李燕++鄧倩++李小清++馬洪鑫++李彥斌++劉俊林

摘 要：目的 初步研究紅景天內(nèi)生真菌不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞（Huh7）生長的抑制情況，篩選出其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞（Huh7）的生長有較大抑制作用而對(duì)BHK細(xì)胞生長有較小抑制作用的紅景天內(nèi)生真菌菌株并且得到其抑制率。方法 采用液體發(fā)酵法、萃取法、冷凍真空干燥法提取紅景天內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物，采用MTT法研究紅景天內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞、BHK細(xì)胞生長的抑制效果。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)初步找到4株紅景天內(nèi)生真菌其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞生長的抑制率達(dá)到或超過50%，3株紅景天內(nèi)生真菌其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)BHK細(xì)胞生長的抑制率不超過10%。結(jié)論 紅景天內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞有抑制作用，有待于我們更多次的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證此結(jié)論，在驗(yàn)證過程中需要做到更加規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作以及避免實(shí)驗(yàn)過程中造成的污染問題。

關(guān)鍵詞：紅景天 內(nèi)生真菌 肺癌細(xì)胞 BHK細(xì)胞 MTT

中圖分類號(hào)：R28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2017）02（b）-0249-02

肺癌是一種常見的癌癥，肺癌一般指的是肺臟實(shí)質(zhì)部分的癌變，根據(jù)全國腫瘤登記中心2014發(fā)布的數(shù)據(jù)，我們可以知道我國肺癌死亡人數(shù)達(dá)到48.66萬[1]， 2012年，美國新增肺癌患者22.6萬左右，因?yàn)榉伟┧劳鋈藬?shù)為16.0萬左右，調(diào)查顯示，肺癌也將成為我國腫瘤死亡主要原因之一[2]。目前治療肺癌的醫(yī)療方法依然是通過外科手術(shù)切除早期肺癌腫瘤，通過放療、化療等手段進(jìn)行治療也是重要手段，但是放療、化療、外科手術(shù)對(duì)患者造成的不良反應(yīng)非常大，尋找新型的治療肺癌的天然藥物顯得非常重要。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有許多關(guān)于肺癌治療的天然藥物、特效藥物的研發(fā)報(bào)道，但是沒有哪一種藥物是非常有效且無不良反應(yīng)的。對(duì)治療肺癌的新型天然藥物的探索依然有許多困難亟待人們?nèi)ソ鉀Q。

紅景天是景天科多年生草本植物，紅景天具有抗氧化、抗疲勞、抗缺氧、抗輻射的功效，中醫(yī)里紅景天被用來治療多種疾病[1]。近年來的研究證明，紅景天的有效成分具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫功能、治療腫瘤等作用[3]。該研究初步研究紅景天內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞（Huh7）增殖的抑制情況，以期為今后相關(guān)的研究提供一定參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）紅景天內(nèi)生真菌菌株：西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生物與制藥實(shí)驗(yàn)室保藏。

（2）癌細(xì)胞（Huh7）：西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保藏細(xì)胞。

（3）試劑：瓊脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙酸乙酯：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；葡萄糖：天津市北辰方正試劑廠；胰酶：取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；細(xì)胞培養(yǎng)液：取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；胎牛血清：杭州四季清生物制品公司；MTT：Solarbio DMSO：VETEV。

1.2 方法

1.2.1 液體PDA培養(yǎng)基制作

新鮮去皮馬鈴薯200 g，切碎，加蒸餾水煮沸30 min，然后用8層紗布過濾兩遍，留下過濾液備用，往過濾液里加入葡萄糖20 g，再用蒸餾水定容至1 000 mL，最后高溫高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻待用[2]。

1.2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取

將活化的真菌菌株接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床上150 r/min，28 ℃發(fā)酵7～14 d，終止發(fā)酵。用8層紗布過濾發(fā)酵物，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次，混合提取液，冷凍真空干燥后得到發(fā)酵產(chǎn)物[3-6]。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與MTT測(cè)試

細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)用胰酶消化一定時(shí)間，加入培養(yǎng)液吹打混勻細(xì)胞，培養(yǎng)BHK細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入新生牛血清10%，培養(yǎng)肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入10%的胎牛血清，于CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h觀察1次。將濃度為1.0×104個(gè)/ mL細(xì)胞懸液，用微量加樣器接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 ?L，接種24孔，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從培養(yǎng)第24 h開始，每24 h分別于超凈工作臺(tái)上吸出3孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算其平均值。以細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)、細(xì)胞生長時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

