劉 里，成飛翔

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖，655011)

頭孢他美酯與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里*，成飛翔

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖，655011)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，光譜法研究牛血清白蛋白(BSA)和頭孢他美酯(CP)結(jié)合反應(yīng)的特征。結(jié)果表明：CP對(duì)BSA的熒光有猝滅作用，屬于靜態(tài)猝滅。BSA能運(yùn)輸CP，其作用力類(lèi)型主要為氫鍵和范德華力。BSA 的亞螺旋域ⅡA是主要結(jié)合位置，有弱的負(fù)協(xié)同作用。CP對(duì)BSA構(gòu)象幾乎不產(chǎn)生影響，結(jié)合位點(diǎn)更接近于酪氨酸。關(guān)鍵詞： 頭孢他美酯；牛血清白蛋白；熒光光譜法

我國(guó)是濫用抗生素情況最嚴(yán)重的國(guó)家之一，嚴(yán)重危害著人和動(dòng)物的生命安全。頭孢他美酯(Cefetamet Pivoxil，簡(jiǎn)稱(chēng)CP)又稱(chēng)頭孢美特酯，主要用于敏感菌所致的呼吸道炎癥和各器官等感染[6]，是一種非處方的常用抗生素。所以研究CP與BSA的相互作用對(duì)理解藥物的作用機(jī)制具有重要意義。分子光譜法研究各類(lèi)藥物與BSA的相互作用已有大量報(bào)道[1-5]，而B(niǎo)SA與CP的相互作用卻未見(jiàn)報(bào)道。筆者探討了3個(gè)溫度下頭孢他美酯與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、類(lèi)型、部位、藥物協(xié)同作用、藥物對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，以期對(duì)該類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的理論信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

日本日立公司F-4600型熒光光譜儀，美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司Cary 50型紫外—可見(jiàn)光譜儀，上海虹益儀器儀表有限公司pHS-3C型精密酸度計(jì)，上海一恒科技有限公司HWS12型超級(jí)恒溫水浴。頭孢他美酯，71.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)；牛血清白蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，放入4 ℃的冰箱保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。其它試劑為分析純，用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

依次加入CP溶液(0，0.206 5，0.413 1，0.619 6，0.826 2，1.032 7，1.290 9，1.549 1，1.807 2，2.065 4，2.323 6，2.581 8)×10-5mol/L (編號(hào)分別為1～12)，BSA溶液(1.5×10-6mol/L) 1.0 mL，0.5 mol/L NaCl 2.0 mL，0.2 mol/L Tris-HCl(pH 7.4) 2.5 mL于10 mL比色管中定容。在289，299，309 K溫度下孵育35 min后，掃描熒光光譜和同步熒光光譜(Δλ=15 nm和60 nm)，記錄不含CP時(shí)體系的熒光強(qiáng)度F0和含CP時(shí)體系的熒光強(qiáng)度F。按照上述條件，掃描體系的吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件的優(yōu)化

優(yōu)化了體系的加入順序，pH值，BSA濃度，孵育時(shí)間等。最佳條件為按照CP，BSA，NaCl，Tris-HCl的順序加入，pH 7.4，BSA濃度為1.5×10-6mol/L，孵育35 min后，猝滅效果最佳。

2.2 CP-BSA體系的猝滅光譜

圖1為CP-BSA體系的熒光發(fā)射光譜圖，其最大激發(fā)波長(zhǎng)λex位于280 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)λem位于345 nm處。隨著CP濃度的增大，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸減小，表明CP對(duì)BSA的熒光有猝滅，發(fā)生了相互作用。

2.3 猝滅機(jī)理的探討

熒光猝滅機(jī)理通?？煞譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5～7]。在靜態(tài)猝滅過(guò)程中，溫度越高，穩(wěn)定性越差，猝滅常數(shù)Ksv越小[5～7]。因分子擴(kuò)散起主導(dǎo)，在動(dòng)態(tài)猝滅中Ksv會(huì)隨著溫度的升高而增大。猝滅過(guò)程常用Stern-Volmer方程[5～7]表示：F0/F=1+Kqτ0[CP]=1+Ksv[CP]，式中[CP]為頭孢他美酯的濃度，加入CP前后的熒光強(qiáng)度F0和F。Kq為速率常數(shù)；τ0為熒光壽命，10-8s數(shù)量級(jí)左右[5～7]。在289，299，309 K時(shí)作Stern-Volmer曲線(圖2)，由圖2可知，隨著溫度的升高，直線斜率即Ksv降低，與靜態(tài)猝滅機(jī)理吻合。表1中3個(gè)溫度下的Kq值比2.0×1010L·(mol·s)-1(最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù))[5～7]大2個(gè)數(shù)量級(jí)，表明不是動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程。

圖1 CP-BSA的熒光光譜 圖2 3個(gè)不同溫度下的Stern-Volmer圖

表1 Stern-Volmer方程與相關(guān)參數(shù)

2.4 Lineweaver-Burk方程

表2 Lineweaver-Burk方程及相關(guān)參數(shù)

2.5 紫外光譜

紫外吸收光譜也是一種區(qū)分猝滅機(jī)理的重要方法[8～10]，繪制體系的吸收光譜圖(圖3)；對(duì)比曲線1(BSA)和曲線2～曲線12(CP-BSA)可知，隨著CP的加入，使BSA吸收峰的峰形與峰位(275nm藍(lán)移到264nm)以及吸收強(qiáng)度都發(fā)生了改變，表明推斷CP與BSA靜態(tài)猝滅機(jī)理是合理的。

