免疫球蛋白IgG3恒定區(qū)和觸珠蛋白與肺結核病的相關性分析

施力穎 牟寶華 江婷婷

免疫球蛋白IgG3恒定區(qū)和觸珠蛋白與肺結核病的相關性分析

施力穎 牟寶華 江婷婷

目的 探討免疫球蛋白IgG3恒定區(qū)（IGHG3）和觸珠蛋白（HPT）與肺結核病的相關性。方法 采用ELISA法檢測IGHG3和HPT在50例初治肺結核病患者和36例健康對照者血清中的含量；并收集肺結核病患者臨床檢測資料，包括血漿纖維蛋白原（FIB）、PT、APTT、TT、血糖、C反應蛋白（CRP）、TG等檢測指標，分析差異情況以及IGHG3和HPT與患者臨床檢測結果的相關性。結果 肺結核病患者IGHG3、HPT含量明顯高于健康對照組（均P＜0.01）。肺結核病患者FIB、APTT、CRP值與正常范圍有明顯差異（均P＜0.05）。IGHG3含量與CRP含量呈正相關（r=0.372，P=0.014），HPT含量與肺結核病患者空洞型病變呈正相關（r=0.28，P= 0.04）。通過邏輯回歸將IGHG3和HPT組成蛋白質模型，ROC曲線結果顯示該模型鑒別肺結核病和健康對照組的靈敏度為90.90%，特異度為80.80%，AUC值為0.866。結論 IGHG3和HPT可能是肺結核病潛在生物標志物。

肺結核病 血清 免疫

肺結核病是結核分枝桿菌（Mtb）感染引起的慢性肺部感染性疾病，占各器官結核病總數(shù)的80%以上。據(jù)WHO最新報道，2015年全球新發(fā)肺結核病患者1 040萬例，死亡人數(shù)達180萬例[1]。血清蛋白質參與機體凝血、免疫、代謝、物質交換、運輸、生長信號調節(jié)等多種重要的生理功能，其組成和含量變化，受機體病理狀態(tài)的影響，對于疾病的致病機制、分子標志物和藥物作用靶點研究具有重要意義。因此，研究肺結核病患者血清差異表達蛋白質對肺結核病的防控具有重要作用。研究表明，肺結核病患者機體會對Mtb產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應，與巨噬細胞表面Fc受體的提呈作用及病理改變密切相關[2]。免疫球蛋白G（IgG）是血清中含量最高的免疫球蛋白，具有重要的免疫學功能，人IgG3對蛋白質及多肽類抗原的親和力較強，可與Fc受體結合，免疫功能較強[3]，但在肺結核病患者與正常人之間的差異情況卻未曾研究。肺結核病患者組織肉芽腫內的巨噬細胞處于低氧狀態(tài)[4]，能抑制Mtb感染[5]。當組織低氧時，會引起觸珠蛋白（HPT）含量升高，這類蛋白質在肺結核病患者與正常人之間的差異情況也未曾研究。因此，筆者擬采用ELISA法測定肺結核病患者血清中IgG3恒定區(qū)（IGHG3）和HPT含量，并與健康人群進行對照，分析兩者與肺結核病的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2012年1月到2014年5月中國醫(yī)科大學紹興醫(yī)院的初治活動性肺結核病患者50例，男25例，女25例，年齡18～75（41.54±15.50）歲。依據(jù)中國衛(wèi)生部發(fā)布的肺結核病診斷標準，凡符合下列項目之一者即確診為肺結核?。海?）痰結核菌檢查陽性（包括涂片或培養(yǎng)）；（2）痰結核菌陰性，胸部X線檢查有典型的活動性結核病變表現(xiàn)；（3）疑似肺結核病者，經(jīng)臨床X線檢查隨訪、觀察后，可排除其他肺部病變；（4）臨床上已排除其他原因引起之胸腔積液，可診斷結核性胸膜炎。排除AIDS、肺外結核、糖尿病、乙肝等其他疾病，以及免疫抑制劑使用者。收集2012年1月到2014年5月浙江醫(yī)院的健康獻血者36例作為健康對照組，男17例，女19例，年齡18～75（43.06±16.38）歲。無肺結核病、糖尿病、乙肝、AIDS等疾病。本研究經(jīng)每位受試者知情同意，并由華南理工大學醫(yī)學院倫理委員會批準。兩組患者性別、年齡等一般資料比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

