張一卉 李化銀+王鳳德 李景娟 丁謙 劉立鋒+孫令強(qiáng) 徐少君+孔濤+王翠花 何啟偉 高建偉 ??

摘要：本試驗(yàn)利用分子育種手段開(kāi)展了優(yōu)質(zhì)桔紅心大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育研究。我們克隆了控制大白菜桔紅心的關(guān)鍵基因BrCRTISO，分析了桔紅心、白心大白菜之間BrCRTISO基因的結(jié)構(gòu)差異。根據(jù)啟動(dòng)子和編碼區(qū)序列的差異，篩選出了與桔紅心緊密連鎖的SNP和InDel分子標(biāo)記。在傳統(tǒng)有性雜交的基礎(chǔ)上，利用上述SNP和InDel標(biāo)記對(duì)后代分離群體進(jìn)行輔助選擇，篩選出了早熟、優(yōu)質(zhì)、抗病的桔紅心優(yōu)異純系種質(zhì)08428、08460、08468、08469自交不親和系。利用上述4個(gè)純系配置組合，選育出了早熟優(yōu)質(zhì)抗病的特色大白菜新品種“天正桔紅65”、“天正桔紅62”。連續(xù)多年（2010—2016）種植試驗(yàn)及抗病性鑒定的結(jié)果表明：這兩個(gè)新品種抗病性強(qiáng)，適宜春秋種植，早熟（55～60天）；葉球中小型，桔紅色。其中“天正桔紅65”β-胡蘿卜素含量高達(dá)26.163 mg/gDW，是普通大白菜的11.15倍；可溶性固形物含量高，口感品質(zhì)極佳。2014年，“天正桔紅62”成為泰安市岱岳區(qū)地理標(biāo)志性產(chǎn)品（商標(biāo)注冊(cè)號(hào)：13066669）。2015—2016年，兩個(gè)品種通過(guò)了國(guó)家、?。ㄊ校┺r(nóng)作物品種審定委員會(huì)的審定（鑒定）。本研究是利用分子育種手段快速培育優(yōu)良大白菜新品種的成功范例，可為其它生物分子育種工作提供參考。

關(guān)鍵詞：大白菜；桔紅心；分子標(biāo)記；種質(zhì)創(chuàng)新；新品種選育

中圖分類號(hào)：S634.103.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）05-0014-10

Germplasm Innovation and New Variety Breeding in Orange

Leafy Head Chinese Cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）

Zhang Yihui1， Li Huayin1*， Wang Fengde1， Li Jingjuan1， Ding Qian1， Liu Lifeng1，

Sun Lingqiang2， Xu Shaojun3， Kong Tao4， Wang Cuihua1， He Qiwei1， Gao Jianwei1

（1. Institute of Vegetables and Flowers， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；

2.Qingdao Seed Management Station， Qingdao 266071， China； 3. Qingdao Hefeng Seeds Co.， Ltd.，

Jiaozhou 266300， China；4. Daiyue District Agricultural Bureau， Taian 271021， China）

AbstractIn this research， the molecular breeding was used to innovate germplasm and select new varieties in orange leafy head Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）. We cloned the candidate key gene BrCRTISO， which coded carotenoid isomerase controlling synthesis of orange pigments in leafy head. Differences in structure of BrCRTISO gene between orange and white leafy head Chinese cabbage were also analyzed， in which， one SNP（C952-T952）marker and one InDel marker Bror-intron1 closely linked with orange leafy head were developed. New good pure self-incompatible lines of orange leafy head germplasm had been innovated by molecular marker assisted selection， of which， 08428， 08460， 08468 and 08469 were better than others. These four lines were applied to make cross combinations， from which， new orange leafy head varieties Tianzhengjuhong 65 and Tianzhengjuhong 62 were obtained. Planting and disease resistance tests for several years （2010-2016） showed that these two new varieties had strong disease resistance， and their growth periods were short （55～60 days）， which were suitable for being cultivated in spring or autumn. The β-carotene content of Tianzhengjuhong 65 reached 26.163 mg/gDW， 11.15 times of common Chinese cabbage. In addition， the content of soluble solids was also higher than other Chinese cabbage varieties， which owned good taste. In 2014， Tianzhengjuhong 62 was approved to be Chinese National Protected Geographic Indication Product （No. 13066669 ） in Taian， China. In 2015， Tianzhengjuhong 65 was approved by both National and Beijing Crop Variety Approval Committee. Meanwhile， Tianzhengjuhong 62 was approved by Beijing Crop Variety Approval Committee. In 2016， Tianzhengjuhong 65 was approved by Shandong Crop Variety Approval Committee. This paper would be useful to other plant molecular breeding because of our successful breeding work.

