畢穎敏， 沈 震， 董 棟， 吳 湜， 胡付品， 楊 帆

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌藥物敏感性及 blaKPC基因檢出率

畢穎敏， 沈 震， 董 棟， 吳 湜， 胡付品， 楊 帆

目的 了解復旦大學附屬華山醫(yī)院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）對常用抗菌藥物的敏感性及 blaKPC基因的檢出率。方法 收集 2014 年 1－12 月臨床分離的 CRKP，微量肉湯稀釋法測定 CRKP 對常用抗菌藥物的敏感性 ；聚合酶鏈反應（PCR）擴增 blaKPC基因。結果 共收集 CRKP 205 株，主要分離自呼吸道標本（76.1%，156/205）和尿標本（18.5%，38/205）。藥敏試驗結果顯示，CRKP 對大多數(shù)抗菌藥物高度耐藥，除對多黏菌素 E、替加環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑和阿米卡星的耐藥率分別為 1.5%、0.5%、51.0% 和 74.9% 外，對其他抗菌藥物的耐藥率在 85%～100% ；87.8%（180/205）菌株為 blaKPC基因陽性株。結論 CRKP 對多黏菌素和替加環(huán)素之外的多數(shù)臨床常用抗菌藥物呈高度耐藥 ；產(chǎn)KPC 型碳青霉烯酶是CRKP 對碳青霉烯類耐藥最主要的耐藥機制。

碳青霉烯類耐藥 ； 肺炎克雷伯菌 ； 敏感性 ； blaKPC基因

近年來腸桿菌科細菌尤其是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率在全球迅速升高[1-4]，給抗菌治療帶來嚴重挑戰(zhàn)，其中碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯 菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP） 更 被 美 國 CDC 列 為 緊 迫 的 威 脅（urgentthreat）（http ：//www.cdc.gov/ drugresistance/threatreport-2013/）。產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的耐藥機制， KPC 型碳青霉烯酶是我國臨床分離肺炎克雷伯菌中最常見的碳青霉烯酶[5]。本文通過分析復旦大學附屬華山醫(yī)院 CRKP菌株對常用抗菌藥物的敏感性及其blaKPC基因的檢出率，為 CRKP 感染在現(xiàn)有條件下的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年1－12月我院臨床分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（亞胺培南、美羅培南或厄他培南任一耐藥者）。剔除同一患者同一部位分離的重復菌株。按常規(guī)方法進行菌種鑒定。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 儀器與試劑 抗菌藥物標準品購自中國食品藥品檢定研究院。MH瓊脂、MH肉湯、陽離子調節(jié)肉湯為英國OXOID公司產(chǎn)品；dNTPs（10 mmol/ L）、rTaq酶（5 U/μL）、10×Buffer、分子量Marker DL2000、10×Loading buffer購自TaKaRa 生物工程有限公司，基因擴增引物、瓊脂糖購自上海生工生物工程技術有限公司。PCR擴增儀購自TaKaRa 生物工程有限公司，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用微量稀釋法進行藥敏試驗。多黏菌素E、替加環(huán)素藥敏結果根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會（EUCAST）標準進行判讀，其他抗菌藥物藥敏試驗結果判斷參照美國臨床與實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2014 年標準執(zhí)行。采用WHONET5.6 軟件進行藥敏數(shù)據(jù)分析處理。

1.2.2 blaKPC基因檢測 煮沸法制備細菌 DNA 模板，PCR 法擴增 blaKPC基因。擴增 blaKPC基因通用引物序列為：KPC-F：5’-AGGACTTTGGCGGCTCCAT-3’，KPC-R ：5’-TCCCTCGAGCGCGAGTCTA-3’；反應體系為：總體積 50 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmol/ L），dNTPs（10 mmol/L）4 μL、10×Bufferr 為5 μL，rTaq 酶（5 U/μg）0.25 μL，高壓滅菌 ddH2O 36.75 μL， 模 板 DNA 2 μL。 每 次 反 應 均 設 陰 性、陽性對照。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳后使用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結果，陽性擴增產(chǎn)物進行DNA測序分析，根據(jù)所測序列與GenBank 中 BLAST 程序的序列進行比對（www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/）以確定 blaKPC基因型。