1.2 IGHG3、HPT檢測 受試者均于晨起空腹抽血5.0ml于不抗凝真空采血管中，4h內于4℃、3 000r/min離心10min，吸取上層血清，血清分裝后保存于－80℃?zhèn)溆?。同時，收集受試者臨床檢測資料。人IGHG3 ELISA試劑盒（中國CUSABIO公司），其稀釋倍數(shù)為1∶5 000，檢測范圍是2.75～2 000ng/ml；人Haptoglobin ELISA試劑盒（英國Abcam公司），其稀釋倍數(shù)為1∶2 000，最低檢測濃度是0.07μg/ml。具體實驗操作：（1）使用前將試劑盒中所有試劑、工作標準品和樣品，置于室溫20～30℃。（2）取出96孔板，并在每孔加入25μl標準品或樣品，立即向每個孔中加入25μl生物素化的蛋白質，混勻后蓋上密封膠帶，室溫孵育1h。（3）用200μl洗滌緩沖液洗滌5次，倒出內容物，在吸水紙巾上輕拍4～5次，徹底清除液體。（4）每孔中加入50μl鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連接物（SP連接物），室溫孵育30min。（5）再次洗滌5次。（6）每孔加入50μl底物，并于室溫孵育10min或直至液體顏色變藍。（7）每孔加入50μl終止液，并立即于450nm處讀取吸光度。進行兩次實驗重復。ELISA試劑盒所使用的96孔板，其底部預先包被有被測蛋白質的特異性抗體，待加入標準品或被檢樣本后，相應的蛋白質會與預先包被的抗體結合，孵育和洗滌后；加入的生物素化的特異性蛋白質抗體，會與已固定的蛋白質結合，孵育和洗滌后；加入SP連接物與之結合；最后加入顯色底物，孵育后終止顯色。采用微孔板分光光度計（美國Bio－Rad公司）檢測吸光度值，根據(jù)檢測到的吸光度值，繪制的標準曲線測量出樣本中的蛋白質含量。

1.3 肺結核病患者臨床檢測指標分析 對患者臨床檢測指標進行收集和統(tǒng)計分析，包括血漿纖維蛋白原（FIB）、PT、APTT、TT、血糖、C反應蛋白（CRP）、TG等臨床檢測值，并與正常范圍中值進行比較。觀察肺結核病患者胸部CT檢查結果：是否存在空洞型病變存以及空洞型病變的類型。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS version 16.0和GraphPad Prism version 5統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)，兩組間比較采用Mann－Whitney U檢驗。采用單樣本t檢驗檢測肺結核病患者臨床檢測結果，用Spearman相關分析蛋白質檢測值與臨床檢測指標的相關性。使用MedCalc軟件（version 11.4）進行ROC曲線分析蛋白質的靈敏度和特異度，通過邏輯回歸方法建立蛋白質模型。

2 結果

2.1 兩組患者IGHG3和HPT含量及ROC曲線分析ELISA實驗結果顯示，肺結核病患者組IGHG3含量為2.16μg/μl，HPT含量為 1 632.31μg/ml，健康對照組IGHG3含量為1.02μg/μl，HPT含量為796.00μg/ml，兩組IGHG3、HPT含量的比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；ROC曲線分析結果顯示，IGHG3蛋白的AUC為0.79，靈敏度為74.0%，特異度為79.4%（圖1a）；HPT蛋白AUC值為0.684，靈敏度為48.0%，特異度為86.1%（圖1b）。通過邏輯回歸建立蛋白質模型，邏輯回歸方程為Logit（p）=－2.6441+1.1693×（IGHG3）+0.0009406×（HPT），該模型鑒別診斷肺結核病AUC值為0.866，靈敏度為90.90%，特異度為80.80%（圖1c）。

2.2 肺結核病患者臨床檢查指標分析 肺結核病患者FIB、APTT、CRP值與正常范圍比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），PT、TT、血糖、TG值與正常范圍比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），詳見表1。根據(jù)患者胸部CT檢查結果，將病理改變分為空洞型和非空洞型，空洞型肺結核包括蟲蝕樣空洞、薄壁空洞、干酪空洞和纖維空洞，包括多發(fā)空洞或單發(fā)空洞；CT檢查結果顯示無空洞的患者為非空洞型肺結核。在進行統(tǒng)計學分析時，將空洞型患者標記為1，將非空洞型患者標記為0，再采用Spearman相關分析結核空洞型、非空洞型與IGHG3、HPT含量的相關性；同時，分析FIB、PT、APTT、TT、血糖等檢測結果與IGHG3和HPT含量的相關性。分析結果顯示，IGHG3與CRP呈正相關（r=0.372，P= 0.014），HPT與肺結核病患者空洞病變呈正相關（r= 0.280，P=0.04），IGHG3、HPT與其他臨床檢測指標無相關性，詳見表2。

