有機(jī)消泡劑對(duì)棘孢木霉菌株Tr148c液體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量的影響

馬曉梅,王 軍,2,曠文豐,褚 凱,陳 晨 ,毛偉力*

(1.上海萬(wàn)力華生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036)

有機(jī)消泡劑對(duì)棘孢木霉菌株Tr148c液體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量的影響

馬曉梅1,王 軍1,2,曠文豐1,褚 凱1,陳 晨1,毛偉力1*

(1.上海萬(wàn)力華生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036)

為了篩選對(duì)發(fā)酵液中棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c的分生孢子產(chǎn)量無(wú)副作用的消泡劑，在PDA培養(yǎng)基中分別加入0.1%、0.4%和0.7%的10種消泡劑。其中天然油脂(豆油)、聚醚類(GPE-6330，GP-6301)和有機(jī)硅類(L-101a，L-104a)對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)抑制率都顯著低于其它消泡劑(P≤0.05)。將篩選出的5種消泡劑進(jìn)行消泡測(cè)試，發(fā)現(xiàn)GPE-6330、L-101a和L-104a在消泡和抑泡能力上都分別顯著優(yōu)于豆油和GP-6301(P≤0.05)?？疾炝薌PE-6330、L-101a和L-104a的用量及對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響。在相同條件下，當(dāng)L-101a對(duì)發(fā)酵液的消泡和抑泡效果達(dá)到生產(chǎn)工藝要求時(shí)，其用量以及對(duì)菌株Tr148c分生孢子產(chǎn)量的影響都顯著優(yōu)于GPE-6330和L-104a(P≤0.05)。

木霉菌；有機(jī)消泡劑；液體發(fā)酵；消泡能力

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種已廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果和花卉等多種經(jīng)濟(jì)作物上的生防微生物，具有競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生、誘導(dǎo)抗性和促進(jìn)生長(zhǎng)等多種功能，在作物病害生物防治中起到了重要作用[1-2]。木霉菌孢子制劑是目前應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種主要形式[3]。如何獲得大量的木霉菌孢子，是制備木霉菌孢子制劑的關(guān)鍵[4]。雖然深層液體發(fā)酵技術(shù)為木霉菌孢子產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)了可能性，但在液體發(fā)酵過(guò)程中，由于通氣、攪拌、菌液黏稠度逐漸加大以及培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物積累等原因，發(fā)酵液會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫[5]。當(dāng)泡沫超過(guò)一定范圍時(shí)，極易造成發(fā)酵液漫罐、雜菌污染或必須降低裝料系數(shù)等不利影響[6]。張路軍等[7]采用有效的消泡劑，可使谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備利用率達(dá)90%。因此，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的泡沫加以控制，是一項(xiàng)必要的技術(shù)措施。

目前液體發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)所采用的消泡方法有物理消泡法(如機(jī)械攪拌、靜電、冷凍、高速離心、加/減壓和超聲波[8])和化學(xué)消泡法。添加化學(xué)消泡劑經(jīng)濟(jì)方便，而且消泡效果好，在液體發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[9]。發(fā)酵工業(yè)常用的化學(xué)消泡劑有4類，分別是油脂、聚醚、有機(jī)硅和聚醚改性硅氧烷[10]。不同的化學(xué)消泡劑對(duì)微生物菌體生長(zhǎng)的影響不同，它們可能會(huì)降低或抑制發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。李剛等[11]發(fā)現(xiàn)消泡劑磷酸三丁酯對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用極為顯著。崔耀軍[5]發(fā)現(xiàn)消泡劑LB-625不僅對(duì)BAA中溫ɑ-淀粉酶發(fā)酵液體的消泡、抑泡作用明顯，而且對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，從而提高了發(fā)酵液的放罐體積和酶產(chǎn)量。

有機(jī)消泡劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、造紙和農(nóng)藥等多種行業(yè)的發(fā)酵生產(chǎn)中[12-15]。但有機(jī)消泡劑應(yīng)用于棘孢木霉菌分生孢子發(fā)酵生產(chǎn)的報(bào)道還很少。作者通過(guò)比較多種消泡劑在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)棘孢木霉菌株Tr148c生長(zhǎng)的影響和對(duì)泡沫的控制能力，篩選出適合菌株Tr148c深層液體發(fā)酵生產(chǎn)分生孢子的消泡劑，擬為工業(yè)化生產(chǎn)木霉菌孢子制劑和穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、培養(yǎng)基及試劑

棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c，由上海萬(wàn)力華生物科技有限公司從采自安徽合肥的土壤樣品中篩選獲得，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No：5201)。

