王孟孟+馬寨璞+管越強(qiáng)+張凱利

摘要：利用構(gòu)建的甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)圖，運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)方法對各免疫因子的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行探討。將免疫系統(tǒng)圖中重要的免疫因子抽象為節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的邊代表著因子之間的相關(guān)關(guān)系，則將整個(gè)免疫系統(tǒng)圖抽象為一個(gè)充滿節(jié)點(diǎn)的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖。通過所構(gòu)建的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖，尋找了兩個(gè)或多個(gè)因子之間的作用機(jī)制，以及各免疫路徑之間的關(guān)系；利用建立的物理數(shù)學(xué)原理來揭示因子之間的免疫反應(yīng)作用機(jī)制，解答免疫中的反應(yīng)現(xiàn)象。揭示免疫刺激劑的免疫作用機(jī)理，促進(jìn)整個(gè)免疫系統(tǒng)的免疫水平評價(jià)。

關(guān)鍵詞：甲殼動(dòng)物；免疫回路；圖論；節(jié)點(diǎn)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，養(yǎng)殖過程中各種病毒和細(xì)菌對水產(chǎn)品產(chǎn)量的影響越來越嚴(yán)重；因此，對于怎樣提高甲殼動(dòng)物免疫力來抵抗病害是研究的重點(diǎn)。對各種免疫刺激劑如免疫多糖、中草藥等的研究越來越多，例如Deng等[1]研究了從冬蟲夏草菌絲體中提取的多糖類物質(zhì)對于凡納濱對蝦生長、免疫和抗氧化能力的影響。但僅憑幾個(gè)免疫相關(guān)酶的指標(biāo)來直接判斷甲殼動(dòng)物的免疫能力，顯然不全面。甲殼動(dòng)物免疫包括多條路徑，如包囊作用，吞噬作用等，并且各路徑之間相互影響、相互作用，一條路徑的變化不能衡量整個(gè)免疫系統(tǒng)的能力。然而對于免疫刺激劑的研究，大部分研究都是通過測免疫指標(biāo)的變化來評價(jià)的，具體的作用機(jī)理尚不清楚；例如陳昌福等[2]研究了免疫多糖對南美白對蝦免疫相關(guān)酶的激活作用。本文利用系統(tǒng)生物學(xué)的思想，將免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖抽象為多節(jié)點(diǎn)圖，利用圖論的方法進(jìn)行研究，并運(yùn)用數(shù)學(xué)物理原理來揭示免疫因子之間或路徑之間的作用機(jī)制，同時(shí)對于免疫刺激劑的免疫應(yīng)答做出重要說明。

1甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系模型總圖

甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)是一個(gè)內(nèi)部相互聯(lián)系、相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，其中包括多條免疫路徑：如吞噬作用、包囊作用、修復(fù)作用等。由參考文獻(xiàn)[3]得到甲殼動(dòng)物免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)圖（圖1）。圖中標(biāo)示：代表反應(yīng)物質(zhì)，代表作用過程；代表殺死病原體；代表著反應(yīng)流程或物質(zhì)生成，代表促進(jìn)作用，代表阻抑作用。

2圖論分析

對于建立的全面的免疫系統(tǒng)圖，運(yùn)用圖論的知識進(jìn)行整理分析。1969年，Kauffman提出了著名的布爾網(wǎng)絡(luò)（Boolean Network，BN）模型，用以研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞分化過程[4-5]。借助于此類思想，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型來研究免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。將甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)圖抽象為一個(gè)免疫網(wǎng)絡(luò)有向圖，其中免疫網(wǎng)絡(luò)中的物質(zhì)及反應(yīng)過程抽象為節(jié)點(diǎn)，免疫網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系對應(yīng)圖中的邊。圖中的節(jié)點(diǎn)和邊可以帶有本身的屬性，邊分為有向或無向的，分別代表著生化反應(yīng)或免疫作用關(guān)系[6]。

2.1節(jié)點(diǎn)的出入度統(tǒng)計(jì)與分析

到目前為止，甲殼免疫系統(tǒng)中主要免疫途徑的物質(zhì)及因子，可以確定下來的有51個(gè)，將其作為節(jié)點(diǎn)，與節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊數(shù)即為度數(shù)，輸入的邊數(shù)為入度，輸出的邊數(shù)為出度，入度與出度之和即為總度。各節(jié)點(diǎn)的名稱及出入度統(tǒng)計(jì)，如表1。