2 結果

2.1 菌株分布

2014年 1－12 月共收集 205 株 CRKP 菌株。標本來源分別為呼吸道標本（76.1%，156/205）、尿 液（18.5%，38/205）、 腦 脊 液（2.0%，4/205）、傷口膿液和分泌物（2.0%，4/205）、血液（1.0%，2/205）、腹水（0.5%，1/205）。

科室分布分別為神經(jīng)外科病區(qū)（49.8%，102/ 205）（其中創(chuàng)傷病區(qū)為 37.1%、其他病區(qū)為 12.2%）、老年病區(qū)（22.9%，47/205）、重癥監(jiān)護病區(qū)（ICU）（9.3%，19/205）、特需病房（6.3%，13/205）、永和分院（3.4%，7/205）、感染病區(qū)（3.4%，7/205）、神經(jīng)內科（2.4%，5/205）、泌尿外科（1.0%，2/205）、急 診 科（0.5%，1/205）、 腎 內 科（0.5%，1/205）、手 外 科（0.5%，1/205）。 在 分 離 出 CRKP 患 者 中，48.8%（100/205）系外院轉入患者，其中神經(jīng)外科病 區(qū) 有 60.8%（62/102）（ 其 中 創(chuàng) 傷 病 區(qū) 有 63.2%，48/76 ；其他病區(qū)有 53.8%，14/26）由外院轉入。

2.2 藥敏試驗結果

2.2.1 CRKP 菌株對抗菌藥物的敏感性 CRKP 菌株對亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為 97.6%、97.6%、98.5% ；對多黏菌素 E 和替加環(huán)素的耐藥率分別為 1.5% 和 0.5%，MIC90均為1 mg/L ；對甲氧芐啶-磺胺甲唑、阿米卡星的耐藥率分別為 51.0% 和 74.9%，對其他抗菌藥物的耐藥率在 85%～100%。見表1。

2.2.2 亞胺培南、美羅培南、多黏菌素和替加環(huán)素對CRKP的MIC的分布 205株CRKP對4種藥物的MIC值分布見表2。CRKP對亞胺培南、美羅培南的MIC多處于較高值，亞胺培南MIC≤4 mg/ L的菌株僅2.9%（6/205），MIC≤16 mg/L的菌株亦僅24.9%（51/205）；美羅培南MIC≤4 mg/ L的菌株僅2.0%（4/205），MIC≤16 mg/L的菌株僅有9.8%（20/205）。對多黏菌素E的MIC≤0.5 mg/L菌株占61.0%（125/205），對替加環(huán)素的MIC≤0.5 mg/L菌株占91.2%（187/205）。

2.3 blablaKPCKPC基因篩查

205 株 臨 床 CRKP 菌株 通 過 PCR 擴 增， 有87.8%（180/205）檢出 blaKPC基因。 blaKPC基因陽性株與陰性株對慶大霉素和頭孢噻肟的耐藥率均無差異，均為 100%，兩者對其他常用抗菌藥物相對比，耐藥率均相近，見表3。

表1 CRKP 對臨床常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates to the commonly used antimicrobial agents

表2 亞胺培南、美羅培南、多黏菌素和替加環(huán)素對 CRKP 的 MIC 分布Table 2 Distribution of the MIC values of imipenem， meropenem， colistin and tigecycline against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae [ n ( % ) ]