PDA培養(yǎng)基：在200 g去皮土豆中加入500 mL水，煮沸20 min，過(guò)濾，上清液中加葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，充分混勻，定容至1 L。分裝到1 L三角瓶中，裝液量500 mL，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻至50 ℃，無(wú)菌條件下倒入培養(yǎng)皿，冷卻后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在200 g去皮土豆中加入適量的水，煮沸20 min，過(guò)濾，上清液中加甘露醇30 g·L-1、酵母粉1 g·L-1，充分溶解，定容至1 L。裝液量為150/500 mL[4]，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻后備用。

消泡劑：豆油(天然油脂)，GPE-6330、GP-6301、GP-6303(聚醚類)，T-30c(高碳醇)，L-101a、L-104a、TSA-673(有機(jī)硅類)，LX-601、LX-603(聚醚改性聚硅氧烷類)，市售。

1.2 方法

1.2.1 斜面菌種培養(yǎng)

向250 mL茄瓶中加入80 mL PDA培養(yǎng)基，1×105Pa下滅菌20 min。斜面靜置冷卻后，在無(wú)菌條件下接種菌株Tr148c，并放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，然后放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.2 種子液的制備

在無(wú)菌條件下，刮取茄瓶中斜面生長(zhǎng)的菌株Tr148c分生孢子，用無(wú)菌水配成5×107個(gè)·mL-1的分生孢子懸浮液(用血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)目)，即得種子液。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

將150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基加入到500 mL三角瓶中，1×105Pa下滅菌30 min，冷卻至室溫。按4%的接種量將種子液在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接入三角瓶中，初始發(fā)酵液的孢子量為2×106個(gè)·mL-1，于轉(zhuǎn)速為200 r·min-1、28 ℃下發(fā)酵144 h[4]，即得發(fā)酵液。

1.2.4 消泡劑對(duì)菌株Tr148c生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

分別將每種消泡劑按0.1%、0.4%、0.7%的用量添加到PDA培養(yǎng)基中混勻，以不加消泡劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。1×105Pa下滅菌30 min，冷卻至50 ℃，在無(wú)菌條件下倒入培養(yǎng)皿中，待PDA培養(yǎng)基冷卻凝固后，用滅菌打孔器取直徑為5 mm的Tr148c菌體塊，分別接種于不同處理的平皿中央。每個(gè)處理3個(gè)平行，將平皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。采用SPSS軟件，Duncan′s Multiple Range Test統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，顯著性差異 (P≤ 0.05,n=3)統(tǒng)計(jì)各種消泡劑對(duì)菌株Tr148c生長(zhǎng)的影響(相同字母表示無(wú)顯著性差異)，按下式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率：

式中：D0為空白對(duì)照Tr148c菌絲生長(zhǎng)半徑；D為經(jīng)消泡劑處理的Tr148c菌絲生長(zhǎng)半徑。

1.2.5 消泡劑的消泡和抑泡能力的測(cè)定

消泡能力：在1 000 mL量筒中加入200 mL已發(fā)酵48 h的發(fā)酵液作為起泡液，以5 L·min-1的恒定速率通入空氣鼓泡，當(dāng)泡沫高度達(dá)到量筒800 mL的位置時(shí)，迅速加入0.02%的消泡劑，同時(shí)用秒表記錄泡沫完全消失的時(shí)間。消泡時(shí)間短，即消泡劑的消泡能力強(qiáng)[9]。

抑泡能力：向1 000 mL量筒中加入200 mL上述發(fā)酵液、0.02%的消泡劑，攪拌均勻后以5 L·min-1的恒定速率通入空氣鼓泡，記錄10 min內(nèi)泡沫的生成量。泡沫生成量少，即消泡劑的抑泡能力強(qiáng)[9]。

1.2.6 消泡劑用量及其對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響

將篩選出的消泡劑在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行用量(泡沫控制能力)及對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量影響的測(cè)試：在9個(gè)10 L發(fā)酵罐中，分別裝入6.5 L發(fā)酵培養(yǎng)液，加入0.1%篩選出的消泡劑(每種消泡劑做3個(gè)平行，隨機(jī)排列)，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻至室溫，在無(wú)菌條件下加入4%的種子液，初始培養(yǎng)液的孢子量為2×106個(gè)·mL-1；同時(shí)將發(fā)酵罐在溫度28 ℃、通氣量5.8 L·min-1、攪拌速度250 r·min-1下培養(yǎng)144 h。用發(fā)酵罐中的消泡電極測(cè)定泡沫液位，以超過(guò)罐體80%為臨界點(diǎn)。每個(gè)發(fā)酵罐配備10%的消泡劑，當(dāng)發(fā)酵罐中的泡沫液位超過(guò)罐體80%時(shí)，自動(dòng)流加消泡劑。分別在發(fā)酵60 h、84 h和108 h時(shí)記錄消泡劑用量，測(cè)定孢子量。