聚糖結(jié)合蛋白（βGBP），脂多糖（LPS），脂多糖結(jié)合蛋白（LGBP），肽聚糖結(jié)合蛋白（PGBP），細(xì)胞粘附因子（76ku），乙二胺四乙酸（EDTA），過氧化氫酶（CAT），過氧化物酶（SOD），酚氧化酶原激活酶原（proPPA），酚氧化酶原激活酶（PPA），酚氧化酶原（proPO），酚氧化酶（PO），透明細(xì)胞（HC），半顆粒細(xì)胞（SGC），顆粒細(xì)胞（GC），過氧亞硝酸鹽陰離子（ONOO-）。

對于各節(jié)點(diǎn)度的分布情況表（表1），對節(jié)點(diǎn)度的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制直方圖（圖2和圖3）?？芍?jié)點(diǎn)入度為1的有16個(gè)，為0的有12個(gè)；同時(shí)出度為1的有30個(gè)，只有少數(shù)的節(jié)點(diǎn)的出度大于3。

構(gòu)建的甲殼動(dòng)物節(jié)點(diǎn)圖中節(jié)點(diǎn)數(shù)N為51，因其不存在自連接的邊和兩節(jié)點(diǎn)間的相互邊，則可能產(chǎn)生的最大邊數(shù)為Emax=N（N-1），而在整個(gè)免疫網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)圖中實(shí)際的邊E為86條。則E/Emax的結(jié)果為3.37%，由此得出，所建的甲殼動(dòng)物免疫節(jié)點(diǎn)圖是稀疏的。

對于出入度均為1的節(jié)點(diǎn)，在免疫路徑中不可替換，屬于具有唯一性的節(jié)點(diǎn)，此類節(jié)點(diǎn)一旦出問題，與此節(jié)點(diǎn)有關(guān)的網(wǎng)絡(luò)通路將會失去作用。某一路徑受阻，整個(gè)免疫系統(tǒng)就會受到一定程度的阻力。例如，當(dāng)溶菌酶因各種因素失活的時(shí)候，整個(gè)溶菌酶殺菌系統(tǒng)就會切斷，從而加重其他路徑的壓力。多個(gè)出、入度的節(jié)點(diǎn)，說明是免疫通路的交匯點(diǎn)，此類節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)問題，就會影響多條通路，甚至引起免疫系統(tǒng)的癱瘓。脫顆粒作用、吞噬作用、包囊作用等免疫作用的出入度較高，屬于比較關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)；proPO、PO等免疫因子的出入度也高，屬于免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，在整個(gè)甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的結(jié)論，PO確實(shí)在免疫過程中充當(dāng)關(guān)鍵的免疫樞紐的位置。

所建甲殼動(dòng)物免疫網(wǎng)絡(luò)的度分布表現(xiàn)為冪律形式，冪律是指節(jié)點(diǎn)具有的連接線與該節(jié)點(diǎn)的乘積是一個(gè)定值，也即是說，度數(shù)小的節(jié)點(diǎn)多，度數(shù)大的節(jié)點(diǎn)少。在所建立的甲殼動(dòng)物免疫網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度的統(tǒng)計(jì)中，頻率直方圖具有“長尾”現(xiàn)象，即節(jié)點(diǎn)數(shù)存在多的度數(shù)小，度數(shù)大的節(jié)點(diǎn)數(shù)少。高連接的節(jié)點(diǎn)、度數(shù)較高稱為中樞節(jié)點(diǎn)，在整個(gè)免疫系統(tǒng)的演變中，對免疫網(wǎng)絡(luò)各項(xiàng)性質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，缺少了這類節(jié)點(diǎn)，整個(gè)免疫系統(tǒng)能力急劇下降，甚至陷入癱瘓。而連接數(shù)較少的節(jié)點(diǎn)，只能左右個(gè)別路徑，在整個(gè)免疫系統(tǒng)中影響范圍相對較窄。

2.2作圖

通過對51個(gè)免疫節(jié)點(diǎn)的相關(guān)關(guān)系生成了對應(yīng)的鄰接矩陣，作圖得到甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)圖（圖4）。