2.6 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

BSA大分子與CP小分子結(jié)合的結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可由：雙對(duì)數(shù)方程lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[CP][8～10]求出。在289，299，309K溫度下繪制lg(F0-F)/F～lg[CP]的雙對(duì)數(shù)曲線，求得Kb和n值(表3)。隨溫度的升高，Kb和n逐漸減小，也驗(yàn)證了靜態(tài)猝滅機(jī)理的正確性。n≈1，形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但高溫不利于CP與BSA結(jié)合。

表3 結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

2.7 作用力類(lèi)型

根據(jù)熱力學(xué)方程[10～12]算出反應(yīng)體系的熵變?chǔ)，焓變?chǔ)和吉布斯自由能變?chǔ)(表4)。由表4可知，ΔG<0， ΔH<0， ΔS<0，表明CP與BSA結(jié)合為自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng)，氫鍵和范德華力起主要作用。

表4 不同溫度下的熱力學(xué)常數(shù)和nH值

2.8 結(jié)合位置的確定

BSA 是由二硫鍵連接起來(lái)的幾個(gè)螺旋狀區(qū)域所組成的[13～15]。藥物與BSA結(jié)合位點(diǎn)分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。位點(diǎn)Ⅰ位于亞螺旋域ⅡA中，而位點(diǎn)Ⅱ和Ⅲ位于亞螺旋域ⅢA的疏水腔中[13～15]。由圖4可知，λex=280，295 nm的CP-BSA光譜曲線沒(méi)有重疊，表明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中；λex=280 nm的熒光猝滅程度比λex=295 nm的大，結(jié)合位置主要在亞螺旋域ⅡA中。

圖3 BSA(曲線1)和CP-BSA(曲線2～曲線12)紫外吸收光譜 圖4 λex=295，280 nm的熒光光譜

2.9 藥物協(xié)同作用

藥物的協(xié)同作用常用Hill方程[13～15]進(jìn)行分析：lgS(Sm-S) =lgS+nHlg [CP]，式中nH為Hill系數(shù)，K為結(jié)合常數(shù)，S=(F0-F)/F0為飽和分?jǐn)?shù)，1/S對(duì)1/[CP]作圖，截距為1/Sm，由表4可知，各溫度下的nH值都略小于1，并隨溫度的增加nH值減小，表明CP分子之間呈現(xiàn)出微弱的負(fù)協(xié)同作用，即一個(gè)CP結(jié)合到BSA結(jié)合位點(diǎn)上后，會(huì)阻礙后繼藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合。溫度越高，藥物越難結(jié)合到位點(diǎn)上。這種負(fù)協(xié)同作用可能是由于藥物分子結(jié)構(gòu)決定的，CP濃度的加大，導(dǎo)致后續(xù)CP對(duì)BSA的親和性降低。

2.10 CP對(duì)BSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜法是分析藥物小分子對(duì)影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象的常用方法，在Δλ=15 nm(酪氨酸殘基)和Δλ=60 nm(色氨酸殘基)條件下繪制CP-BSA體系的同步熒光光譜(圖5)[13～15]。由圖5可知，隨CP濃度的增大，這兩種氨基酸殘基的λem幾乎沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)，說(shuō)明CP的加入不改變了BSA的構(gòu)象[13～15]。酪氨酸殘基的猝滅程度大于色氨酸殘基，表明結(jié)合位點(diǎn)偏向于酪氨酸。

圖5 同步熒光光譜圖

3 結(jié) 論

頭孢他美酯與BSA的相互作用是靜態(tài)猝滅過(guò)程，兩者通過(guò)氫鍵和范德華力相互作用，因有結(jié)合位點(diǎn)，藥物能被蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存；有微弱的藥物負(fù)協(xié)同作用，結(jié)合位置在BSA的亞螺旋域ⅡA中，靠近酪氨酸殘基，CP對(duì)BSA構(gòu)象幾乎不產(chǎn)生影響，這些重要信息為后續(xù)頭孢類(lèi)藥物的研發(fā)和進(jìn)一步探討CP在生物體內(nèi)與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Studies on Interaction Between Cefetamet Pivoxil and Bovine Serum Albumin

LIU li, CHENG Feixiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University,Qujing Yunnan, 655011, China)

The interaction between Bovine Serum Albumin (BSA) and Cefetamet Pivoxil(CP) was studied with spectrometry under the optimal conditions. The results showed that the fluorescence of BSA was quenched by CP, which was a static quenching process. BSA could transport CP, which was mainly driven by hydrogen bond and Vander Waals force. The primary binding site for CP was located at sub-domain ⅡA of BSA. There displayed some weakly negative cooperative effect. The conjugation reaction would hardly affect the conformation of BSA, and the binding site was near to tyrosine residue. This test could provid references for its clinical application.

cefetamet pivoxil; bovine serum albumin; fluorescence spectroscopy

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.01.009

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2015C090Y)。

2016-03-02

O482.31;O657.3

A

1672-7983(2017)01-0044-04

劉里(1982-)，女，講師。主要研究方向：藥物化學(xué)和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用。