將篩選出的綜合性能最好的消泡劑，用以上相同的測(cè)試方法在2個(gè)750 L發(fā)酵罐中進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵罐在溫度28 ℃、通氣量250 L·min-1、攪拌速度150 r·min-1下培養(yǎng)144 h。每個(gè)發(fā)酵罐配備10%的消泡劑，消泡劑用量的記錄和孢子量的測(cè)定同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 消泡劑對(duì)菌株Tr148c生長(zhǎng)的影響(圖1)

由圖1可以看出，當(dāng)消泡劑用量為0.1%和0.4%時(shí)，GP-6303、T-30c、LX-601和LX-603對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)抑制率都超過(guò)了30%，T-30c甚至超過(guò)了60%，顯著高于其它消泡劑對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)抑制率(P≤0.05)；當(dāng)消泡劑用量為0.7%時(shí)，GP-6303、T-30c、LX-601、LX-603和TSA-673對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)抑制率分別為98.1%、67.76%、84.22%、71.76%和23.89%，顯著高于其它消泡劑對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)抑制率(P≤0.05)；當(dāng)消泡劑用量為0.1%時(shí)，GP-6301對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)用量為0.4%和0.7%時(shí)，對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。豆油、GPE-6330、L-101a和L-104a在任何用量下，對(duì)菌株Tr148c的生長(zhǎng)不僅沒(méi)有抑制作用，相反有一定的促進(jìn)作用。特別是豆油，隨著用量的增加，促生長(zhǎng)作用不斷增強(qiáng)。因此，選擇豆油、GPE-6330、GP-6301、L-101a、L-104a進(jìn)行消泡和抑泡能力的測(cè)定。

圖1 消泡劑對(duì)菌株Tr148c生長(zhǎng)的影響

2.2 消泡劑的消泡和抑泡能力的測(cè)定結(jié)果(表1)

表1 消泡劑的消泡和抑泡能力的測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Determination results of anti-foaming and foam- suppressing capabilities with defoaming agents

由表1可以看出，GPE-6330消泡能力顯著優(yōu)于豆油和GP-6301(P≤0.05)。雖然L-101a、L-104a和GP-6301的消泡時(shí)間之間無(wú)顯著性差異，但它們都顯著少于豆油所用的消泡時(shí)間(P≤0.05)。同時(shí)GPE-6330、L-101a和L-104a的抑泡能力顯著優(yōu)于GP-6301和豆油(P≤0.05)。因此，選擇GPE-6330、L-101a和L-104a進(jìn)行10 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。

2.3 消泡劑的用量及其對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響測(cè)定結(jié)果

在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行菌株Tr148c的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，消泡劑的用量及其對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 消泡劑的用量(a)及其對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量(b)的影響

由圖2a可以看出，菌株Tr148c在10 L罐的發(fā)酵過(guò)程中，消泡劑L-101a、L-104a和GPE-6330的用量都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中GPE-6330在發(fā)酵至84 h和108 h時(shí)的用量(145.2 mL、378.6 mL)都顯著少于L-104a的用量(170.6 mL、435.4 mL)(P≤0.05)，但顯著高于L-101a的用量(81.7 mL、173.4 mL)(P≤0.05)。

由圖2b可以看出，雖然菌株Tr148c的產(chǎn)孢量在所測(cè)試的3種消泡劑中，都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到84 h和108 h時(shí)，加入了L-101a的菌株Tr148c的產(chǎn)孢量(1.75×108個(gè)·mL-1、2.25×108個(gè)·mL-1)都顯著高于加入了L-104a的產(chǎn)孢量(0.95×108個(gè)·mL-1、1.45×108個(gè)·mL-1)和GPE-6330的產(chǎn)孢量(1.25×108個(gè)·mL-1、1.65×108個(gè)·mL-1)(P≤0.05)。表明，L-101a在10 L發(fā)酵罐中，不僅具有良好的消泡、抑泡作用，同時(shí)對(duì)菌株Tr148c的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響最小。因此，選用L-101a在750 L發(fā)酵罐中進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

在符合工藝要求條件下，菌株Tr148c在750 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了兩批次發(fā)酵，最終產(chǎn)孢量分別為2.3×108個(gè)·mL-1和2.4×108個(gè)·mL-1，有機(jī)消泡劑L-101a用量分別為11.0 L和10.5 L，達(dá)到了測(cè)試的預(yù)期要求。

