秦航 林燁 常婷 郭鵬 李柱一

Th22細胞及相關因子在重癥肌無力患者外周血中的表達

秦航 林燁 常婷 郭鵬 李柱一

目的 研究重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)患者外周血輔助性T細胞22(T helper 22 cells,Th22)和白細胞介素-22(interleukin-22，IL-22)的表達以及兩者間的相關性。方法 收集25例MG患者和24例健康對照者，其中眼肌型重癥肌無力(ocular myasthenia gravis，OMG)患者14例，全身型重癥肌無力(general myasthenia gravis，GMG)患者11例。采用流式細胞儀檢測MG患者和健康對照者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Th22細胞的比例，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿IL-22的表達。比較各組間Th22細胞比例和IL-22表達水平差異，以及Th22細胞比例和IL-22表達間的相關性。結果 MG患者PBMC中Th22細胞比例、血漿IL-22表達水平均顯著低于健康對照組〔(0.60±0.07)%比(0.92±0.09)%，P<0.01；(18.65±1.38)pg/mL比(24.54±1.85)pg/mL，P<0.05〕；OMG與GMG患者間Th22細胞比例、IL-22表達水平均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)；MG患者PBMC中Th22細胞比例與IL-22表達水平間呈中度正相關(r=0.59，P<0.01)。結論 MG患者體內(nèi)Th22細胞比例及血漿IL-22表達水平減低可能導致免疫功能紊亂進而影響MG的發(fā)病。

重癥肌無力；T淋巴細胞亞群；輔助性T細胞22；白細胞介素22

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種T細胞依賴、B細胞介導、補體參與的獲得性自身免疫性疾病，主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導引起神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙所致[1-2]。研究表明CD4+輔助性T細胞可輔助漿細胞產(chǎn)生AChR-Ab[3]，Ahlberg等[4]也曾報道通過人鼠嵌合抗CD4單克隆抗體可改善MG患者癥狀，可見CD4+輔助性T細胞在MG的發(fā)生中起至關重要的作用。

輔助性T細胞22(T helper 22 cells，Th22)作為一種新型CD4+輔助性T細胞亞群，主要分泌特征性的細胞因子——白細胞介素-22(interleukin-22，IL-22)，但不分泌IL-17和γ干擾素(IFN-γ)，細胞表型為CD4+IL-22+IL-17-IFN-γ-[5]。人體內(nèi)的IL-22主要由Th22細胞分泌，它是Th22細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應因子[5-7]。Th22細胞與很多自身免疫性疾病的發(fā)病機制有關，許多自身免疫性疾病患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Th22細胞比例及血漿IL-22表達水平較健康者升高[8]，然而在狼瘡腎炎患者中Th22細胞和IL-22卻顯著下降[9]。目前，尚未檢索到國內(nèi)外有關Th22細胞在MG發(fā)病中作用的研究。本研究通過檢測MG患者外周血Th22細胞及IL-22的表達，旨在探究Th22細胞在MG發(fā)病機制中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集2015-10—2016-06在第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的MG患者25例，MG確診標準依據(jù)《中國重癥肌無力診斷和治療指南(2015)》[10]，入組患者均未進行免疫抑制劑或激素治療，且不合并其他自身免疫性疾病。其中男性14例，女性11例，伴胸腺異常5例(胸腺瘤4例，胸腺增生1例)，年齡3.8～82歲，平均(40.4±3.2)歲。所有患者進行MGFA分型，其中Ⅰ型14例，Ⅱa型5例，Ⅱb型5例，Ⅲa型1例。Ⅰ型患者定義為眼肌型重癥肌無力(ocular myasthenia gravis，OMG)組，另11例為全身型重癥肌無力(general myasthenia gravis，GMG)組。健康對照24名，均來自作者醫(yī)院體檢的健康者，無自身免疫性疾病，其中男性13名，女性11名，年齡21～64歲，平均(40.1±2.7)歲。所有MG患者和健康對照均簽署知情同意書。兩組間性別構成和年齡間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器 流式單克隆抗體FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ、APC-anti-human IL-17A、PE-anti-human IL-22及對應的同型抗體購自Biolegend公司，固定/破膜試劑及洗液為BD公司產(chǎn)品，離子霉素、佛波酯以及莫能霉素購自Sigma公司，人IL-22 ELISA試劑盒為Mabtech公司產(chǎn)品。主要儀器包括流式細胞儀(BD公司)、酶標儀(Bio-Rad公司)、離心機(Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 PBMC中Th22細胞比例檢測：采用密度梯度沉降法獲取PBMC，收集約1×106個PBMC，加入離子霉素、佛波酯以及莫能霉素，置37℃、5%(體積分數(shù))CO2多功能細胞孵育箱中孵育6 h，破膜、固定細胞，加入FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ、APC-anti-human IL-17A、PE-anti-human IL-22單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌、多聚甲醛固定后通過流式細胞儀檢測CD4+IL-22+IL-17-IFN-γ-的細胞比例。同型對照組加入FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ單克隆抗體，APC、PE同型抗體。