KeywordsChinese cabbage； Orange leafy head； Molecular markers； Germplasm innovation； New variety breeding

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）起源于中國(guó)，是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜。韓國(guó)、日本等東亞國(guó)家種植的大白菜最早由我國(guó)傳入。長(zhǎng)期以來(lái)，大白菜一直是我國(guó)和東亞國(guó)家的骨干蔬菜，其重要地位和生產(chǎn)面積是其它蔬菜難以相比的。在我國(guó)北方，大白菜是秋季栽培和冬春供應(yīng)的主要蔬菜，種植面積大、范圍廣[1]。山東省作為大白菜的主要起源地之一，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源極為豐富，其中有譽(yù)滿海內(nèi)外的膠東大白菜，有特點(diǎn)鮮明的德州香把子，有深受濟(jì)南本地人喜愛(ài)的唐王大白菜等[2]。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和保護(hù)地栽培蔬菜的發(fā)展，大白菜一季生產(chǎn)半年供應(yīng)的格局已發(fā)生了顯著變化。隨著人們生活水平的不斷提高，人們將更多地關(guān)注大白菜的質(zhì)量，即形狀、大小、色澤、營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味口感及無(wú)公害等指標(biāo)。

桔紅心大白菜因其色澤艷麗、富含胡蘿卜素等多種維生素、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感好而倍受消費(fèi)者青睞。日本桔紅心大白菜育種起步較早，培育了許多優(yōu)良品種。但是在我國(guó)，日本的桔紅心大白菜品種種子昂貴，不抗病毒病，病重地區(qū)和年份常常絕產(chǎn)，難以獲得豐產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。因此，培育適宜山東等地種植的高抗病毒病、霜霉病、軟腐病的桔紅心大白菜新品種，實(shí)現(xiàn)其種子國(guó)產(chǎn)化顯得尤為重要[3]。

針對(duì)上述問(wèn)題，本課題組自2002年起開(kāi)始收集、鑒定桔紅心大白菜資源材料，研究桔紅心性狀遺傳特性。2007—2010年間，我們通過(guò)拓寬育種資源，利用雜交組合選配測(cè)配，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，選育出適合春秋兩季種植的桔紅心大白菜新品種“天正桔紅65”、“天正桔紅62”。2014年，“天正桔紅62”成為泰安市岱岳區(qū)地理標(biāo)志性產(chǎn)品（商標(biāo)注冊(cè)號(hào)：13066669）。2015年，兩品種通過(guò)了國(guó)家、北京市農(nóng)作物品種審定委員會(huì)的審定（鑒定）；2016年，“天正桔紅65”又通過(guò)了山東省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)的審定。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

桔紅心大白菜一代雜交種：北京桔紅心、紅抗1號(hào)、長(zhǎng)研橘寶、申萌桔紅心、神獅桔紅心。桔紅心大白菜純系：桔08410、14-490、1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669。白心（或者黃心）大白菜一代雜交種：寒秀、金典春王、凱春、日本夏陽(yáng)。白心（或者黃心）大白菜純系：新福08410、14-401、663、1466、1469、1505、1510、1720、疊錐抗2。雜交組合（14-401×14-490）及其F2代分離群體。

