。因此筆者推測(cè)球孢白僵菌可能通過(guò)分泌毒素致死宿主昆蟲(chóng)，同時(shí)也能達(dá)到免疫逃逸的目的。

本研究結(jié)果表明，球孢白僵菌侵染家蠶幼蟲(chóng)后，可能通過(guò)分泌真菌毒素，攻擊家蠶脂肪體、中腸、馬氏管等解毒、抗氧化器官或組織，下調(diào)抗氧化基因表達(dá)水平，降低抗氧化酶活力，細(xì)胞過(guò)度積累活性氧等自由基而凋亡、崩解，使各器官、組織受到嚴(yán)重氧化損傷，導(dǎo)致生命活動(dòng)紊亂，直至死亡；同時(shí)家蠶免疫系統(tǒng)破壞，有利于球孢白僵菌菌絲的生長(zhǎng)和侵染，加速家蠶死亡；而球孢白僵菌毒素受體和調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)水平的分子機(jī)理還需深入研究。本研究闡釋了球孢白僵菌侵染家蠶的致病機(jī)制可能是真菌毒素導(dǎo)致抗氧化平衡的破壞，研究結(jié)果為生防制劑的優(yōu)化和家蠶抗性品種的選育提供了新的研究途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] Tamayo-Mejía F， Tamez-Guerra P， Guzmán-Franco A W， et al. Developmental stage affects survival of the ectoparasitoid Tamarixia triozae exposed to the fungus Beauveria bassiana[J]. Biological Control， 2016， 93： 30-36.

[2] Zhang H， Wu S， Xing Z， et al. Bioassay and scanning electron microscopic observations reveal high virulence of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana， on the Onion maggot（Diptera： Anthomyiidae） adults[J]. Journal of Economic Entomology， 2016， 109： 2 309-2 316.

[3] Ortiz-Urquiza A， Keyhani N O. Molecular genetics of Beauveria bassiana infection of insects[J]. Advances in Genetics， 2016， 94： 165-249.

[4] Tafoya F， Zun～igadelgadillo M， Alatorre R， et al. Pathogenicity of Beauveria bassiana（Deuteromycota： Hyphomycetes） against the Cactus weevil， Metamasius spinolae（Coleoptera： Curculionidae） under laboratory conditions[J]. Florida Entomologist， 2004， 87：533-536.

[5] Valero-Jiménez C A， Wiegers H， Zwaan B J， et al. Genes involved in virulence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2016， 133： 41-49.

[6] Silvana P， Costa E M， Cristina P F， et al. Beauveria bassiana： quercetinase production and genetic diversity[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2011， 42： 12-21.

[7] Vikhe A G. In vitro and in vivo induction， and characterization of toxins isolated from Beauveria bassiana[J]. International Journal of Pure and Applied Bioscience， 2016， 4： 97-103.

[8] Ortiz-Urquiza A， Riveiro-Miranda L， Santiago-Alvarez C， et al. Insect-toxic secreted proteins and virulence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2010， 105： 270-278.

[9] Lobo L S， Luz C， Fernandes E K， et al. Assessing gene expression during pathogenesis： use of qRT-PCR to follow toxin production in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana during infection and immune response of the insect host Triatoma infestans[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2015， 128： 14-21.

[10] Geng T， Huang Y， Hou C， et al. Inductive expression patterns of genes related to toll signaling pathway in silkworm （Bombyx mori） upon Beauveria bassiana infection[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2016a， 19： 861-868.

[11] Geng T， Lv D D， Huang Y X， et al. JAK/STAT signaling pathway-mediated immune response in silkworm （Bombyx mori） challenged by Beauveria bassiana[J]. Gene， 2016b， 595： 69-76.

[12] Wu Y， Huang X， Deng J， et al. Isolation， detection toxicity and structure of toxin from Beauveria bassiana[J]. Acta Microbiologica Sinica， 1998， 38： 468-474.

[13]高 英， 薛皎亮， 范三紅， 等. 布氏白僵菌代謝毒素的分離純化及其對(duì)油松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43： 3 125-3 133.

[14] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-delta delta C（T））[J]. Methods， 2001， 25： 402-408.

[15] Turrens J F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J]. Journal of Physiology， 2003， 552： 335-344.

[16] Thannickal V J， Fanburg B L. Reactive oxygen species in cell signaling[J]. American Journal of Physiology Lung Cellular & Molecular Physiology， 2000， 279： 1 005-1 028.

[17] Apel K， Hirt H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55： 373-399.

[18] Kumar S， Christophides G K， Cantera R， et al. The role of reactive oxygen species on plasmodium melanotic encapsulation in Anopheles gambiae[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2003， 100： 14 139 -14 144.

[19] Ha E M， Oh C T， Ryu J H， et al. An antioxidant system required for host protection against gut infection in Drosophila[J]. Developmental Cell， 2005， 8： 125-132.

[20] Krishnan N. Compartmentalization of oxidative stress and antioxidant defense in the larval gut of Spodoptera littoralis[J]. Archives of Insect Biochemistry & Physiology， 2010， 63： 1-10.

[21] Yamamoto K， Banno Y， Fujii H， et al. Catalase from the silkworm， Bombyx mori： gene sequence， distribution， and overexpression[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2005a， 35： 277-283.

[22] Yamamoto K， Zhang P， Banno Y， et al. Superoxide dismutase from the silkworm， Bombyx mori： Sequence[J]. Distribution， and Overexpression， Bioscience Biotechnology & Biochemistry， 2005b， 69： 507-514.

[23] Yu H， Wang X， Xu J， et al. TRAQ-based quantitative proteomics analysis of molecular mechanisms associated with Bombyx mori（Lepidoptera） larval midgut response to BmNPV in susceptible and near-isogenic strains[J]. Journal of Proteomics， 2017， 165： 35-50.

[24] 耿 濤， 黃玉霞， 侯成香， 等. GSTs和GSH-Px在家蠶幼蟲(chóng)抵御球胞白僵菌感染過(guò)程中的作用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2016， 12： 3 335-3 343.

[25] Li Z H， Pan G Q， Ma Z G， et al. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in the Bombyx mori fat body during the microsporidia（Nosema bombycis） Infection[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2017， 149： 36-43.

[26] Dow J A T， Davies S A. Insights into the malpighian tubule from functional genomics[J]. Journal of Experimental Biology， 2009， 212： 435-445.

[27] Mallikarjun G， Neetha N K， Manjunatha B， et al. A mini review of functional proteins in silkworm Bombyx mori L Haemolymph[J]. Indian Journal of Science & Technology， 2016， 9： 1-8.

[28] Yang Y T， Lee S J， Nai Y S， et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug， Riptortus pedestris（Hemiptera： Alydidae）[J]. Fungal Biology， 2016， 120： 1 236-1 248.

[29]Vemmer M， Schumann M， Beitzen-Heineke W， et al. Development of a CO2-releasing co-formulation based on starch， Saccharomyces cerevisiae and Beauveria bassiana attractive towards western corn rootworm larvae[J]. Pest Management Science， 2016， 72： 2 136 -2 145.

[30]Circu M L， Aw T Y. Reactive oxygen species， cellular redox systems， and apoptosis[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2010， 48： 749-762.