1.3.2 血漿IL-22表達檢測：將前期凍于-80℃的兩組血漿樣本于4℃解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行檢測，具體步驟按人IL-22 ELISA試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗，Th22細胞比例與IL-22表達的相關性采用Pearson相關性分析。以雙側P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組PBMC中Th22細胞比例 MG患者PBMC中Th22細胞比例低于健康對照組〔(0.60±0.07)%比(0.92±0.09)%，P<0.01〕。OMG組患者Th22細胞比例與GMG組比較雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義〔(0.64±0.10)%比(0.55±0.09)%，P>0.05〕。某例MG患者與健康對照者流式細胞術檢測結果見圖1。

2.2 血漿IL-22表達水平 MG患者血漿IL-22表達水平顯著低于健康對照組〔(18.65±1.38)pg/mL比(24.54±1.85)pg/mL，P<0.05〕。OMG患者IL-22表達水平雖有高于GMG患者的趨勢，但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義〔(20.82±1.92)pg/mL比(15.89±1.69)pg/mL，P>0.05〕。

2.3 MG患者外周血Th22細胞比例與IL-22的相關性 MG患者PBMC中Th22細胞比例與血漿IL-22表達水平呈中度正相關(r=0.59，P<0.01)。結果見圖2。

注：MG：重癥肌無力,圖2同；PBMC：外周血單個核細胞 圖1 流式細胞術檢測某例MG患者和健康對照PBMC中Th22細胞比例結果

注：IL-22：白細胞介素-22；IFN-γ：干擾素γ 圖2 MG患者外周血Th22細胞比例與IL-22表達水平的相關性分析

3 討論

Th22細胞在許多自身免疫性疾病中均發(fā)揮了重要作用，但有關Th22細胞在MG方面的研究目前尚未檢索到。本研究對MG患者PBMC中Th22細胞比例、血漿IL-22的表達水平進行檢測，并探討了Th22細胞與IL-22表達間的關系，結果顯示，MG患者PBMC中Th22細胞比例、血漿IL-22表達水平均顯著低于健康對照組，MG患者PBMC中Th22細胞比例與IL-22表達水平間存在中度正相關。

Th22細胞在腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-6等細胞因子的刺激下由初始CD4+T細胞分化而來，而轉化生長因子β(TGF-β)作為一種主要的內(nèi)源性免疫抑制因子具有抑制Th22細胞分化的功能[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MG合并胸腺瘤患者的瘤組織中TGF-β1表達水平較單純胸腺瘤患者高[11]；MG患者外周血中TGF-β1也顯著高于健康者[12]。TGF-β1在所有的TGF-β亞型中生物學活性最強，這似乎部分解釋了MG患者PBMC中Th22細胞比例減低的原因。有研究表明IL-22與AChR-Ab之間存在顯著負相關[13]。IL-22主要由Th22細胞分泌，本研究發(fā)現(xiàn)Th22與IL-22之間存在顯著正相關，推測Th22細胞可能抑制了B細胞的功能，減少了AChR-Ab的分泌。MG患者Th22細胞減少，降低了其對B細胞的抑制，從而促進了AChR-Ab的分泌，可能導致了MG的發(fā)生發(fā)展。