3圖中各種調(diào)節(jié)機(jī)制的分析

通過構(gòu)建免疫系統(tǒng)節(jié)點(diǎn)間關(guān)系，揭示了各免疫因子之間的相互作用。在免疫系統(tǒng)節(jié)點(diǎn)圖中，本文主要研究三個(gè)節(jié)點(diǎn)間的相互作用，利用物理原型解釋免疫反應(yīng)的相關(guān)過程。從圖4可知免疫網(wǎng)絡(luò)圖的相關(guān)關(guān)系是稀疏的。從整個(gè)免疫系統(tǒng)節(jié)點(diǎn)圖中，分離出多種子圖。將其分為兩大類：一種是四個(gè)及四個(gè)以上連續(xù)連接且無支路的節(jié)點(diǎn)組成的串型結(jié)構(gòu)，如圖5；一種是三個(gè)或三個(gè)以上節(jié)點(diǎn)組成一個(gè)或多個(gè)回路結(jié)構(gòu)的回路結(jié)構(gòu)圖，如圖6。此處主要討論三個(gè)或四個(gè)節(jié)點(diǎn)的回路結(jié)構(gòu)圖。

3.1串型結(jié)構(gòu)圖的特點(diǎn)及作用

在免疫串型結(jié)構(gòu)傳遞信號的過程中，信號逐漸減弱，像水波一樣，在傳播過程中越來越弱。只有持續(xù)的進(jìn)行免疫刺激，才能發(fā)揮應(yīng)有的免疫反應(yīng)作用。免疫反應(yīng)特點(diǎn)：免疫消除不良刺激，避免不必要的刺激對機(jī)體帶來的損傷，保證整個(gè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

3.2回路結(jié)構(gòu)圖的特點(diǎn)及作用

在圖論的知識中，三節(jié)點(diǎn)之間的相互作用總共反應(yīng)類型可分為多種，比較常見的三節(jié)點(diǎn)生物關(guān)系圖有前饋環(huán)和反饋環(huán)兩種[4，7]，從免疫系統(tǒng)節(jié)點(diǎn)圖中分離出以下9種免疫系統(tǒng)子圖，如圖6。其中1-7屬于前饋環(huán)，8屬于反饋環(huán)，9屬于四節(jié)點(diǎn)的相互作用。

3.2.1前饋環(huán)

前饋環(huán)是由三個(gè)因子組成。第一個(gè)因子調(diào)節(jié)第二個(gè)因子，然后兩個(gè)因子一起調(diào)節(jié)第三個(gè)因子，所以前饋環(huán)擁有2條平行的調(diào)節(jié)路徑，即一條從第一因子到第三因子的直接路徑以及一條第二因子到第三因子的間接路徑。直接路徑由一條邊組成，而間接路徑則由2條邊級聯(lián)而成，其中邊代表的促進(jìn)和阻抑作用相當(dāng)于物理中的正信號和負(fù)信號。前饋環(huán)具有23種不同的形式。文中討論了協(xié)調(diào)型前饋環(huán)，如圖7；非協(xié)調(diào)型前饋環(huán)，如圖8兩種形式。

①協(xié)調(diào)型前饋環(huán)

在甲殼動(dòng)物免疫中，PO既催化單酚形成雙酚，又可以催化雙酚形成醌。在此類免疫過程中，第一步反應(yīng)生成雙酚，隨著雙酚的積累，達(dá)到一定的閾值，PO和雙酚作用生成醌。如圖7，O的生成，需要M和N兩個(gè)信號的共同作用，只有當(dāng)M的作用時(shí)間足夠長，產(chǎn)生的N積累，達(dá)到反應(yīng)需要的閾值，才可生成O，生成O的過程必須要經(jīng)過一個(gè)延遲。整個(gè)過程類似于信號敏感延遲元件，此類元件能防止短暫的輸入信號的波動(dòng)。甲殼動(dòng)物所處的環(huán)境經(jīng)常是高度波動(dòng)的，短暫的刺激引發(fā)的反應(yīng)，不僅消耗機(jī)體的能量，而且免疫反應(yīng)產(chǎn)生的一些物質(zhì)損害機(jī)體。這類元件的過濾作用有利于機(jī)體的穩(wěn)定性。

②非協(xié)調(diào)型前饋環(huán)

在非協(xié)調(diào)型前饋環(huán)中，如圖8，物質(zhì)A的加入，促進(jìn)物質(zhì)B和C的產(chǎn)生，同時(shí)B對C具有抑制作用。表現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中，加入免疫多糖，甲殼動(dòng)物免疫體內(nèi)過氧根離子的含量和SOD的含量均上升，最終過氧根離子的含量達(dá)到不對機(jī)體損害的閾值，趨于穩(wěn)定。作用原理：SOD將過氧根離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫等物質(zhì)，減少過氧根離子的濃度從而降低其對于機(jī)體的損害。此類回路結(jié)構(gòu)具有信號敏感加速器的作用，如圖9。