3 討論

我院分離的 CRKP菌株主要來自神經(jīng)外科、老年科、ICU 等科室。神經(jīng)外科是我院的重點特色?？疲雀?，床位較多，有高比例的患者系由外院轉入，神經(jīng)外科創(chuàng)傷病區(qū)轉入患者比例尤其高，且入院時常已有耐藥菌感染。此外特需病區(qū)、永和分院（康復病區(qū)，收治較多神經(jīng)外科創(chuàng)傷患者）、ICU 亦有相當比例外院轉入神經(jīng)外科患者。而老年科多為長期住院、反復使用抗菌藥物患者。這提示我院CRKP防控應以神經(jīng)外科及其關聯(lián)病區(qū)、老年科為重點，除消毒、隔離等常規(guī)感控措施外，應著重于開展轉院、轉科患者耐藥菌篩查以避免輸入性耐藥菌的傳播，減少老年科患者的抗菌藥物暴露。我院 CRKP多分離自痰等 呼 吸 道 標 本（76.1%） 和 尿 液（18.5%） 標 本，則提示CRKP感染主要見于呼吸道、尿路，呼吸機相關肺炎、導尿管相關尿路感染應為CRKP感染的預防重點[6]。

表3 blaKPC基因陽性與陰性 CRKP 菌株對臨床常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates to antimicrobial agents in terms of blaKPCgene status

碳青霉烯類藥物這一腸桿菌科細菌感染的重要治療藥物出現(xiàn)耐藥后，腸桿菌科細菌的治療藥物選擇匱乏，在目前窘境下，基于體外藥敏試驗、少數(shù)病例報道和專家意見的推薦治療策略主要為：①以多黏菌素、替加環(huán)素、碳青霉烯類等為核心藥物的聯(lián)合用藥 ；②考慮藥物組織濃度和 PK/PD特點，通過增加給藥劑量、給藥次數(shù)和延長滴注時間等給藥方案優(yōu)化，提高藥效學達標概率；③霧化吸入、鞘內注射等局部用藥提高感染部位組織的藥物濃度[7-9]。

我院分離 CRKP菌株對多黏菌素 E 敏感率為 98.1%，表明多黏菌素是治療 CRKP 感染的重要 選 擇。 但 有 40.0% 菌 株 MIC 值＞0.5 mg/L， 這些患者以多黏菌素單藥治療藥效學達標概率低，兼以多黏菌素可能在治療中發(fā)生誘導耐藥，因此 宜 聯(lián) 合 其 他 藥 物[10]。 我 院 分 離 CRKP 菌 株 對替加環(huán)素敏感率亦高達 98.1%，且 91.2% 菌株的MIC≤0.5 mg/L， 提 示 多 數(shù) 菌 株 在 應 用 替 加 環(huán) 素50 mg，每天 2 次給藥方案即可藥效學達標，但亦有報道替加環(huán)素單藥治療碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）感染病死率高于聯(lián)合治療，仍宜考慮聯(lián)合其他藥物[8]。

Monte Carlo 模擬顯示在碳青霉烯類藥物對腸桿 菌 科 細 菌 MIC≤4 mg/L 甚 至 更 高 至≤16 mg/ L，通 過 增 大 美 羅 培 南 劑 量 至 每 次 2 g、 每 8 小 時 1次，每次滴注時間延長至 3 h，其藥效學達標概率仍可達 85% 以上。而臨床病例報道薈萃分析顯示MIC≤4 mg/L、8 mg/L 和＞8 mg/L 時， 碳 青 霉 烯類單藥治療的療效分別為 69%、60% 和 29%[10-11]。Daikos 等[11]因此認為，當碳青霉烯類對腸桿菌科細菌 MIC≤4 mg/L 時，碳青霉烯類單藥治療有效，但與其他種類抗生素（如氨基糖苷類、多黏菌素E、替加環(huán)素）聯(lián)合應用可提高療效；當碳青霉烯類耐藥菌株的 MIC＞4 mg/L 時，不能用碳青霉烯類單獨治療。Morrill等[12]則認為，碳青霉烯類MIC≤16 mg/L 時，可選擇碳青霉烯類作為治療藥物之一 ；當碳青霉烯類 MIC＞16 mg/L 時，應考慮用其他藥物。本研究亞胺培南、美羅培南對CRKP菌 株 MIC 值≤16 mg/L 僅 分 別 占 24.9% 和 9.8%，≤4 mg/L 更 低 至 2.9% 和 2.0%， 表明 在 我 院 以 碳青霉烯類治療CRKP感染的前景堪憂。