IL-22作為白細胞介素-10家族中的一員，主要由Th22細胞分泌，通過IL-22R1和IL-10R2組成的異二聚體受體復合體發(fā)揮功能，IL-10R2廣泛地表達于各類免疫組織細胞，但IL-22R1僅分布在某些組織細胞如骨骼肌、皮膚、小腸等[14-15]。IL-22在不同的組織中具有促進炎癥或者抑制炎癥的雙重功效，在類風濕性關節(jié)炎[16]等疾病中，表現(xiàn)為促炎的功能，參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，但在急性胰腺炎[17]、實驗性自身免疫性心肌炎[18]等動物模型以及狼瘡腎炎[9]患者中，IL-22卻表現(xiàn)出抑制炎癥的保護性作用。在小鼠氣道炎癥模型中，IL-22在氣道組織中表現(xiàn)出促進炎癥致病或抑制炎癥保護的雙重功效，具體取決于IL-17A的表達。當缺乏IL-17A時，表現(xiàn)出抑制炎癥的保護性作用；當IL-22與IL-17A共表達時，表現(xiàn)出促炎的作用[19]。作者課題組既往研究結果顯示，Th17細胞和IL-17可能參與了MG的發(fā)病，且MG患者外周血中Th17細胞比例、IL-17表達量較健康者明顯升高[20]，推測MG患者IL-17的升高可能與IL-22共表達，表現(xiàn)出促炎的作用，從而參與了MG的發(fā)生。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是Th22細胞的關鍵轉錄因子。Trifari等[21]研究顯示，β-萘黃酮作為AHR的激動劑，在人體內(nèi)既可促進IL-22的表達，提高Th22細胞的比例，又可抑制IL-17的表達，降低Th17細胞的比例，提示Th22與Th17細胞、IL-22與IL-17之間可能存在平衡。Zheng等[13]研究亦發(fā)現(xiàn)MG患者血清中IL-22較健康者顯著降低，IL-17顯著升高，且IL-22與IL-17之間存在負相關。本文研究選取未經(jīng)過任何藥物治療的新發(fā)MG患者，入組標準更加嚴格，并對Th22細胞在PBMC中的比例變化進行了探討，結果顯示MG患者Th22細胞比例、IL-22表達較健康對照組降低，且Th22細胞比例與IL-22呈正相關。這與上述研究結果基本一致。據(jù)此推測，Th17細胞、IL-17升高，Th22細胞、IL-22減低，這種平衡的改變可能導致了MG的發(fā)生。

綜上所述，MG患者PBMC中Th22細胞比例、血漿IL-22表達水平降低，可能參與了MG的發(fā)生發(fā)展，Th22細胞和IL-22可能在MG中起保護性作用，這為將來MG的治療可能提供了新的療法，但有關Th22細胞及相關因子在MG發(fā)病中的免疫機制有待進一步深入研究。

[1]Lindstrom JM,Seybold ME,Lennon VA,et al.Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis, prevalence, clinical correlates, and diagnostic value[J]. Neurology,1976,26(11):1054-1059.

[2]Drachman DB.Myasthenia gravis[J].N Engl J Med, 1994,330(25):1797-1810.

[3]Elson CJ, Barker RN. Helper T cells in antibody-mediated, organ-specific autoimmunity[J].Curr Opin Immunol,2000,12(6):664-669.

[4]Ahlberg R,Yi Q,Pirskanen R,et al. Clinical improvement of myasthenia gravis by treatment with a chimeric anti-CD4 monoclonal antibody[J].Ann N Y Acad Sci,1993,681:552-555.

[5]Duhen T,Geiger R,Jarrossay D, et al. Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells[J].Nat Immunol,2009, 10(8):857-863.

[6]Sabat R, Ouyang W,Wolk K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system[J].Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(1):21-38.

[7]Wolk K, Kunz S, Asadullah K, et al. Cutting edge: immune cells as sources and targets of the IL-10 family members?[J]. J Immunol,2002,168(11):5397-5402.

[8]Azizi G, Yazdani R, Mirshafiey A. Th22 cells in autoimmunity: a review of current knowledge[J]. Eur Ann Allergy Clin Immunol,2015,47(4):108-117.

