葡萄酒中白藜蘆醇總量穩(wěn)定性的研究

王 錕，耿紅玲，趙 瑋，張書(shū)文

（1.國(guó)家葡萄酒及白酒、露酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東煙臺(tái)264003； 2.煙臺(tái)市質(zhì)量認(rèn)證咨詢(xún)中心，山東煙臺(tái)264003； 3.河南省葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南商丘476800）

葡萄酒中白藜蘆醇總量穩(wěn)定性的研究

王 錕1，2，耿紅玲3，趙 瑋1，2，張書(shū)文1，2

（1.國(guó)家葡萄酒及白酒、露酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東煙臺(tái)264003； 2.煙臺(tái)市質(zhì)量認(rèn)證咨詢(xún)中心，山東煙臺(tái)264003； 3.河南省葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南商丘476800）

以添加白藜蘆醇的葡萄酒為研究對(duì)象，采用HPLC法測(cè)定了葡萄酒在不同環(huán)境下白藜蘆醇的總量。通過(guò)系統(tǒng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)和結(jié)果評(píng)價(jià)，總結(jié)出不同環(huán)境下白藜蘆醇總量的變化規(guī)律。結(jié)果表明，葡萄酒中白藜蘆醇總量的變化與環(huán)境條件有著密切的聯(lián)系，同時(shí)為解析葡萄酒中白藜蘆醇總量穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)。

白藜蘆醇； 葡萄酒； 高效液相色譜儀

白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類(lèi)物質(zhì)，又稱(chēng)為芪三酚，是降低血小板聚集，預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑。它是植物在遭受脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種能提高植物抵抗病原性攻擊和環(huán)境惡化能力的植物抗毒素，還具有很強(qiáng)的抗氧化和防癌的生理活性[1-3]。白藜蘆醇廣泛存在于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖等植物中，在自然條件下以自由態(tài)和糖苷兩種形式存在。白藜蘆醇及其糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別存在順式和反式兩種異構(gòu)體，即順式白藜蘆醇、反式白藜蘆醇以及順式白藜蘆醇糖苷、反式白藜蘆醇糖苷，后兩種形式在機(jī)體腸道中糖苷酶作用下釋放出白藜蘆醇。白藜蘆醇在自然條件下主要以反式白藜蘆醇存在，在一定的外界環(huán)境條件下，可轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖桨邹继J醇[4-5]。目前白藜蘆醇的研究主要集中在藥品和保健食品領(lǐng)域[1-3]，對(duì)于葡萄酒等各類(lèi)含有反式白藜蘆醇的功能性食品，其分析方法的開(kāi)發(fā)與研究的相關(guān)文獻(xiàn)非常多[6-18]，而國(guó)內(nèi)有關(guān)研究其在葡萄酒中穩(wěn)定性的相關(guān)報(bào)道比較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)5種不同環(huán)境下放置葡萄酒中白藜蘆醇含量進(jìn)行分析比較，以探討它們的差異，為葡萄酒中白藜蘆醇總量穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

酒樣：市售。

試劑：甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；反式白藜蘆醇（購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；反式白藜蘆醇苷（購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司，配2998紫外檢測(cè)器）；ZF-20C暗箱式紫外分析儀（254 nm，365 nm）。

1.2 色譜條件

色譜柱：ODS-C18柱，4.6 mm×250 mm,5 μm，或其他具有同等分析效果的色譜柱；流動(dòng)相：乙腈+ 0.1%冰乙酸=20+80；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；進(jìn)樣量：5 μL；在測(cè)定前裝上色譜柱，以1.0 mL/min的流速通入流動(dòng)相平衡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

反式白藜蘆醇、反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：稱(chēng)取10.0 mg反式白藜蘆醇和白藜蘆醇苷于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中備用。

反式白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：將反式白藜蘆醇和反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用甲醇稀釋成10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

反式白藜蘆醇、反式白藜蘆醇苷：將反式白藜蘆醇和反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(100.0 mg/L)在254 nm波長(zhǎng)下照射30 min，然后將此標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至系列濃度，按本方法測(cè)試反式白藜蘆醇以及反式白藜蘆醇苷含量，同時(shí)計(jì)算轉(zhuǎn)化率，得順式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇苷含量。用順、反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣后，以標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)為0.9990以上。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化率