此類免疫作用結(jié)構(gòu)能加速系統(tǒng)的響應(yīng)時(shí)間，響應(yīng)時(shí)間是動(dòng)力學(xué)曲線達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平一半時(shí)所需的時(shí)間；如圖9所示，非協(xié)調(diào)型的響應(yīng)時(shí)間遠(yuǎn)低于簡單調(diào)節(jié)的響應(yīng)時(shí)間；此結(jié)構(gòu)可以快速地達(dá)到最高速率。圖8中，產(chǎn)生C的同時(shí)產(chǎn)生延遲中的阻抑物B來降低C的量，從而達(dá)到預(yù)期的穩(wěn)態(tài)水平。在甲殼動(dòng)物免疫中，此類結(jié)構(gòu)可以使得反應(yīng)迅速進(jìn)行，提高免疫效率，同時(shí)產(chǎn)生的SOD又可以在極短的時(shí)間內(nèi)，使得過氧根離子的含量降低，防止其長時(shí)間高濃度存在對甲殼動(dòng)物機(jī)體造成傷害。信號敏感反映了甲殼動(dòng)物免疫反應(yīng)的及時(shí)性，即在極短的時(shí)間內(nèi)對有害物質(zhì)進(jìn)行清除的能力。

3.2.2反饋環(huán)

反饋型網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出了非線性系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)狀況，網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)具有多種穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)網(wǎng)絡(luò)從某種初始狀態(tài)開始運(yùn)動(dòng)，生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)收斂于某一種穩(wěn)定的平衡狀態(tài)[4]。甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)也一樣，具有免疫平衡狀態(tài)，并不斷處于動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定狀態(tài)。酚氧化酶原激活系統(tǒng)中，正是絲氨酸抑制劑的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，使得整個(gè)免疫系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

4總結(jié)

甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)錯(cuò)綜復(fù)雜，各免疫分支途徑之間相互協(xié)調(diào)合作，保證整個(gè)免疫系統(tǒng)的高效而穩(wěn)定。（1）將圖中免疫因子或免疫反應(yīng)抽象為節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間的連線表征了物質(zhì)之間的關(guān)系，構(gòu)建整個(gè)免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)圖。（2）分析了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)間的相關(guān)關(guān)系；并利用相關(guān)物

理數(shù)學(xué)模型，揭示了部分免疫因子對整個(gè)免疫系統(tǒng)的影響。（3）從系統(tǒng)的角度看待甲殼動(dòng)物免疫，對整個(gè)免疫系統(tǒng)的高效穩(wěn)定的免疫機(jī)制進(jìn)行了物理性原理描述，以期探索更加高效的免疫反應(yīng)機(jī)制。但是，對于整個(gè)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的研究尚缺乏，對于多節(jié)點(diǎn)及其之間的機(jī)制，尚待研究；對于整個(gè)系統(tǒng)缺乏一個(gè)動(dòng)態(tài)有效的免疫反應(yīng)狀態(tài)，需要進(jìn)一步探討；對于免疫增強(qiáng)劑，如免疫多糖和中草藥具體作用強(qiáng)弱關(guān)系，需進(jìn)一步確定。

參考文獻(xiàn)：

[1]

DENG B，WANG ZP，TAO WJ，et al.Effects of polysaccharides from mycelia of Cordyceps sinensis on growth performance，immunity and antioxidant indicators of the white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Aquaculture Nutrition.2014，21：173-179

[2] 陳昌福，陳萱，陳超然，等.水產(chǎn)甲殼動(dòng)物的免疫防御機(jī)能及其免疫預(yù)防研究進(jìn)展[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2003，22（2）：197-203

[3] 王孟孟，馬寨璞，郭林豪，等.甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系模型[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào).2017，37（3）：288-294

[4] U.阿隆.系統(tǒng)生物學(xué)導(dǎo)論—生物回路的設(shè)計(jì)原理[M].王翼飛，等譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010

[5] 鄒權(quán)，陳啟安，曾湘祥，等.系統(tǒng)生物學(xué)的網(wǎng)絡(luò)分析方法[M].西安：西安電子科技大學(xué)出版社，2015

[6] 左孝凌，李為鑑，劉永才.離散數(shù)學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2006

[7] 雷錦志.系統(tǒng)生物學(xué)+建模+分析+模擬[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2010