圖1 IGHG3、HPT的ROC曲線分析圖（a：IGHG3；b：HPT；c：IGHG3+HPT）

表1 肺結核病患者臨床檢測指標結果分析

表2 IGHG3、HPT與臨床檢測指標的相關性

3 討論

肺結核病是一種慢性感染性疾病，固有免疫在Mtb入侵時起著機體免疫首要防線的關鍵作用[6]，肉芽腫的形成是肺結核病的重要病理過程，其與單核細胞和巨噬細胞等免疫過程相關[7]。隨著Mtb感染程度的不同，患者可表現(xiàn)為不同的病理改變。肺結核病的病理改變主要有增生性病變、滲出性病變、變質性病變。病理改變情況受機體的免疫力、變態(tài)反應性，以及Mtb的入侵數(shù)量和毒力強度影響較大。本研究檢測結果顯示，肺結核病患者FIB、APTT、CRP水平與正常范圍有統(tǒng)計學差異，表明患者的凝血可能存在異常，并且可能存在急性炎癥反應。

有研究表明固有免疫應答與肺結核病的進展不無相關[8-9]，這種免疫應答機制同樣會導致機體的組織損傷[10]。機體會針對Mtb及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應（Ⅳ型變態(tài)反應），它以T淋巴細胞為介導，并以巨噬細胞為效應細胞，以另一亞群T淋巴細胞釋放炎性介質、淋巴細胞毒素等，使局部組織出現(xiàn)滲出性炎癥甚至干酪樣壞死，表現(xiàn)為病灶惡化、浸潤、進展等病理變化[2]。IGHG3能與中性粒細胞、巨噬細胞上的IgG Fc受體(FcγR)結合，從而發(fā)揮對巨噬細胞的調理作用，并促進巨噬細胞吞噬功能；IGHG3還能與樹突細胞表面表達的FcγRI高親和結合[11]，增加樹突細胞將抗原提呈給T淋巴細胞的作用[12]。本實驗中，肺結核病患者IGHG3水平顯著高于健康對照組。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)患者IGHG3含量與急性炎癥反應蛋白CRP含量存在顯著正相關。因此，筆者認為IGHG3與肺結核病患者的Ⅳ型變態(tài)反應相關，可能是通過巨噬細胞作用及T淋巴細胞的介導的相關作用參與肺結核病的病理改變過程；同時，升高的IGHG3還可能與患者的急性炎癥反應相關。

有研究表明低氧狀態(tài)能抑制Mtb感染[5]，Mtb侵入機體巨噬細胞形成肉芽腫[13]，而肉芽腫內及被Mtb感染的巨噬細胞處于低氧狀態(tài)[14]。組織低氧狀態(tài)會導致血液中Hb含量增加。Hb能將肺表面的氧運輸至需氧組織，提高血液中的氧利用率，但Hb含量增加導致氧自由基的產(chǎn)生，從而引起組織氧化性損傷的發(fā)生[15]。HPT是一種急性反應蛋白，能結合并消除Hb。本實驗中，肺結核病患者血清HPT含量顯著高于正常人，筆者認為HPT可能與肺結核病患者的組織低氧狀況相關，與患者病理改變相關，HPT含量的升高有助于減少低氧引起的組織氧化性損傷的發(fā)生。

空洞是肺結核病的常見影像學表現(xiàn)，是由浸潤型肺結核、肺結核球的干酪樣壞死組織發(fā)生液化、脫落和排出形成。肺結核空洞的形成是結核活動性的表現(xiàn)之一[16]。當機體免疫力低下，結核桿菌感染后病變不易局限時，組織容易液化壞死而形成空洞[17]。肺結核病患者HPT含量顯著高于健康睡著組，并與空洞的存在呈正相關，表明肺結核病患者血清HPT含量的升高，提示了患者結核活動性的增強。

此外，ROC曲線分析和邏輯回歸分析結果顯示，IGHG3和HPT組成的蛋白質模型，在診斷肺結核病患者時具有良好的靈敏度和特異度，該蛋白質模型的AUC為0.866，表明血清IGHG3和HPT是肺結核病的潛在生物標志物。

[1] World Health Organization.GlobalTuberculosis Report 2016.http: //www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/

[2] Lange C,Sester M.TB or not TB:the role of immunodiagnosis[J]. EurJ Immunol,2012,42(11):2840-2843.doi:10.1002/eji.201242950.

[3] Bruhns P,Iannascoli B,England P,et al.Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses[J].Blood,2009,113(16):3716-3725.doi: 10.1182/blood-2008-09-179754.

[4] Tsai M C,Chakravarty S,Zhu G,et al.Characterization of the tuberculous granuloma in murine and human lungs:cellular composition and relative tissue oxygen tension[J].Cell Microbiol, 2006,8(2):218-232.doi:10.1111/j.1462-5822.2005.00612.x.