2.4 討論

雖然多種有機(jī)消泡劑已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，但不同的發(fā)酵產(chǎn)品以及不同的發(fā)酵生產(chǎn)工藝所要求的有機(jī)消泡劑是不同的。朱文浩等[16]篩選了6種不同的有機(jī)消泡劑，測(cè)試它們對(duì)發(fā)酵液的消泡、抑泡能力，開(kāi)發(fā)出了一種應(yīng)用在糖蜜酒精發(fā)酵中的高效消泡劑。胡廷等[17]對(duì)4種有機(jī)消泡劑進(jìn)行了篩選，選擇了一種有機(jī)硅消泡劑，應(yīng)用在味精發(fā)酵生產(chǎn)中。

目前，國(guó)內(nèi)外在消泡劑的性能測(cè)試方面尚無(wú)統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)良的消泡劑不但具有消泡效率高、經(jīng)濟(jì)成本低、安全無(wú)毒等特點(diǎn)[18]，同時(shí)還應(yīng)具備在發(fā)酵過(guò)程中不引起發(fā)酵產(chǎn)物代謝異常、符合發(fā)酵生產(chǎn)的工藝要求、不影響產(chǎn)量并有利于發(fā)酵產(chǎn)物的后續(xù)處理等特征[5]。劉躍等[9]和魏浩等[19]根據(jù)消泡劑的消泡、抑泡能力以及它們對(duì)菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵物產(chǎn)量的影響，篩選出一種最佳消泡劑。由此可見(jiàn)，當(dāng)選用的消泡劑與發(fā)酵物相容，同時(shí)還具有較好的消泡能力時(shí)，能提高發(fā)酵物的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)硅類消泡劑L-101a用于棘孢木霉菌株Tr148c的液體發(fā)酵，用量少且對(duì)菌株的生長(zhǎng)和分生孢子產(chǎn)量有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

通過(guò)平板測(cè)試對(duì)10種消泡劑與棘孢木霉菌株Tr148c的相容性進(jìn)行篩選，初篩出5種消泡劑進(jìn)行消泡、抑泡能力測(cè)定，進(jìn)而篩選出3種消泡劑GPE-6330、L-101a、L-104a進(jìn)行10 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，考察了消泡劑用量及其對(duì)菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響，最終篩選出了L-101a作為菌株Tr148c液體發(fā)酵的最佳消泡劑。作為一種有機(jī)硅消泡劑，L-101a不僅與菌株Tr148c相容性好，在液體發(fā)酵過(guò)程中的用量少且消泡、抑泡能力顯著，同時(shí)對(duì)菌株Tr148c菌體生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)量具有促進(jìn)作用。

本研究初探了有機(jī)消泡劑在木霉菌發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，為消泡劑進(jìn)一步應(yīng)用于木霉菌孢子制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

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Effect of Organic Defoaming Agent on Conidial Spore Production ofTrichodermaasperellumTr148c in Liquid Fermentation Process

MA Xiao-mei1，WANG Jun1,2，KUANG Wen-feng1，CHU Kai1，CHEN Chen1,MAO Wei-li1*

(1.ShanghaiW.L.H.Bio-techCo.，Shanghai201203,China；2.AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036,China)

InordertoscreenadefoamingagentusedintheliquidfermentationprocesswhichhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofTrichoderma asperellumstrainTr148c，0.1%，0.4%，0.7%ofeachof10defoamingagentswererespectivelyaddedintoPDAculturemedium.ThegrowthinhibitoryratesofstrainTr148cweresignificantlylower(P≤0.05)inthetreatmentswiththedefoamingagentsofnaturaloil(soybeanoil)，polyether(GPE-6330，GP-6301)andorganicsilicon(L-101a，L-104a)comparedtotheothers.Defoamingtestswith5selectedagentswereconducted，andtheresultsshowedthattheanti-foamingandfoam-suppressingcapabilitiesofGPE-6330，L-101aandL-104aweresignificantlybetter(P≤0.05)comparedtotheothers.ThedosagesofGPE-6330，L-101aandL-104a，andeffectsofthemontheconidialsporeproductionofstrainTr148cwereinvestigated.Whenanti-foamingandfoam-suppressingeffectsmetthetechnicalrequirementsunderthesameconditions，thedosageofL-101aduringthefermentationprocesswassignificantlyless(P≤0.05)andhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofstrainTr148ccomparedtothosewithGPE-6330andL-104a，respectively.

Trichodermaspp.;organicdefoamingagent;liquidfermentation;defoamingability

國(guó)家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(14C26213100929)

2016-10-13

馬曉梅(1987-)，女，黑龍江綏化人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：759948123@qq.com；

毛偉力，博士，E-mail：weilimao@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.010

TQ458

A

1672-5425(2017)03-0040-05

馬曉梅,王軍,曠文豐,等.有機(jī)消泡劑對(duì)棘孢木霉菌株Tr148c液體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量的影響[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(3)：40-44.