1.2基因克隆及生物信息學(xué)分析

1.2.1基因組DNA提取取大白菜葉片，液氮冷凍后快速研磨，采用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測(cè)。

1.2.2總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄取結(jié)球后期的球葉提取總RNA。采用TRNzol-A+試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行RNA提取，方法參考說(shuō)明書(shū)。反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （大連寶生物）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×高保真PCR Mix 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4SDS-PAGE電泳檢測(cè)將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，然后將混合物95℃預(yù)變性10 min。取4 μL點(diǎn)樣，利用8%變性聚丙烯酰氨凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在Sequi-Gen GT核酸電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）中進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為1×TBE，在25℃、55 W恒功率下電泳1 h，通過(guò)銀染法顯影、拍照并記錄結(jié)果。

1.2.5生物信息學(xué)分析將克隆的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，查找大白菜目標(biāo)基因在其它物種中的同源序列。利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)來(lái)自不同物種的基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3β-胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

利用高效液相色譜法測(cè)定大白菜β-胡蘿卜素含量[5-7]。稱取5.0 g左右干凈的成熟期大白菜內(nèi)葉，剪碎，置于三角瓶中，用石油醚∶丙酮（體積比為80∶20）混合液振搖提取，移出上清液，重復(fù)提取直至提取液無(wú)色，合并提取液，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，用二氯甲烷溶液提取殘?jiān)?，過(guò)濾后用凝膠色譜儀凈化。凈化后的溶液用于HPLC分析。使用吉爾森高效液相色譜儀，色柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈（體積比為90∶10），流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為450 μm，進(jìn)樣量20 μL。利用PAD在波長(zhǎng)200～800 nm范圍內(nèi)掃描，分析物質(zhì)的特征吸收峰。

可溶性固形物含量的測(cè)定參照標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 2637—2014 水果和蔬菜可溶性固形物含量的測(cè)定 折射儀法（2015-1-1實(shí)施）》。

1.4分子標(biāo)記輔助選擇及常規(guī)雜交育種

分子標(biāo)記輔助選擇育種及常規(guī)雜交育種參照錢(qián)前等（2012）[4]和柯桂蘭（2010）[1]。

2結(jié)果與分析

2.1控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵候選基因的選擇策略

與普通大白菜相比，桔紅心大白菜的葉球內(nèi)葉呈現(xiàn)桔紅色。切開(kāi)后剖面經(jīng)陽(yáng)光照射，球葉的桔紅色快速增強(qiáng)。以往研究表明，桔紅心大白菜內(nèi)葉含有類似番茄紅素的復(fù)合物等多種類胡蘿卜素[5-7]。類胡蘿卜素在植物體內(nèi)通過(guò)類異戊二烯途徑合成，呈現(xiàn)黃色、橙紅色和紅色。在擬南芥[6]、番茄[7]等模式植物中，人們對(duì)類胡蘿卜素生物合成途徑及其相關(guān)酶（或基因）的功能研究得很清楚[6-8]。植物中，許多桔紅色性狀的出現(xiàn)都與類胡蘿卜素異構(gòu)酶有關(guān)。類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO 能催化前番茄紅素形成全反式番茄紅素[9，10]。Park 等（2002）[6]在擬南芥中分離了CRTISO基因，通過(guò)分析其功能，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素異構(gòu)酶缺失突變體主要積累前番茄紅素和前鏈孢紅素（7， 9， 9′–三順式–鏈孢紅素）。Isaacson 等（2002）[7]利用圖位克隆技術(shù)獲得了番茄桔紅色基因tangerine，該基因編碼一個(gè)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO，tangerine突變體缺失CRTISO 導(dǎo)致番茄積累前番茄紅素和β-胡蘿卜素，果實(shí)呈現(xiàn)桔紅色。因此，在篩選控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵候選基因時(shí)，我們首先選擇了編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶的基因BrCRTISO作為候選基因。