[5] Froguel P,Ndiaye N C,Bonnefond A,et al.A Genome-Wide Association Study Identifies rs2000999 as a Strong Genetic Determinant of Circulating Haptoglobin Levels[J].PLOS ONE,2012,7 (3):e32327.doi:10.1371/journal.pone.0032327.

[6] Wang C,Li Y Y,Li X,et al.Serum complement C4b,fibronectin, and prolidase are associated with the pathological changes of pulmonarytuberculosis[J].BMCInfectDis,2014,14:52.doi:10.1186/ 1471-2334-14-52.

[7]李雪冰,李寶蘭,賴百塘,等.肺結核患者血清MMP-9和VEGF水平檢測的臨床研究[J].中國防癆雜志,2007,29(2):184-185.

[8] Kleinnijenhuis J,Oosting M,Joosten L A,et al.Innate immune recognition of Mycobacterium tuberculosis[J].Clin Dev Immunol, 2011,2011:405310.doi:10.1155/2011/405310.

[9] VankayalapatiR,Barnes P F.Innate and adaptive immune responses to human Mycobacterium tuberculosis infection[J].Tuberculosis(Edinb),2009,89(Suppl1):S77-S80.doi:10.1016/S1472-9792(09)70018-6.

[10] Hernandez-Pando R,Orozco H,Aguilar D.Factors that deregulate the protective immune response in tuberculosis[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2009,57(5):355-367.doi:10.1007/ s00005-009-0042-9.

[11] Nimmerjahn F,Ravetch J V.Fcγ receptors as regulators of immune responses[J].Nat Rev Immunol,2008,8(1):34-47.doi:10. 1038/nri2206.

[12] Maglione P J,Xu J,Casadevall A,et al.Fc γ receptors regulate immune activation and susceptibility during Mycobacterium tuberculosis infection[J].J Immunol,2008,180(5):3329-3338.

[13] Russell D G,Cardona P J,Kim M J,et al.Foamy macrophages and the progression of the human tuberculosis granuloma[J]. Nat Nat Immunol,2009,10(9):943-948.doi:10.1038/ni.1781.

[14] Nickel D,Busch M,Mayer D,et al.Hypoxia triggers the expression of human β defensin 2 and antimicrobial activity against Mycobacterium tuberculosis in human macrophages[J].J Immunol,2012,188(8):4001-4007.doi:10.4049/jimmunol.

[15] Babu R,Bagley J H,Di C,et al.Thrombin and hemin as central factors in the mechanisms of intracerebral hemorrhage-induced secondary brain injury and as potential targets for intervention[J].Neurosurg Focus,2012,32(4):E8.doi:10.3171/ 2012.1.FOCUS11366.

[16] 楊鈞,張海青,周新華,等.肺結核空洞的CT表現(xiàn)及病理基礎[J].中國醫(yī)學影像技術,2007,23(12):1831-1833.

[17] 卜建玲,馬玙.糖尿病與肺結核[J].中國抗生素雜志,2004,29(12): 738-741.

Serum IGHG3 and HPT levels in patients with pulmonary tuberculosis

SHI Liying,MOU Baohua,JIANG Tingting.Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

Tuberculosis Serum Immunity

2017-01-16）

（本文編輯：嚴瑋雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.9.2017-130

華南理工大學醫(yī)學院科學研究項目(yxy2016006)

310013 杭州，浙江醫(yī)院檢驗科（施力穎）；中國醫(yī)科大學紹興醫(yī)院科教科（牟寶華）；華南理工大學醫(yī)學院（江婷婷）

江婷婷，E-mail：ttjiang@scut.edu.cn

【 Abstract】 Objective To investigate serum Ig Gamma-3 Chain C Region(IGHG3)and Haptoglobin(HPT)levels in patients with pulmonary tuberculosis(TB).Methods Serum IGHG3 and HPT levels were tested by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)in 50 TB patients and 36 healthy subjects.Plasma fibrinogen(FIB),prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT),thromboplastin time(TT),blood glucose,C reaction protein(CRP),triglyceride(TG)were measured. Results Serum IGHG3)and HPT levels in TB patients were significant higher than those in healthy controls(P＜0.0001 and P= 0.0037).There were significant differences in plasma FIB,APTT and CRP levels between TB patients and healthy controls (P= 0.04,P=0.004,P=0.0001,respectively).Serum IGHG3 level was significantly correlated with serum CRP(r=0.372,P=0.014),and the serum HPT level was significantly correlated with the existence of tuberculosis cavity(r=0.28,P=0.04).A protein model consisting of IGHG3 and HPT was established by logistic regression analysis,and the sensitivity,specificity,and area under curve(AUC)of the model was 90.90%,80.80%,and 0.866,respectively. Conclusion IGHG3 and HPT may be potential biomarkers for TB patients.