受 試 CRKP 對 阿 米 卡 星 的 敏 感 率 為 25.1%，且較我院 2005－2010 年分離 CRKP 敏感率（14.7%）有所上升[13]；有報道阿米卡星單藥治療 CRE 所致尿路感染療效佳，與其他藥物聯(lián)合治療血流感染等可提高臨床療效和細菌清除率[12]，因此在其藥敏提示敏感時，亦可作為治療藥物之一，尤其是血液、尿路等氨基糖苷類藥物濃度較高部位的感染。我院分離 CRKP 對甲氧芐啶-磺胺甲唑的敏感率為 49.0%，但鑒于該藥為抑菌劑，目前僅有口服制劑供應，且缺乏治療CRKP的循證醫(yī)學證據(jù)，其治療 CRKP感染的地位尚不明確。受試菌株對環(huán)丙沙星的敏感率為 12.6%，且環(huán)丙沙星在肺部等組織濃度亦較高，但鑒于環(huán)丙沙星治療 CRE感染的臨床經(jīng)驗缺乏，宜慎用環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類治療CRKP感染。

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，其中以KPC 型碳青霉烯酶為主，且在全球廣泛分布[14]，少數(shù)菌株為產(chǎn)ESBL 和 /或 AmpC 酶合并外膜孔蛋白缺失等。本次實驗 87.8%（180/205）菌株檢出 blaKPC基因， 較我 院 2005－2010 年 CRKP 中 blaKPC基 因 檢 出 率 70.6%（77/109） 進 一 步 升 高[13]。 一 項 對 國 內 13所醫(yī)院分離的 95 株 CRKP 的研究結果顯示[15]，全部細菌均產(chǎn)生 KPC 型碳青霉烯酶。這些說明 KPC是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的主要耐藥機制。提示頭孢他啶-阿維巴坦等碳青霉烯酶抑制劑復方制劑有望在治療CRKP感染中發(fā)揮重要作用，應盡快引進[16]。總之，在當前國內無多黏菌素、頭孢他啶-阿維巴坦供應情況下，CRKP 的治療選擇有限、成本高且療效不可靠，應著重防控其傳播。

[1] 田磊，陳中舉，孫自鏞，等 . 2005—2014 年 CHINET 腸桿菌屬細菌耐藥性監(jiān)測 [J]. 中國感染與化療雜志，2016，16（3）：275-283.

[2] 徐安，卓超，蘇丹虹，等 . 2005—2014 年 CHINET 克雷伯菌屬細菌耐藥性監(jiān)測 [J]. 中國感染與化療雜志，2016，16（3）：267-274.

[3] LEE C， LEE JH， PARK KS， et al. Global dissemination of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae ： epidemiology， genetic context， treatment options， and detection methods[J]. Front Microbiol，2016，7（895）：12-41.

[4] VASOO S， BARRETO JN， TOSH PK. Emerging issues in gram-negative bacterial resistance[J]. Mayo Clin Procs，2015，90（3）：395-403.

[5] 胡付品，朱德妹 . KPC 型碳青霉烯酶研究進展 [J]. 中國感染與化療雜志，2011，11（1）：76-80.

[6] TACCONELLI E， CATALDO MA， DANCER SJ， et al. ESCMID guidelines for the management of the infection control measures to reduce transmission of multidrug-resistant Gramnegative bacteria in hospitalized patients[J]. Clin Microbiol Infect，2014，20（Suppl 1）：1-55.