在自然光照和ZF-20C暗箱式紫外分析儀254 nm條件下，將100 mg/L的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品分別照射0.5 h、1.0 h、1.5 h后，測(cè)得在自然光照條件下的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表1、白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品中4種異構(gòu)體含量進(jìn)行了測(cè)定，由于目前沒(méi)有商業(yè)化的白藜蘆醇順式異構(gòu)體及其糖苷，故對(duì)順式異構(gòu)體進(jìn)行定量測(cè)定是有困難的。若想定量測(cè)定這2種異構(gòu)體有2種可能的途徑，一是因?yàn)樽贤庹丈浜鬅o(wú)其他色譜峰產(chǎn)生，故按照反式異構(gòu)體減少的量來(lái)確定順式異構(gòu)體的量，另一種是根據(jù)已發(fā)表的摩爾吸光系數(shù)通過(guò)Lamber-Beer定律來(lái)計(jì)算[19]。本實(shí)驗(yàn)參照第一種方法確定順式異構(gòu)體含量。

表1 自然光照條件下白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化率

表2 自然光照條件下白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率

ZF-20C暗箱式紫外分析儀（254 nm）白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表3、白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表4。

表3 紫外分析儀條件下白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化率

表4 紫外分析儀條件下白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率

2.2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品在光照和紫外分析儀結(jié)果討論

相同標(biāo)準(zhǔn)品溶液在兩種光照條件下的測(cè)定結(jié)果表明：反式白藜蘆醇（苷）轉(zhuǎn)化為順式白藜蘆醇（苷）的轉(zhuǎn)化率，自然光照條件下比在紫外分析儀的高；總白藜蘆醇含量的損失，光照條件下?lián)p失比在紫外分析儀的高；用紫外分析儀的標(biāo)準(zhǔn)品，在254 nm條件下照射1 h后，轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯變化；而在光照條件下照射1 h后，轉(zhuǎn)化率有明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇對(duì)光照不穩(wěn)定，在光照條件下，反式白藜蘆醇會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖桨邹继J醇[4-5]，反式白藜蘆醇苷會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖桨邹继J醇苷，反式白藜蘆醇（苷）和順式白藜蘆醇（苷）共存。在白藜蘆醇順?lè)串悩?gòu)化的反應(yīng)中，存在3個(gè)可能的副反應(yīng)，各種副反應(yīng)也在消耗白藜蘆醇，因此兩種白藜蘆醇的總濃度是持續(xù)下降的[5]。在自然光照條件下，白藜蘆醇總量明顯有損失，用紫外分析儀(254 nm)條件損失較少，且反應(yīng)時(shí)間限定0.5 h，損失率和轉(zhuǎn)化率都能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 葡萄酒中總白藜蘆醇在不同環(huán)境下測(cè)定結(jié)果

取相同品種的一款葡萄酒，加入白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，分別測(cè)定葡萄酒原樣以及添加白藜蘆醇葡萄酒的白藜蘆醇含量。經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，直接進(jìn)樣。測(cè)定的結(jié)果原樣及添加總白藜蘆醇葡萄酒含量分別為3.37 mg/L、58.18 mg/L。將葡萄酒樣品置于5個(gè)不同的自然環(huán)境中，分別為黑暗、冰箱(4～8℃)、日光、恒溫（35℃）、常溫的環(huán)境下，測(cè)定時(shí)間間隔為2個(gè)月左右，分別測(cè)定不同環(huán)境下總白藜蘆醇的含量（白藜蘆醇總含量為順式、反式白藜蘆醇與順式、反式白藜蘆醇苷之和）。

將樣品進(jìn)樣（樣品中的白藜蘆醇含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)系列范圍內(nèi)）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性樣品中白藜蘆醇的色譜峰。根據(jù)樣品的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算白藜蘆醇4種異構(gòu)體的總含量。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1數(shù)據(jù)分析可知，葡萄酒中白藜蘆醇總量均呈遞減趨勢(shì)，其中低溫避光的條件下，如冰箱、黑暗、常溫環(huán)境下，白藜蘆醇總量遞減的趨勢(shì)較慢；其他環(huán)境如日光和35℃恒溫，白藜蘆醇總量遞減的趨勢(shì)明顯；最適宜白藜蘆醇穩(wěn)定的環(huán)境是4～8℃冰箱的環(huán)境，損失率僅為4.0%；其次是黑暗環(huán)境和常溫環(huán)境，損失率分別為16.4%和18.6%，日光環(huán)境損失率為29.6%；最不適宜白藜蘆醇穩(wěn)定的環(huán)境是35℃恒溫環(huán)境，損失率為36.6%。