[9]Yang XY,Wang HY,Zhao XY.Th22, but not Th17 might be a good index to predict the tissue involvement of systemic lupus erythematosus[J]. J Clin Immunol,2013, 33(4):767-774.

[10]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會神經(jīng)免疫學組，中國免疫學會神經(jīng)免疫學分會.中國重癥肌無力診斷和治療指南(2015)[J].中華神經(jīng)科雜志,2015,48(11):934-940.

[11]張曉峰.轉化生長因子-β1、干擾素-γ在胸腺瘤合并重癥肌無力發(fā)病中意義的研究[D].沈陽:中國醫(yī)科大學,2006年.

[12]李曉峰,李呂力,羅永堅,等.重癥肌無力患者IL-18、TGFβ-1的表達[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2010,36(7):393-396.

[13]Zheng S, Dou C,Xin N, et al. Expression of interleukin-22 in myasthenia gravis[J].Scand J Immunol,2013,78(1):98-107.

[14]Wolk K, Kunz S, Witte E,et al.IL-22 increases the innate immunity of tissues[J]. Immunity,2004,21(2):241-254.

[15]Fabbrini E, Cella M, McCartney SA,et al. Association between specific adipose tissue CD4+T-cell populations and insulin resistance in obese individuals[J]. Gastroenterology,2013,145(2):366-374.

[16]Zhang L,Li JM, Liu XG, et al. Elevated Th22 cells correlated with Th17 cells in patients with rheumatoid arthritis[J].J Clin Immunol,2011,31(4):606-614.

[17]Huan C, Kim D, Ou P, et al. Mechanisms of interleukin-22’s beneficial effects in acute pancreatitis[J].World J Gast rointest Pathophysiol,2016,7(1):108-116.

[18]Chang H, Hanawa H, Liu H，et al. Hydrodynamic-based delivery of an interleukin-22-Ig fusion gene ameliorates experimental autoimmune myocarditis in rats[J].J Immunol,2006,177(6):3635-3643.

[19]Sonnenberg GF,Nair MG,Kirn TJ,et al.Pathological versus protective functions of IL-22 in airway inflammation are regulated by IL-17A[J].J Exp Med,2010,207(6):1293-1305.

[20]張曉燕.Th17細胞在重癥肌無力發(fā)病中的作用及機制研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學,2014年.

[21]Trifari S,Kaplan CD,Tran EH,et al. Identification of a human helper T cell population that has abundant production of interleukin 22 and is distinct from TH-17, TH1 and TH2 cells[J].Nat Immunol,2009,10(8):864-871.

(本文編輯：時秋寬)

Changes of circulating T helper 22 cells and its related molecules in myasthenia gravis

QINHang,LINYe,CHANGTing,GUOPeng,LIZhuyi*.

*DepartmentofNeurology,TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxi710038,China

Corresponding author: LI Zhuyi, Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

Objective To study the expression of T helper 22 (Th22) cells and interleukin-22 (IL-22) in peripheral blood of patients with myasthenia gravis (MG); the correlation between Th22 cells and IL-22 was analyzed. Methods Twenty-five MG patients, consisting of fourteen ocular MG (OMG) patients and eleven general MG patients(GMG), were enrolled. Twenty-four healthy volunteers were used as controls. The percentages of Th22 cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of MG patients and healthy controls were detected by flow cytometry. The plasma levels of IL-22 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The differences of the Th22 cells percentages and the concentration of IL-22 were compared between each group; also we investigated the correlation between Th22 cells and IL-22. Results The proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels significantly declined in MG patients compared with healthy controls [(0.60±0.07)%vs. (0.92±0.09)%，P<0.01；(18.65±1.38)pg/mLvs. (24.54±1.85)pg/mL，P<0.05]. There were no significant differences of the proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels between OMG and GMG patients(allP>0.05). Moderate positive correlation was shown between the proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels in PBMC of MG patients(r=0.59，P<0.01).Conclusions The decreased Th22 cells and IL-22 in MG patients might lead to immune disorder, and then were involved in the pathological process of MG.

myasthenia gravis; T-lymphocyte subsets; T helper 22 cells; interleukin-22

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.006

國家自然科學基金資助項目(81571218)

710038 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

李柱一，Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963(2017)03-0174-04

2016-10-14)