[7] Chinese XDR Consensus Working Group. Laboratory diagnosis，clinical management and infection control of the infections caused by extensively drug-resistant Gram-negative bacilli： a Chinese consensus statement[J]. Clin Microbiol Infect，2016，22 （Suppl 1） 1 ：s15-s25.

[8] ZAVASCKI AP， BULITTA JB， LANDERSDORFER CB. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria[J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2013，11（12）：1333-1353.

[9] GILBERT DN， CHANBERS HF， ELIOPOULOS GM， et al. The Sanford guide to antimicrobial therapy[M]. Antimicrobial Therapy Inc， 46th ed， Sperryville， 2016 ：81.

[10] NATION RL， LI J， CARS O， et al. Framework for optimisation of the clinical use of colistin and polymyxin B ： the prato polymyxin consensus[J]. Lancet Infect Dis，2015，15（2）：225-234.

[11] DAIKOS GL， MARKOGIANNAKIS A. Carbapenemaseproducing Klebsiella pneumoniae ： （when） might we still consider treating with carbapenems?[J]. Clin Microbiol Infect，2011，17（8）：1135-1141.

[12] MORRILL HJ， POGUE JM， KAYE KS， et al. Treatment options for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections[J]. Open Forum Infect Dise，2015，2（2）：50-64.

[13] CHEN S， HU F， XU X， et al. High prevalence of KPC-2-type carbapenemase coupled with CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in a teaching hospital in China[J]. Antimicrob Agents Chemother，2011，55（5）：2493-2494.

[14] TZOUVELEKIS LS， MARKOGIANNAKIS A， PSICHOGIOU M， et al. Carbapenemases in Klebsiella pneumoniae and other Enterobacteriaceae ： an evolving crisis of global dimensions[J]. Clin Microbiol Rev，2012，25（4）：682-707.

[15] QI Y， WEI Z， JI S， et al. ST11， the dominant clone of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in China[J]. J Antimicrob Chemother，2011，66（2）：307-312.

[16] 楊帆，王明華 . 值得期待的新 β 內酰胺酶抑制劑阿維巴坦及其復合制劑 [J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2013，35（3）：2498-2501.

Susceptibility and prevalence of blaKPCgene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

BI Yingmin, SHEN Zhen, DONG Dong, WU Shi, HU Fupin, YANG Fan.
（Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To examine the antimicrobial susceptibility and prevalence of blaKPCgene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) strains isolated in Huashan Hospital, Fudan University. Methods The CRKP strains isolated in Huashan Hospital from January to December of 2014 were included in this study. The MICs of antibiotics were determined using CLSI broth dilution method. The blaKPCgene was amplif i ed by polymerase chain reaction (PCR). Results A total of 205 CRKP strains were isolated, mainly from respiratory tract (76.1%, 156/205) and urine specimens (18.5%, 38/205). Antimicrobial susceptibility test indicated that CRKP isolates had higher resistance rates (85% - 100%) to the antimicrobial agents except colistin (1.5%), tigecycline (0.5%), trimethoprim-sulfamethoxazole (51.0%) and amikacin (74.9%). Most (87.8%, 180/205) of the CRKP strains were positive for blaKPCgene. Conclusions CRKP are mostly isolated from patients with lower respiratory tract infection and/or urinary tract infection in Huashan Hospital. The strains were highly resistant to the antibacterial agents tested except colistin and tigecycline. Production of KPC-type carbapenemase is the common mechanism of carbapenem resistance in these K. pneumoniae isolates.

carbapenem-resistant; Klebsiella pneumoniae; antimicrobial susceptibility; blaKPCgene

R378

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0298-05

10.16718/j.1009-7708.2017.03.014

2016-11-02

2016-11-21

復旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點實驗室，上海 200040。

畢穎敏（1989—），女，碩士研究生，主要從事細菌耐藥性及耐藥機制研究。

楊帆，E-mail：fanyang9@fudan.edu.cn。