將紅景天不同菌株的發(fā)酵產(chǎn)物用細(xì)胞培養(yǎng)液配置成濃度為5 ug/mL的實(shí)驗(yàn)組液待用。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后，以1×105細(xì)胞密度加入96孔板中，每孔100 uL，培養(yǎng)10 h后，分別加入實(shí)驗(yàn)組用液100 uL，對(duì)照組加等量培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加5 mg/mL的MTT 20 uL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入200 uL的DMSO，輕輕震蕩，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)每孔OD值，計(jì)算平均值，并且按以下公式計(jì)算抑制率：抑制率=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%[5-10]結(jié)果取整數(shù)。

實(shí)驗(yàn)將得到的12株真菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物都對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)肺癌細(xì)胞有較大抑制作用的真菌菌株，再將這些真菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)BHK細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)肺癌細(xì)胞有較大抑制作用而對(duì)BHK細(xì)胞生長抑制作用較小的紅景天內(nèi)生真菌菌株。

2 結(jié)果與分析

由表1可知：菌株HJT-16-3、HJT-16-14、HJT-16-17、HJT-16-23的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)Huh7細(xì)胞的抑制活性均達(dá)到和超過50%；其余11株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)Huh7細(xì)胞都顯示有抑制作用，但是其抑制率不超過5%，筆者認(rèn)為這可能是在加入測(cè)試藥液后因?yàn)榕囵B(yǎng)液成分的突然改變引起細(xì)胞死亡，并不是因?yàn)樗幰簩?duì)細(xì)胞的生長有抑制作用；菌株HJT-16-8、HJT-16-17、HJT-16-32的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)BHK細(xì)胞的抑制作用小，不超過10%，其余菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)BHK細(xì)胞的抑制率較大，在68%～84%之間；所有菌株中，HJT-16-17對(duì)肺癌細(xì)胞（Huh7）的抑制率為75%，而對(duì)BHK細(xì)胞的抑制率僅為9%，為該研究所要尋找的目標(biāo)菌株。

3 討論

肺癌嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量，當(dāng)今治療肺癌的有效方法依然是外科手術(shù)切除或者化學(xué)治療、物理放射治療，這些治療方法都會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)，而且不一定能夠治愈。目前，尋找治療癌癥的靶向藥物和天然新型藥物為研究的熱點(diǎn)。該研究采用液體發(fā)酵、液相萃取、冷凍真空干燥、MTT實(shí)驗(yàn)方法初步研究紅景天內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞生長的影響情況并且篩選出能夠發(fā)酵產(chǎn)生對(duì)肺癌細(xì)胞生長有較好抑制作用的物質(zhì)的菌株，研究的目的是為了尋找對(duì)肺癌細(xì)胞有抑制作用的藥用物質(zhì)，同時(shí)考慮到藥用物質(zhì)應(yīng)該對(duì)正常細(xì)胞無較大危害，所以該研究同時(shí)選取BHK細(xì)胞為代表，測(cè)試了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)正常BHK細(xì)胞生長的影響。該研究找到一株符合研究目標(biāo)的菌株HJT-16-17，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞（Huh7）的抑制率為75%，而對(duì)BHK細(xì)胞的抑制率為9%。

該研究所用的紅景天內(nèi)生真菌保藏菌株是還沒有進(jìn)行過分子鑒定的菌株，而且該研究沒有對(duì)所得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析，沒有對(duì)所得到的發(fā)酵產(chǎn)物抑制Huh7增殖的機(jī)制進(jìn)行研究，這些問題將在接下來的研究中去完成。

參考文獻(xiàn)

[1] 張立娟，張力.靈芝多糖聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖抑制作用的研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43（9）：1670-1674.

[2] 沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].4版.北京：高等教育出版社，2014.

[3] 張麗楠，李屹，劉永琦，等.紅景天苷現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展[J].臨床薈萃，2011，26（21）：1931.

[4] 吳曉民，任謂明，楊信東，等.高山紅景天內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)紅景天苷菌株的篩選[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（11）：2769-2771.

[5] 徐佳，伍春蓮，彭聰，等.雷公藤紅素對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（1）：51-56.

[6] 王夢(mèng)亮，郭婷婷，張娜莎，等.2株長白紅景天內(nèi)生真菌的鑒定及抗氧化活性條件的優(yōu)化[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015（27）：667-677.

[7] 李勇，叢斌，董玫，等.東北紅豆杉中紫衫烷類化合物抑制人類肺癌細(xì)胞增殖活性的研究[J].腫瘤，2010，30（8）：656-660.

[8] 張亞男，王珂.非小細(xì)胞肺癌靶向治療進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志，20113，7（12）：5459-5463.

[9] 王晶.秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞H125體外增殖的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（2）：507-509.

[10] 趙珊，楊光磊，呂英謙，等.洛鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞作用的初探[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16（1）：14-18.