圖1 不同環(huán)境下白藜蘆醇總量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

2.4 葡萄酒中總白藜蘆醇在開(kāi)啟狀態(tài)下，放置相同室溫環(huán)境下的測(cè)定結(jié)果

5個(gè)葡萄酒樣品開(kāi)瓶后，以2016年3月21日測(cè)定的5組樣品為樣本，未進(jìn)行任何處理，放置在相同的室溫環(huán)境下，相同的間隔時(shí)間測(cè)定其白藜蘆醇總量的變化。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2。

圖2 開(kāi)啟狀態(tài)相同環(huán)境下總白藜蘆醇含量變化趨勢(shì)

從圖2數(shù)據(jù)分析可知，開(kāi)啟狀態(tài)葡萄酒中白藜蘆醇總量均呈遞減趨勢(shì)，其遞減的程度明顯高于正常儲(chǔ)存未開(kāi)瓶的葡萄酒樣品。其中樣品1、樣品2、樣品3、樣品5的損失率范圍為49.7%～53.6%；樣品4損失率最高，為63.1%。從樣品中白藜蘆醇損失的情況看，白藜蘆醇含量高的葡萄酒在放置過(guò)程中損失率接近，白藜蘆醇含量相對(duì)低的損失率會(huì)偏高。

3 結(jié)論

3.1 同一款葡萄酒中加入等量的反式白藜蘆醇，在5種不同的環(huán)境下放置8個(gè)月，期間每2個(gè)月測(cè)定1次數(shù)據(jù)，其結(jié)果表明：低溫避光有利于白藜蘆醇的穩(wěn)定，高溫光照不利于白藜蘆醇的穩(wěn)定。綜上所述：在光與熱的作用下，白藜蘆醇溶液均不穩(wěn)定[20]。最適宜白藜蘆醇穩(wěn)定的環(huán)境是冰箱，其次是黑暗和常溫，最不適宜其穩(wěn)定的自然條件是日光和35℃恒溫環(huán)境。

3.2 同一款葡萄酒中加入等量的反式白藜蘆醇，在5種不同的環(huán)境下放置2個(gè)月后，又模擬開(kāi)瓶后的有氧狀態(tài)，無(wú)任何處理，于相同的室溫環(huán)境下放置8個(gè)月，測(cè)定的數(shù)據(jù)表明：5組數(shù)據(jù)均呈下降趨勢(shì)，且下降趨勢(shì)明顯高于正常儲(chǔ)存未開(kāi)瓶的葡萄酒樣品。綜上所述，針對(duì)已開(kāi)瓶而未喝完的葡萄酒，比較理想的儲(chǔ)存方法是先將酒瓶中的空氣抽光，再塞上瓶塞，開(kāi)瓶后的葡萄酒應(yīng)盡早飲用，否則影響葡萄酒風(fēng)格及香氣，其自身的白藜蘆醇總量也會(huì)受影響而明顯下降。

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Stability of Resveratrol in Grape Wine

WANG Kun1,2,GENG Hongling3,ZHAO Wei1,2and ZHANG Shuwen1,2
（1.National Quality Supervision&Testing Center for Wine,Liqueur and Liquor,Yantai,Shandong 264003;
2.Yantai Quality Certification Consulting Center,Yantai,Shandong 264003;3.He'nan Wine Quality Supervision and Inspection Center,Shangqiu,He'nan 476800,China）

Grape wine with the addition of resveratrol was used as the research object.The total content of resveratrol in grape wine under different conditions was determined by HPLC.Through comparative experiment and results evaluation,the change rules of resveratrol content in grape wine under different conditions were summed up.The change of resveratrol content in grape wine was closely related to environmental conditions.This study provided theoretical base for analyzing resveratrol stability in grape wine.

resveratrol;wine;HPLC

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）05-0057-04

10.13746/j.njkj.2017017

2017-02-08

王錕（1982-），本科，從事食品、化工產(chǎn)品的分析檢驗(yàn)工作，研究方向?yàn)槠咸丫贫喾宇?lèi)物質(zhì)檢測(cè)，發(fā)表論文多篇。

張書(shū)文（1981-），碩士研究生，工程師，從事葡萄酒分析檢驗(yàn)工作，研究方向?yàn)槠咸丫妻r(nóng)殘以及安全質(zhì)量檢測(cè)。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-03-15；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170315.1620.002.html。